Was ist der Auslöser der Photorespiration und welche zellulären Kompartimente sind an dem Stoffwechselprozess beteiligt?
Auslöser:
hohe Sonneneinstrahlung
hoher O2 Gehalt
niedriger CO2 Gehalt
Zelluläre Kompartimente:
Chloroplasten: Vindung von O2 durch Rubisco: 2Phosphoglycolat entsteht
Peroxisome: Umwandlung in Glycin, dabei entsteht H2O2
Mitochondrien: Umwandlung in Serin: dabei entsthet Co2, Rücktransport und Bindung von CO2 an Rubisco in Chloroplasten
Die Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (Rubisco) führt den Carboxylierungsschritt des Calvin Cyclus durch. Als Substrat verwendet sie CO2 und Ribulose-1,5-bisphosphat. Da sie neben CO2 auch O2 als Substrat verwenden kann, kommt es je nach CO2 Konzentration zur Oxygenierung, wobei ein toxisches Intermediat, das 2-Phosphoglycerat, entsteht. 2PGA muss aufwendig im Rahmen der Photorespiration verstoffwechselt werden. Im Laufe der Evolution ist es nicht gelungen eine Rubisco zu entwickeln, die keine Oxygenasereaktion katalysiert. Allerdings wurden bei einigen Algen, Bakterien aber auch Landpflanzen CO2 Konzentrierungsmechanismen entwickelt, die das Problem der Photorespiration mindern. Bitte benennen sie mindestens zwei Verfahren zur CO2 Konzentrierung und beschreiben sie eines dieser Verfahren im Detail.
Algen/ Cyanobakterien: räumliche Trennung durch Stärkekompartiment/ Carboxysome
C4 Pflanzen: C4 Photosynthese: räumliche Trennung
Mesophyllzellen: CO2 (HCO3-) wird von PEP gebunden, da es eine höhere Affinität zu CO2 hat. Dadurch word PEP zu Oxalacetat carboxyliert dann zu Malat umgewandelt, welches dann in die Bündelscheidezellen wandert: Hier wird es zu PYruvat decarboxyliert, wodurch CO2 entsteht, welches von Rubisco genunde werden kann.
Wozu dient der cyclische e-Transport der Photosynthese? (mehrere Antworten können korrekt sein)
Welche Rolle spielen die SWEET Proteine beim Assimilattransport in Pflanzen?
Viele Krebszellen führen die aerobe Glykolyse (Warburg Effekt) aus. Hierbei wird Glukose zu Lactat und zwei Molekülen ATP verstoffwechselt. Gegenüber der normalen Atmung ist der ATP Gewinn sehr gering. Warum führen Krebszellen dennoch die aerobe Glykoyse durch.
Da sie durch den anaeroben Stoffwechsel mehr anabole Biosynthesewege ansteuern können. Diese benötigen sie um Substrate aufzubauen, die sie für die Proliferation und das Zellwachstum benötigen. Außerdem klauen sie bestimmte Substarte und Energie von anderen Zelllen und die Glykolyse läuft so viel schneller
mTOR ist ein zentraler Regulator des Zellwachstums. Welcher der folgenden Faktoren wirkt sich positiv auf die Aktivität von mTOR aus?
Welche Auswirkung hat der Verlust der Phosphatase PTEN Aktivität auf die HIF1 Expression? Bitte begründen sie ihre Aussage.
Der Verlust der PTEN Aktivität bedeutet die dephosphorylierung von PIP3, welches den Pi3k-Akt-Weg aktiviert. Das bedeutet, dass Faktoren wie mTOR durch Akt überaktiviert werden und dadurch HIF-1 exprimiert wird
Eine Reihe Tumorzellen weisen eine erhöhte Expression des Enzyms Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) auf. Welche Reaktion katalysiert das Enzym und warum entkommen IDO exprimierende Tumorzellen der Immunabwehr?
IDO: Oxidation von L-Trytophan
Schwächung Immunabwehr
Treg werden geschwächt
Welche Rolle spielt die Prolylhydroxylase (PHD) bei der sauerstoffabhängigen Regulation der HIF1-vermittelten Genregulation?
p53 ist ein zentraler Stoffwechselregulator. Unter anderem reguliert p53 die Aktivität der Hexokinase, der Glucose-6P-DH und der Pyruvat-DH Kinase 2. In welcher Weise reguliert p53 die genannten Enzyme (aktivierend/inaktivierend) und welche Konsequenzen hat die jeweilige Regulation für den Stoffwechsel?
Glucose-6P-DH wird gehemmt: So wird der Pentosephosphatweg und damit die anabolen Stoffwechselwege gehemmt.
Hexokinase wird gehemmt: weniger Glucose wird weiterverarbeitet und kann positiv auf den Zellstoffwechsel auswirken, Glykolyse wird etwas gedrosselt.
Pyruvat-DH: wird ebenfalls aktiviert, damit der Citronensäurezyklus gefördert wird und dadurch mehr Energie produziert wird
Worin unterscheidet sich die Pyruvat Kinase Isoform M2 von der Isoform M1 und welche Konsequenzen hat dies für den Stoffwechsel?
M1: tetramer, also normale Funktion: GP3 wird zu GP2 umgewandelt -> sichere stabile ATP Produktion
M2 Dimer, phophoryliert: alternatices Splicing bewirkt die Expression von Exon 10 statt 9 -> positive Auswirkung auf den anabolen Stoffwechselweg: Wirkung als Transkriptionsfaktor im Zellkern: Metastasenbildung, Lactatbildung, Block des PPP
Wie beeinflusst die PKM2 die Aktivität von PGAM1 und was ist die Folge?
moonlight Funktion
fungiert als Histidinkinase und fördert dabei anabole Stoffwechselwege
Wie wirkt sich eine erhöhte Lactat Konzentration im tumor microenvironment auf die Imunantwort aus?
hohe Lactatkonzentration in der Umgebung blockiert bestimmte wichtige Immunabwehr-Stoffwechselwege in Immunzellen
Was sagt ein positiver ∆S-Wert über die Stabilität eines Proteins aus? (Übergang ungefaltetes Protein zu gefaltetem Protein; ∆S = S(folded) - S(unfolded))
Ein positiver gesamt S Wert bedeutet, dass sich das Protein begünstigt über die Entropie gefaltet hat. Es erhöht also die Stabilität des Proteins.
Warum sind natürliche Proteine nur marginal stabil? Welche Vorteile bieten marginal stabile Proteine?
Sie sind ein wenig instabiler als die günstigste Form, da Bindungspartner und Modifikationen zur Gesamtstabilität beitragen. Die gewonnene Flexibilität und geringere Festigkeit führt dazu, dass das Protein leichter zwischen Konformationen wechseln kann. Außerdem lassen sie sich schneller über die Ubiquitinierung abbauen und somit leichter regulieren.
Was sagt ein positiver ∆G-Wert (Übergang ungefaltetes Protein zu gefaltetem Protein; ∆G = G(folded) - G(unfolded)) über die Stabilität eines Proteins aus?
Ein positiver ∆G-Wert (∆G = G(folded) - G(unfolded)>0) bedeutet, dass der gefaltete Zustand eine höhere Energie besitzt als der ungefaltete. Unter diesen Bedingungen ist der Faltungsprozess nicht spontan, und das Gelcihgewicht liegt auf der Seite des ungefalteten Proteins. Das bedeutet, dass das Protein instabil ist und nur durch weitere Modifikationen aufrechterhalten werden kann.
Proteine sind nur marginal thermodynamisch stabil: ΔG (DeltaG) ist immer klein. Nennen Sie einen Grund warum diese Eigenschaft für natürliche Proteine vorteilhaft ist/sein kann.
Proteine können so leichter zwischen Konformationen wechseln. Durch die gewonnene Flexibilität kann es die katalytische Aktivität verbessern und an die Bindungspartner und Umwelt anpassen.
In welchem Zusammenhang stehen die kleinen negativen ∆G-Werte, welche üblicherweise bei natürlichen Proteinen beobachtet werden, zur Schwierigkeit Proteine zu designen?
Die kleinen negativen ΔG-Werte zeigen, dass natürliche Proteine nur knapp stabil sind. Schon kleine Änderungen der Aminosäuresequenz können die Stabilität stark beeinflussen. Deshalb ist Proteindesign schwierig, da die richtige Balance der Wechselwirkungen genau getroffen werden muss.
Proteine sind nur marginal thermodynamisch stabil: ΔG (DeltaG) ist immer klein. Nennen Sie einen Grund warum diese Eigenschaft ungünstig für das Proteindesign ist.
nur leichte Umgebungsveränderungen wie z.B. pH, Temperatur oder Mutationen können das Protein zum denaturieren zwingen oder zu einer Fehlfaltung
Strukturen sind stärker konserviert als Sequenzen. Bitte erklären Sie, welche Möglichkeiten dies für die natürliche Evolution von Proteinen bringt.
Es können neue Proteinfunktionen entstehen, die Gesamtstruktur bleibt dabei intakt, außerdem können neue Bindungspartner entstehen. Es kann auch das Genom durch Mutationen vergrößert werden.
Strukturen sind stärker konserviert als Sequenzen. Bitte erklären Sie, welche Möglichkeiten dies für die Entwicklung von Inhibitoren gegen das neue SARS-CoV-2 Virus bringt.
Es können in kürzerer Zeit die Struktur identifiziert werden sequenziert werden kann, somit können Impfstoffe schneller entwickelt werden. Weitere Coronavarianten können schneller erkannt werden durch die Repositionierung der Moleküle.
Strukturen sind stärker konserviert als Sequenzen. Bitte erklären Sie welche Möglichkeiten dies für das Proteindesign eröffnet.
Faltungen können vorhergesagt werden, die bekannten Strukturen dienen als Template. Neue Bindungseigenschaften lassen sich einführen oder neuartige Proteine aufbauen. Außerdem kann die Robustheit vergrößert werden.
Was versteht man unter DNA Origami und auf welcher grundlegenden Eigenschaft von DNA/RNA basiert der Erfolg des DNA Origamis?
Das gezielte Falten eines langen einzelsträngigen DNA-Moleküls (scaffold-strand) mit Hilfe von einzelnen Oligosmoleküle (staple-strands). Die grundlegende Eigenschaft ist die spezifische Basenpaarung. Sie hybridisieren sequenzabschnitte und treiben die Formgebung an
Was beinhaltete der Paracelsius-Challenge?
Blindtest für die DNA-Nanotechnologie: Definition vorgegebener Zielstrukturen, Automatisiertes Design, Mischung aus Scaffold und Staples, Qualittsbewertung über Ausbeute und Form. So können Designsoftware verglichen werden und Standardprotokolle etabliert werden.
Wieso bezeichnet man DNA-Origami als knowledge-based design?
Die Strategie beruht auf biophysikalischen Kenntnissen: Die Prinzipien der Basenpaarung werden mit Faltmustern als Template genutzt. Das erlaubt präzise Vorhersagen.
Was wäre denn ein nicht-knowledge-based design?
ohne Rückgriff auf Strukturdaten oder Faltungsregeln, bzw Paarungsregeln
Wofür erhielten Frances Arnold, Gregory Winter und George Smith 2018 den Nobelpreis für Chemie (einfach nur ‚Proteindesign‘ als Antwort genügt nicht)?
Frances Arnold: gerichtete Evolution von Enzymen
George Smith: Entwicklung des Phagendisplays
Gregory Winter: Entwicklung/Anwendung des Phagendisplays zur Selektion und Optimierung von Antikörpern
Nennen Sie zwei Eigenschaften durch die sich Hefedisplay vom Phagendisplay unterscheiden.
Hefedisplay verwendet eukaryotische Hefezellen, wodurch eine komplexe Proteinfaltung und Glykosylierung möglich sind. Phagendisplay basiert auf Bakteriophagen in prokaryotischen Wirten. Außerdem ist die Bibliotheksgröße beim Phagendisplay meist größer als beim Hefedisplay, sodass mehr Varianten gescreent werden können.
Erläutern Sie kurz das Grundprinzip wie man durch Verwendung von Displaytechniken ‚monoklonale‘ Antikörper gegen beliebige Antigene erzeugen kann.
aus einer Bcell cDNA werden V Regionen zusammengesetzt, die variablen Ketten in Phagen oder Hefevektoren kloniert. Das Plasmid wird in Hefe oder Phagen dann exprimiert und Antikörperfragmente sezerniert. Das Antigen wird immobilisiert und Amplifiziert. Nach selektion der Klone werden die Plasmide sequenziert und in vektoren für die vollwertigen Antikörper subkloniert
Was versteht man im Kontext vom Display von Antikörpern unter 1) natürlichen und 2) synthetischen Bibliotheken?
natürlich: ausgehend von B zellen, nach somantisher Rekombination
synthetisch: ausgehend von Strukturanalyse und weiter DNA synthese, synthetische CDR repartoires
Displaytechniken werden auch oft als molecular evolution-Techniken bezeichnet. Welcher Zusammenhang besteht zwischen Displaytechniken und natürlicher Evolution? Wie unterscheiden sich diese?.
Displaytechniken basieren auf den gleichen Grundprinzipien wie die natürliche Evolution: Warlatior, Selektion und Amplifikation. Durch gezielte Mutagenese erzeugt man eine Bibliothek vielfältiger Molekülvarianten. Anschließend werden nur die besten Binder - also die „fittesten” Moleküle - ausgewählt und amplifiziert. Mehrere Runden dieses Kreislaufs führen zu optimierten Antikörpern oder Peptiden, in der natürlichen Evolution sind es die zufälligen Mutaionen, welche in Displaytechniken von gerichteter Mutagenese übernommen werden. Bindungsaffinitäten ersetzen natürliche selektion und die Vermehrung in Phagen oder Hefen simuliert die Reproduktion in Organismen. Displaytechniken benötogen ca Stunden bis Wochen, währen die Evolution bis zu Millionen Jahre braucht. Allerdings biten Displaytechniken nur eine begrenzte Anzahl an Bibliotheksgrößen
Was versteht man unter directed evolution?
Directed Evolution ist ein laborbasiertes Verfahren zur gezielten Optimierung von Biomolekülen. Dabei werden in mehreren Zyklen künstlich erzeugte Varianten eines Gens oder Proteins erzeugt und anhand definierter Selektionskriterien die besten Kandidaten identifiziert und verstärkt, es wird zunächst eine Vielfalt erzeugt und dann selektioniert
Bibliothekengrösse und directed evolution: Diskutieren Sie wie viele Aminosäurenpositionen Sie randomisieren können in Bibliotheken mit einer Variantenvielfalt von 10^8 (zehn hoch acht)
jede randomisierte Aminosäureposition kann 20 Varianten erzeugen (es gibt 20 natürliche Aminosäuren)) somit kann man 6 Positionen randomisieren, da 7 schon 10^8 übersteigt
Welches zentrale Problem gilt es zu lösen, bei der Anwendung von directed evolution Techniken beim Designen von Enzymen?
das heraussuchen von funktionalen Varianten, somit müssen screening Test gut eingestellt sein und die richtigen Selektionskriterien haben, damit die funktionalen Varianten selektioniert werden
aus einer Bcell cDNA werden V Regionen zusammengesettzt, die variablen Ketten in Phagen oder Hefevektoren kloniert. Das Plasmid wird in Hefe oder Phagen dann exprimiert und Antikörperfragmente sezermiert. Das Antigen wird immobilisiert und Amplifiziert. Nach selektion der Klone werden die Plasmide sequenziert und in vektoren für die vollwertigen Antikörper subkloniert
Wie würden Sie das Display durchführen, um Antikörper zu selektionieren, die das Potenzial besitzen könnten, die Infektion von Wirtszellen durch das SARS-CoV-2 Virus zu verhindern (neutralisierende Antikörper)?
Neutralisierende Antikörper werden durch Display‑Panning gegen die RBD des Spike‑Proteins selektiert, kombiniert mit ACE2‑kompetitiver Selektion, sodass nur Antikörper angereichert werden, die die Spike‑ACE2‑Interaktion blockieren.
Wie funktioniert ein Phagendisplay
Die Ziel DNA wird in die Phage gebracht und Unterschiedliche Möglichkeiten der Kopienzahl des proteins an der Oberfläche werden variiert, so werden Peptide oder Proteine auf der Phagenoberfläche präsentiert. Die DNA ist im inneren der Phage. Somit werden Genotyp und Phenotyp miteinander gekoppelt. Phagen die binden werden amplifiziert. Ungebundene Phagen werden weggewaschen. Zum schluss wird die DNA der bindenden Phagen sequenziert
Wie funktioniert Hefedisplay?
das Fusionsprotein wird mit Aga2p auf der Oberfläche der Hefe präsentiert. Dabei variieren die Varianten stark. Nicht bindende Hefen werden weggewaschen und bindende werden mit Hilfe von FACS sortiert und sequenziert. Ähnlich wie beim Phagendisplay sind Genotyp und Phenotyp gekoppelt
Wie können diese Techniken für die Entwicklung monoklonaler Antikörper verwendet werden?
Skizzieren Sie kurz, wie man mittels computational design Enzyme entwickeln kann. Welche Bedeutung kommt hierbei dem Übergangszustand zu?
Übergangszustand berechnen — Der TS der gewünschten Reaktion wird quantenchemisch modelliert.
TS‑Analog als „Ligand“ nutzen — Man entwirft ein Molekül/Modell, das den TS repräsentiert.
Aktives Zentrum designen — Algorithmen platzieren Aminosäuren so, dass sie den TS optimal stabilisieren.
Protein‑Gerüst auswählen — Das entworfene aktive Zentrum wird in passende Proteingerüste eingebaut.
In‑silico‑Mutationen testen — Mutationen werden simuliert, um TS‑Bindung und Stabilität zu verbessern.
Experimentell prüfen — Beste Designs werden exprimiert und getestet.
Bedeutung des Übergangszustands: Der Übergangszustand ist das zentrale Designziel, weil Enzyme Reaktionen beschleunigen, indem sie den TS stabilisieren. Deshalb wird beim Design gezielt ein aktives Zentrum konstruiert, das den TS besonders gut bindet.
Skizzieren Sie kurz wie man in vier Schritten ein Enzym mittels Computer-basiertem Design entwickeln kann/könnte.
Die Zielreaktion wird verstanden und der Übergangszustand (TS) rechnerisch modelliert.
TS‑Geometrie und Ladungsverteilung quantenchemisch berechnen
TS dient als „Ligand“, den das Enzym später stabilisieren soll
Aminosäuren werden so angeordnet, dass sie den TS optimal stabilisieren.
Katalytische Gruppen positionieren
Elektrostatische und geometrische Komplementarität zum TS erzeugen
Das entworfene aktive Zentrum wird in stabile Proteingerüste eingebaut.
Verschiedene Scaffolds testen
Nur strukturell kompatible Gerüste weiterverwenden
Mutationen werden simuliert und die besten Designs im Labor validiert.
Mutationen zur TS‑Bindung und Stabilität berechnen
Varianten exprimieren und Aktivität messen
Welche Möglichkeiten gibt es einen Embryo zu manipulieren? Welche Vor und Nachteile gibt es? Was eignet sich für welche Fragestellung am ehesten?
mRNA: kurzzeitige Überexpression einer injizierten mRNA, kurze Auswirkung da RNA instabil, keine transgene Linie, kleiner Eingriff, Vorteil ist die kurze Expression, was bedeutet, dass während der Entwicklung nur für kurze Zeit diese mRNA exprimiert wird und damit die Grundlage für Methoden wie CrisprCas9/ ZNF oder TLN bietet. Bei allen drei Methoden werden die Bestandteile als mRNA in den Embryo injiziert, somit können die Bestandteile exprimiert werden und ihrer Funktion nachgehen und so genetische Veränderungen bewirken, sie können so auch in die Keimbahn eingeführt werden und transgene Linien hergestellt werden. Allerdings sind nur 25% homozygot transgen.
DNA: Einbringen eines DNA Stückes (Gens), Expression dieses Gens in einer transgenen Linie gewünscht, etwas aufwändiger, da erst in der F1 tansgen, dauerhafte Auswirkung auf den gesamten Organismus während der gesamten Entwicklung durch das Gen, dauert sehr lang. Als Beispiel für das injizieren einer DNA dient das GFP Gen mit bestimmten Modifikationen kann dies eine analytische Funktion über bestimmte Expression oder das Verhalten eines Zielgens in einem Modellorganismus haben. Im Falle eines knockins mit crisprcas9 liegt die Injektion einer DNA mit anderen Faktoren für eine knockin Mutante in ein Embryo zu Grunde.
Morpholino: kurzzeitiger knockdown eines Gens, Oligo legt sich auf RNA, Veränderung der Translation über Block der Translation, Inhibition der miRNA maturation oder alternatives splicing, instabil daher nur kurze Auswirkung, keine transgene Linie, kleiner Eingriff, wenig aufwendig. Morpholino werden im Kontext des knockdowns verwendet. So benötigt man zunächst keinen aufwendig hergestellten knockout um einen gewissen ``Trend`` der Auswirkung des ``Verlusts`` eines Gens zu erkennen
Welche Methoden gibt es zur Genom-modifikation bzw um transgene Tiere zu erzeugen? Welche Vor und Nachteile bringen die einzelnen Methoden? Welche Methode eignet sich für welche Situation am besten?
Zincfinger: zwei Moleküle die über Tripletts an beide Stränge der DNA binden, somit kann die Endonuklease Folk1 Dimerisieren und es wird ein Doppelstrangbruch durchgeführt, spezifität hoch, unzugängliche Gene können targetiert werden, sehr aufwendig, transgene Linie in F1, langfristiger Effekt des Verlusts eines Zielgens auf den gesamten Organismus während er gesamten Entwicklung, geringe flexibilität
Talen: zwei Moleküle binden über Einzelnukleotide an beide Stränge der DNA, somit kann die Endonuklease Folk1 dimerisieren und ein Doppelstrangbruch kann durchgeführt werden, spezifität höher als bei Zincfinger durch Einzelnukleotide, unzugängliche Gene können targetiert werden, sehr aufwendig, transgene Linie in F1, langfristiger Effekt des Verlusts eines Zielgens auf den gesamten Organismus während er gesamten Entwicklung, geringe flexibilität aber etwas spezifischer für ein Zielgen als Zincfinger
CrisprCAs9: Cas9 Protein bindet an guide RNA welche aus Einzelnukleotiden besteht, Im Zellkern bindet dann die guide RNA an der DNA, Cas9 führt einen Doppelstrangbruch durch, im Gegensatz zu Zincfinger/Talen unspezifisch, da Erkennungssequenz sehr kurz und nur auf einem Strang der DNA, sehr einfach von der Handhabung her, transgene Linie in F1, unkompliziert und es können auch Gene eingebracht werden, flexibel, schnell und unkompliziert aber unspezifisch
Aufbauend auf diesen Methoden gibt es noch das creloxP System, welche die gerade genannten Methoden vorraussetzt. So kann creloxP durch vorhergehende transgene Linie eine weitere erstellen, indem es durch sein rekombinasebasiertes system das Zielgen mit lox Sites kennzeichnet (floxed), die Zellspezifische Crerekombinase dieses Gen raus schneidet, Transgene Linie in F1, kann Zellspezifisch angewendet werden, aufwendig, gut geeeignet für ortspezifische Untersuchungen, benötigt zwei Transgene Linie im Voraus, sehr aufwendig sber effektiv um Zellspezifisch zu arbeiten
Stelle Morpholino und Crispr/Cas bzw Morpholino und Cre/loxP gegenüber
Morpholino: kurzzeitiger knockdown eines Gens, Oligo legt sich auf RNA, Veränderung der Translation über Blockder Translation, Inhibition der miRNA maturation oder alternatives splicing, instabil daher nur kurze Auswirkung, keine transgene Linie, kleiner Eingriff, wenig aufwendig. Morpholino werden im Kontext des knockdowns verwendet. So benötigt man zunächst keinen aufwendig hergestellten knockout um einen gewissen ``Trend`` der Auswirkung des ``Verlusts`` eines Gens zu erkennen CrisprCAs9: Cas9 Protein bindet an guide RNA welche aus Einzelnukleotiden besteht, Im Zellkern bindet dann die guide RNA an der DNA, Cas9 führt einen Doppelstrangbruch durch, im Gegensatz zu Zincfinger/Talen unspezifisch, da Erkennungssequenz sehr kurz und nur auf einem Strang der DNA, sehr einfach von der Handhabung her, transgene Linie in F1, unkompliziert und es können auch Gene eingebracht werden, flexibel, schnell und unkompliziert aber unspezifisch
-> Morpholino verändert nur kurzzeitig die Expressionslevel des Zielgens, indem es die Translation verändert, somit muss nicht in das Genom eingegriffen werden. Die Methode ist unkompliziert, schnell und zeigt, wie sich der knockdown auf den Organismus auswirkt. Crisprcas9 stellt eine Transgene Linie her, indem es in das Genom des Individuums eindringt, somit kann eine transgene Linie hergestellt werden und die Auswirkung des Genverlusts oder auch den Gengewinns kann evaluiert werden. Die Methode ist zwar nicht so schnell und es dauert seine Zeit bis in F1 die transgenen Tiere hergestellt worden sind, es bringt aber einen größeren Einblick in die Auswirkung
Morpholino/ CreloxP: Morpholino kann ein knockdown eines Zielgens erreichen, creloxP durch vorhergehende transgene Linie eine weitere erstellen, indem es durch sein rekombinasebasiertes system das Zielgen mit lox Sites kennzeichnet (floxed), die Zellspezifische Crerekombinase dieses Gen raus schneidet, Transgene Linie in F1, kann Zellspezifisch angewendet werden, aufwendig, gut geeeignet für ortspezifische Untersuchungen, benötigt zwei Transgene Linie im Voraus, sehr aufwendig aber effektiv um Zellspezifisch zu arbeiten. Morpholino ist einfacher, schneller und unkomplizierter als creloxP kann aber in der Analyse nicht so vielseitig eingesetzt werden. Durch den knockdown kann man nur gewisse Trends der Auswirkung des Verlusts eines Gens erkennen, CreloxP kann zusätzlich zu der Auswirkung auf den gesamten Organismus auch noch örtlich kontrolliert werden und somit die Auswirkung auch örtlich beschränken.
Wie weise ich die RNA-Expression in einem Embryo nach?
In situ Hybridisierung, FISH
Was sind vor und Nachteile eines knockdowns oder knockouts? Welche Methoden würde man benutzen?
knockdown: Morpholino: kuzfristige Repression der Tanslation einer RNA, kleiner Eingriff, wenig aufwendig und man braucht keine transgene Linie, kurzfristige Auswirkung auf den Organismus durch die verminderte Translation bzw Block der Translation und damit der Verlust der Funktion, spezifisch für ein Gen. Morpholino verändert nur kurzzeitig die Expressionslevel des Zielgens, indem es die Translation verändert, somit muss nicht in das Genom eingegriffen werden. Die Methode ist unkompliziert, schnell und zeigt, wie sich der knockdown auf den Organismus auswirkt.
knockout: viele verschiedene Möglichkeiten, oben beschrieben, transgene Linie nötig, aber Auswirkung auf das Gesamte Individuum, transgene Linie ermöglicht eine ganze Linie ohne dieses Gens, auch Auswirkung im späteren Zeitpunkt möglich, ortspezififtät möglich. Die Methoden sind zwar nicht so schnell und es dauert seine Zeit bis in F1 die transgenen Tiere hergestellt worden sind, es bringt aber einen größeren Einblick in die Auswirkung auf den gesamten Organismus. Zusätzlich kann man in einer Mutante weitere Methoden anwenden, die das Zielgen betreffen.
Wie prüfe ich ob ein Signal Zellautonom ist oder nicht? Was sagt welches outcome aus?
Transplantationsexperimente:
WT> Mutante: rescue? JA: Zellautonom/ NEIN: nicht Zellautonom
auch für verschiedene Regionen: bsp rescue in Endoderm aber nicht im Mesoderm: Zellautonom dort
Mutante> WT: rescue: JA: nicht zellautonom/ NEIN: Zellautonom
Das Ziel ist es, die Expression von ela in Notochordmutanten zu untersuchen, um zu prüfen ob ela ausreichend ist für die Zellwanderung, wie stellt man das an?
zunächst nimmt man eine notochordmutante, welche von natur aus eigentlich kein ela produziert. Anschließend kann man ela in Kombination mit dem im notochord exprimierten shh Gen einbringen. SHH ist ein SIgnalfaktor welcher beim Fisch die Expression von ela induziert. Somit wird ela in den Notochordmutanten trotzdem exprimiert. Wenn die Zellen nun zu der Mittellinie wandern, ist ela ausreichend für die Wanderung.
Wie gehe ich vor, wenn ich nach einem bestimmten Gen suche, welches einen bestimmten Phänotypen hervorruft, ohne dass ich dieses Zielgen kenne?
forward genetics: Fische mit mutagenen behandeln, bis ein gewünschter Phänotyp auftaucht, diesen dann sequenzieren, somit kennt man das Gen welches mit dem phänotypen in Verbindung gebracht werden kann.
Wie prüfe ich in welchem Gewebe ein betsimmtes Zielgen aktiv ist?
In diesem Fall wnt2bb In situ hybridisierung, GFP oder Transplantationsexperimente
Wie prüfe ich ob ein weiteres Gen den Verlust eines anderen Gens kompensiert?
“Wie prüfe ich, ob wnt2 den Verlust der Aktivität des wnt2bb Gens kompensiert?”
Morpholino: Eine wnt2bb Mutatnte, welche durch ein knockout hergestellt worden ist, wird mit einem wnt2 Morpholino behandelt. Morpholino ist ein Oligo, welches sich auf die mRNA setzt und somit enweder die Translation blockiert, ein alternatives splicing bewirkt oder die miRNA inhibiert. Dadurch, dass so das Genprodukt in niedrigerer Konzentration vorliegt und somit die Funktion eingeschränkt ist, kann evaluiert werden ob es durch wnt2 einen rescue der Leber gibt.
Heatshock: heatshockpromotor bewirkt die Aufrechterhaltung der Stabilität eines Proteins bei höheren Temperaturen. Wenn ein Gen daran gekoppelt ist, kann durch einen Hitzeschock die Expression dieses Gens gewährleistet werden. Wenn also ein hs promotor vor wnt2bb im WT geschalten ist, wird durch einen Hitzeschock wnt2 exprimiert aber wnt2bb bleibt unexprimiert. So kann evaluiert werden ob sich dadurch eine Leber bildet.
Wie prüfe ich wann die wnt-Siganltransduktion während der Gehirnangiogenese aktiv ist? Welche Möglichkeiten gibt es?
Bac: Axingen mit Venus-Pest ersetzen: Das Axingen ist zum einen ein Targetgen von TCF, welcher der Promotor bei der wnt SIgnalransduktion ist. ßCatenin bindet an TCF wenn wnt an frizzled bindet und ßcatenin nicht mehr durch den destructioncomplex stabilisiert und ubiquitiniert wird. Axin ist aber auch bestandteil des destructioncomplexes und hat eine negative feedbackfunktion bei übermäßger wnt Signaltransduktion. Wenn man nun das Axingen mit Venus-PEST ersetzt, kann in Echtzeit die Signaltransduktion nachgewiesen werden. Dabei ist Venus ist ein Reportegen und fluoresziert somit bei ßcatenin Bindung an TCF und hat somit eine Reporterfunktion bei wnt Signaltransduktion. PEST hat die Aufgabe die Halbwertszeit des Signals zu verkürzen, da es ein destabalizing Effekt hat. Das Ganze kann so in ein Zielorganismus gebracht werden, um während der Embryogenese die wnt SIgnaltransuktion nachzuweisen. Wenn man Venus-PEST nun mit einer gefloxten Stop-Kasette kombiniert, kann man Zellspezifisch die wnt Signaltransuktion mit dem creloxP System in Endothelzellen bsp nachweisen.
weiterer Nachweis: TCF binding sites vervielfachen ermöglicht die Überexpression der targetgene die unter dem TCF Promotor exprimiert werden. Eines davon ist GFP, welches über DNA eingefügt wird. Bei wnt Bindung an frizzled wird ßcatenin vom destructioncomplex gelöst und bindet an TCF, da hier mehr TCF vorhanden ist, kann auch mehr ßcatenin binden und somit die überexpression von GFP starten.Somit kann man bei der aktiven wnt Signaltransduktion ein fluoreszierendes Signal erhalten und somit die Aktivität der Signaltransuktion nachweisen. Wenn man davor eine Stopp-Kasette mit lox sites flankiert und einbaut, kann eine Zellspezifische cre die Stop kasette in Endothelzellen ausschneiden und so kann ortsspezifisch/ Zellspezifisch die wnt Signaltransduktion nachgewiesen werden.
Inhibition: Pharmakologisch: IWR stabilisiert den destruction-komplex, ßcatenin wird weiterhin ubiquitiniert auch bei der Bindung von wnt Signaltransduktion die targetgene werden nicht exprimiert. Wenn man so an verschiedenen Zeitpunkten der Embryogenese IWR zugibt, kann man sehen, wann die wnt Signaltransuktion wichtig für die Entwicklung ist oder wann nicht, so kann man erkennen, wan die Signaltransuktion aktiv ist.
genetisch: Der heatshockpromotor ermöglicht die zeitliche Kontrolle der Expression von targetgenen, in dem Fall das TCF Gen. Danach wird eine mit lox sites flankierte stop kasette und anschließend ein dominant negativer TCF mit GFP nachgeschalten. Durch den dnTCF wird der WT verdrängt und so bindet nur dieser Typ TCF an der DNA ohne ßcatenin zu binden, so wird die Signaltransduktion blockiert. Die zellspezifische crerekombinase ermöglicht das Ausschneiden der stopkasette in bestimmten Zellen und kann so örtlich kontrollieren wo dieser dnTCF exprimiert wird, dabei wird GFP an den dnTCF gekoppelt und so erhält man ein fluoreszenzsignal. Über den Hitzeschock kann man zeitlich kontrollieren wann die wnt Signaltransduktion so blockiert werden soll.
Was ist der Vorteil eines dominant negativen Approaches?
verdrängt WT Allele, weshalb keine homozygote gebraucht wird, Signaltransduktion wird blockiert ohne die vorherigen Funktionen einzuschränken
Wnt ist für Blutgefäßentwicklung nötig, deshalb würden Experimente mit Knockouts oder Wnt-Signalweg ausschalten nicht funktionieren. 3 Experimente zum Testen vom Effekt von Wnt auf Blutgefäßentwicklung vorschlagen.
heatshockpromotor: eigentlich zum Schutz vor Fieber, somit wird die stabilität der Proteine die nachgeschalten sind aufrechterhalten, somit kann man bei hs Promotor vor wnt zeitlich kontrollieren, wann dieses Gen angeschalten ist. Der heatshockpromotor ermöglicht somit die zeitliche Kontrolle der Expression von Targetgenen. Fehlbildungen zeigen den Effekt von wnt zu bestimmten Zeitpunkten
Morpholino: Ein Oligo, das die Translation kurzzeitig blockiert und somit die Auswirkung des Verlust des Zielgens evaluiert werden kann. Fehlbildungen zeigen den Effekt von wnt zu besitmmten Zeitpunkten. Aber nur kurzzeitiger Block möglich.
Transiente Überexpression: Plasmid, welches ein bestimmtes Gen trägt oder mRNA die ein bestimmtes Protein wird, somit kann eine Überexpression eine Aussage darüber treffen, wie das Gen den Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt beeinflusst
Welche Möglichkeiten gibt es ein Gen zeitlich und oder örtlich zu kontrollieren?
Gal4/UAS: Gal4: Transkriptionsfaktor der an UAS Promotor bindet, örtliche Kontrolle über die Platzierung des Gal4/UAS. So wird der Gal4-Treiber an Zellspezifische Promotoren gekoppelt, welche die Expression in nur diesen Zellen ermöglichen und damit örtlich spezifsch wirken. Zeitliche Kontrolle funktioniert nur mit bestimmten weiteren Faktoren, wie zum Beispiel Hormone oder mit dem temperatursensitiven Gal4 Treiber.
creloxP und stopkasette: Zielgen mit lox Sites gekennzeichnet (floxed), Zellspezifische Cre schneidet dieses Gen raus, Transgene Linie in F1, kann Zellspezifisch angewendet werden, aufwendig, gut geeeignet für ortspezifische Untersuchungen, benötigt zwei Transgene Linie im Voraus, sehr aufwendig aber effektiv um Zellspezifisch zu arbeiten mit einer Zellspezifischen cre kann eingebundene Stopkasette ausgebaut werden und das nachgehende Gen kann zellspezifisch exprimiert werden In Kombination mit einem
heatshockpromotor: eigentlich zum Schutz vor Fieber, somit wird die stabilität der Proteine die nachgeschalten sind aufrechterhalten, somit kann man zeitlich kontrollieren, wann dieses Gen angeschalten ist. Der heatshockpromotor ermöglicht somit die zeitliche Kontrolle der Expression von Targetgenen. Die örtliche Kontrolle kann hier nur durch bestimmte Faktoren
Was ist der Vorteil von Gal4/UAS gegenüber heatshockpromotor?
Gal4/UAS: kontrollierte Gewebsspezifische Expression über längere Zeit, örtlich sehr spezifisch, wenn Gal4 Treiber unter Kontrolle von Zellspezifischen Promotoren ist, auch eine zeitliche Kontrolle ist möglich. Somit können zeitliche und örtliche spezifität kombiniert werden. heatshockpromotor: zeitlich kontrollierte Expression im Organismus, kurzfristige Expression, nur zeitliche Kontrolle möglich, örtliche Kontrolle nur in Kombination mit andern Faktoren
Wie funktioniert der negative feedback von Axin-2?
Axin-2 ist ein bestandteil des destructioncomplexes für ßcatenin, welches dies ubiquitiniert und abbaut, wenn wnt bindet, wird der destruction.complex instabil und ßcatenin bindet an TCF wodurch bestimmte proliferative und Wachstumsfördernde Gene exprimiert werden. Axin-2 ist aber auch eines davon, wenn zu viel Axin-2 exprimiert wird, stoppt die wnt Signaltransduktion, damit keine Wachstumsfaktoren aus dem Ruder laufen
Welche Komponenten gibt es beim Notch Signalweg?
Rezeptor, Liganden, Proteasen, Co Aktivatoren, Target Gene Rezeptoren und Liganden sind in der Membran verankert und binden aneinander. Dadurch wird der Ligand durch Exozytose nach oben gezogen, was bewirkt, dass ein Modul des Rezeptors abgespalten wird und bestimmte Transkriptionsfaktoren aktiviert. Rezeptor und Ligand sind beide in derselben Memran so hat jede Zelle Ligand und Rezeptor und kann entsprechend reagieren.
Wie funktioniert der Eph/Ephrin-Signalweg?
Sendende um Empfangende Zelle bilden ein Rezeptor aus, welcher Dimerisiert, somit ist eine bidirektionale Kommunikation ermöglicht
Welche Probleme gibt es beim erzeugen transgener Tiere?
wegen der Tol2 Elemente kann das Gen gesilenced werden, da Tol2 Elemente virale Elemente sind und daher schnell gesilenced werden als Schutzfunktion des Organismus
Das Gen landet im heterochromatin und wird daher nicht exprimiert
Das Gen landet an einer falschen Stelle und wird somit nicht oder woanders exprimiert
Wie kann geprüft werden ob etwas transkritptionell/translationell reguliert wird?
transkriptionell: Veränderung über RNA-Sequencing nachweisbar
translationell: Wenn keine Veränderung furch RNA-Sequencing dann Veränderung auf Proteinebene?
->In situ Hybridisierung
Wie finde ich heraus was für einen Einfluss Eph/Ephrin3b auf die leberknospenbildung haben?
Morpholino: knockdown bewirkt ein vermindertes Genprodukt oder blockiert die Translation gänzlich: so kann man Eph und Ephrin3b mit Morpholino blockieren und den phänotypen analysieren
Gal4/UAS: dominant negativer Approach: somit wird der Eph/Ephrin-Signalweg blockiert, da über dominant negativ die Struktur geändert wird und somit die Dimerisierung nicht mehr funktioniert. Auch hier kann man den phänotypen dann auswerten. Gal4/UAS weil man das zellspezifisch in Hepatoblasten machen kann
Eine hohe Eph Expression im rechten LPM geht der asymmetrischen Hepatoblastenmigration voraus, dabei fungiert der Abfall der Konzentration als Richtungsweiser für das Wachstum. was ist jetzt das kritische Experiment die diese These bestärkt?
Wenn man die Konzentration von Eph umdreht, wandert es dann in die andere Richtung?
in den linken LPM eine mRNA rein, die Eph3b überexprimiert und in den rechten LPM ein Morpholino der die Expression runterreguliert
Welche Schlussfolgerung lässt sich aus der Beobachtung ziehen, dass aplnra/b-Morpholino-Angioblasten die Mittellinie nicht erreichen, während WT-Angioblasten normal zur Mittellinie migrieren?
Die Apelin-Rezeptoren Aplnra/b sind für die Migration von Angioblasten zur Mittellinie erforderlich.
Lässt sich aus dem Vergleich von aplnra/b-Morpholino- und WT-Donorzellen schließen, dass die Funktion der Apelin-Rezeptoren bei der Angioblastenmigration zellautonom ist? Begründe.
Ja. Nur die Zellen mit ausgeschalteten Apelin-Rezeptoren zeigen einen Migrationsdefekt, während WT-Zellen in derselben Umgebung normal migrieren. Dies spricht für eine zellautonome Funktion der Apelin-Rezeptoren.
Welcher experimentelle Ansatz liefert stärkere Evidenz für die Rolle der Apelin-Rezeptoren bei der Angioblastenmigration: Morpholino-Knockdown oder Cre-vermittelter Knockout?
Der Cre-vermittelte Knockout liefert stärkere Evidenz, da er spezifischer ist und weniger anfällig für Off-Target-Effekte als ein Morpholino-Knockdown.
Was ist der Unterschied zwischen einem benignen und malignen Tumor?
benigner Tumor: bleibt in senen Grenzen, hohe Zellteilungsrate, bleiben differenziert nicht invasiv, keine metastasenbildung, Zellproliferativ stark aktiv durch Dysregulation der Apoptosemechanismen
maligner Tumor: invasiv, metastasenbildung, besonders Apoptoseresistent, Immortalisiert, dringen in umliegendes Gewebe ein und verdrängen dieses, besonders unabhängig von normalen Wachstumsfaktoren, werden über Blut und Lymphkreislauf fortgeschwämmt
Welche Stadien der Metatstasierung durchlaufen maligne Tumorzellen?
Invasion ins lokale Gewebe, Blutkreilauf (Adhäsionsmechanismen gehen verloren)
Wanderung durch Blut und Lymphkreilauf
Anlagerung an Blutgefäßwände
Immigration ins Zielgewebe, Durchdringen der Wände
Suchen einer Stammzellnische (Dedifferenzierung nötig, Tumor muss sich anpassen)
Kolonialisierung im neues Zielgewebe
Welche molekularen Beispiele der Therapieansätze gibt es schon?
target: CD44 Gen, Exon 6 wird exprimiert, Metastasen tragen auf bestimmten Zellen das CD44 Protein
target: Sialyl-Transferasen: Durch sie gelangen Tumorzellen durch die BBB deshalb unterstützt diese targetierung beim Kampf gegen Gehirnmetastasen, wird sonst auf Zellen im Gehirn exprimiert
Warum gehen alle Tumorzellen von einer monoklonalen Zelle hervor?
X- Inaktivierung: In jeder Tumorzelle eines Verbandes ist das gleiche X Chromosom inaktiviert (normalerweise wird durch zufall eins der X Chromosomen der Frau inaktiviert weil die Menge eines X Chromosoms ausreichend ist)
Chromosomale Translokation: in jeder Tumorzelle eines Verbandes findet man die gleichen mutationen die das gesamte Chromosom betreffen (Translokation)
Wie kooperieren Onkogene miteinander, warum kann nicht eine Mutation ein Tumor auslösen?
wenn eine einzige Mutation einen Tumor auslösen würde, würden wir nicht lange überleben, denn täglich mutieren viele Gene, zusätzliche Faktoren sind Karzinogene, ROS oder UV-Strahlung... in unseren Zellen gibt es Reparaturmechanismen, welche allerdings oftmals ungenau sind wenn diese Reparaturmechanismen aber nicht mehr ausreichen und sich sukkzessiv mehrere Mutationen in einer Linie von Vorläuferzellen angesammelt haben, kann ein Tumor entstehen
Was beschreibt das Telomer-clock-Modell/ replikative Seneszenz?
Normalerweise wird mit jeder Zellteilung die Enden der Telomere kürzer, in der Embryonalentwicklung bzw. Stammzellen, sowie Tumorzellen ist daher die Telomerase aktiv, weche dazu führt, dass es ein Template gibt, womit die Zellen das gesamte Genom kopieren. In malignen Tumorzellen ist die Telomerase noch aktiv, das geschieht indem die Zelle dedifferenziert vorliegt. Das bedeutet das bei jeder Teilung die Telomerase aktiv ist und somit die Zelle über as Hayflick-limit hinauswächst, sie ist also immortalisiert. Zellen inaktivieren checkpointkontrollen (Telomerase aktiv) replikative Seneszenz ist das Umgehen und Überspringen des Hayflick-limits in Tumorzellen. So sind sie immortalisiert.
Was beschreibt das Stammzellkonzept von malignen Tumorzellen?
Dass in einem Tumorverband es nur bestimmte Zellen gibt, die besonders tumorigen sind und die Fähigkeit haben sich unendlich zu teilen (TPC) und daraus weitere Tumorzellen entstehen. Wenn man diese Zellen targetiert müsste der Tumor absterben. Sie haben oft eine verminderte Stoffwechselaktivität und haben eine gewisse Möglichkeit schäden in der DNA zu reparieren (self renewal) Häufig sind das Zellen die aus dem Stammzelstadium nie hinausgewachsen sind, damit Immortalisiert sind und daher ihre Mutationen mitnehmen. Sie sind für die Bildung der Metastasen verantwortlich.
Was ist der Unterschied zwischen Tumorinitiator und Tumorpromotor? Was hat der zeitliche Verlauf für einen Einfluss?
Tumorinitiator: initiative Mutationen die häuftig Onkogene oder Tumorsurpressorgene betreffen, die Abhängig von ihrem Abstand zueinander das Tumorrisiko erhöhen. Aus ihnen alleine kann ein Tumor entstehen. Sie schädigen die DNA
Tumorpromotor: Umwelteinflüsse wie zum Beispeil der Arbeitsplatz, chronische Entzündungen im Körper oder die Anhäufung von ROS an einer bestimmten Stelle, welche alle die Aktivität von pro-Proliferativen Faktoren unterstützen. Tumorpromotoren können alleine keinen Tumor auslösen. In Kombination bei zeitlich passendem Abstand erhöhen sie die Chance auf einen Tumor enorm. Keine DNA-Schädigung
Was ist der Unterschied zwischen Onkogenen und Tumorsupressorgenen?
Onkogene haben eine natürliche pro-proliferative Aktivität, welche bei Teilung oder Reparatur angeschaltet ist. Gerät durch ein mutiertes Allel jedoch die Balance ins kippen, haben Onkogene eine positive Wirkung auf Tumorzellen. (gain of function)
Tumorsupressorgene: Wirken hemmend auf das Zellwachstum nach Reparatur oder Teilung. Hier müssen beide Allele von einer Mutation betroffen sein, um sich positiv auf das Wachstum einer Tumorzelle auszuwirken (loss of function)
Wie kann cmyc als Transkriptionskativator und als Transkriptionsrepressor wirken?
Als Transkriptionsaktivator wirkt es zusammen mit max. Hier werden CDK4 exprimiert, welche pro-proliferatorische Eigenschaften besitzt, was Zellwachstum und Zellproliferation fördert.
Als Transkriptionsrepressor wirkt cmyc in Kombination mit miz-1. Hierbei wird die Transkription von Cyclinkinaseinhibitoren CKI reprimiert, welche die natürliche anti-Proliferatorische Eigenschaft unterbricht, was Zellwachstum und Zellproliferation fördert. So werden durch die Transkriptionsaktivierende und Transkriptionsrepressive duale Wirkung des Onkogens cmyc die Zellproliferation gesteuert.
-> auf mehreren Wegen zur Progression durch den Zellzyklus/ Eintritt in die S-Phase
Wie wird der Zellzyklus durch Rb und p53 reguliert? Wie kann es sein, dass phosphorylierung hier zwei Schicksale bestimmt?
Rb: Durch dephosphorylierung wird Rb aktiviert. Hier setzt es sich auf ein Transkriptionsfaktor, wodurch
p16 nicht transkribiert wird und damit wird CDK gehemmt. So wirkt es hemmend auf den Zellzyklus indem die Zelle nicht in das S stadium eintritt.
p53: ist selbst ein Transkriptionsfaktor und ist im phosphorylierten Status aktiv: dadurch wird p21 transkribiert und CDK gehemmt. der outcome ist der gleiche: es kommt zum arrest des Zellzyklus
Wie liegt Rb in ruhenden und proliferierenden Zellen vor und welche Wirkung hat es?
ruhende Zellen: Durch dephosphorylierung wird Rb aktiviert. Hier setzt es sich auf ein Transkriptionsfaktor, wodurch p16 nicht transkribiert wird und damit wird CDK gehemmt. So wirkt es hemmend auf den Zellzyklus indem die Zelle nicht in das S stadium eintritt.
proliferierende Zellen: Durch die phosphorylierung verliert Rb die Bindung an dem Transkriptionsfaktor und CDK wird nicht mehr gehemmt: So ist die Zelle proliferativ
Beschreiben Sie kurz 2 Wege über die p53 zur Apoptose führt.
Bei zu viel ROS, Hypoxie, DNA-Schäden,... führt p53 die Zelle in die Senescence oder Apoptose ->Apoptose: extrinsisch, intrinsisch. Extrinsisch über Rezeptoren auf der Oberfläche, intrinsisch über Faktoren im inneren der Zelle
Nervensystem beschriften
Gehirn beschriften
Charakterisierung dazu:
Großhirn
Kleinhirn
Rückenmark
Bulbus olfactorius
Großhirn: zwei Hälften, Sinneswahrnehmung, Bewegungsansteuerung
Kleinhirn: Bewegungskontrollzentrum Hirnstamm: Vitalfunktionen
Rückenmark: Weitereleitung
Bulbus olfactorius: Riechkolben
Hirnlappen zur Funktion zuordnen
Frontallappen: Ort des logischen Denkens, Persönlichkeit, planerischen Handelns
Parietallappen: räumliche Orientierung, Bewegungssteuerung
Temporallappen: akustische Informationsverarbeitung
Okzipitallappen: visuelle Informationsverarbeitung
Aus welchen 2 Schichten ist das Cortex aufgebaut?
Molekularschicht: ohne Somata, äußerste Schicht
Säuger: Neocortex: mindestens eine Schicht mit Pyramidenzellen die bis zur Molekularschicht reichen, er ist der jüngste Teil des Cortex. Im Menschen gibt es zusätzlicch noch Assoziationscortices, welche für Wünsche, Überzeugungen und Absichten stehen
Warum kann der Mensch sich ein verhältnismäßig großes Gehirn leisten?
Der Mensch hat durch das kochen der Nahrung einen viel größeren Nahrungsaufschluss erreichen können und somit auch eine größere Verfügung zu Energie um den Energiebedarf des Gehirns zu decken
Erkläre die Wanderung der Neuroblasten
Anfangs: Marginalzone und ventrikuläre Zone -> Fortsätze liegen in Richtung pialer Zone
-> Kern der Zelle wandert aus und landet in der Marginalzone um dort seine DNA zu verdoppeln
-> anschließend wandert sie wieder nach unten um sich zu teilen Vertikale Teilung: nach Teilung wieder Wanderung nach Marginalzone Horizontale Teilung: nach Teilung abwanderung der am weitest entfernten Zelle
-> Neuroblasten haften an Gliazellen und wandern dort entlang
-> nach horizontaler Teilung: Neuroblasten wandern entlang der Gliazellen
-> Schichten werden zeitlich verschoben aufgebaut.
-> Zunächst Subplatte, danach corticale Platte ( keine entscheidenden Neuronen )
-> Bildung der 6. Schicht, danach immer übereinander bis Schicht 1 die Marginalzone erreicht und diese dann verschwindet
-> Zwischenzone ist dann umhüllt von Lipiden: weiße Substanz
2 Chemikalien, die in die axonale Wegfindung beteiligt sind. Was machen sie?
Zellen in der ventralen Mittellinie des Rückenmarks: Netrin -> Chemoattraktives Signal
Zellen der Mittellinie: Slit exprimiert Robo ->Chemorepulsives Signal
Unterschied elektrische und chemische Synapse
elektrische: bidirektional, schneller, elektrisches Signal über Ionen, lange Strecken (Reflexe)
chemisch: unidirektional, langsamer, Neurotransmitter, Umwandlung von elektrisch in chemisch in elektrisches Signal
aktive Zone -> bevorzugte synaptische Transmission, präsynaptische Membran und dichtes Netzwerk aus Proteinen (CAZ)
Präsynapse -> Verbindung der Ca 2+ Abhängigen Exo/ Endozytose mit synaptischen Vesikeln der aktiven Zone
Postsynapse -> postsynaptische Dichte: Rezeptoren an die Neurotransmitter binden Umwandlung in ein elektrisches Signal
Jeweils 2 komponenten Prä/ Postsynapse
Präsynapse -> Verbindung der Ca 2+ Abhängigen Exo/ Endozytose mit synaptischen Vesikeln der aktiven Zone -> Vesikel und Proteine
Postsynapse -> Präsynapse -> Verbindung der Ca 2+ Abhängigen Exo/ Endozytose mit synaptischen Vesikeln der aktiven Zone -> Neurotransmitterezeptoren
Welche synaptischen Grundstrukturen gibt es?
Hippocampus Synapse: Vesikelfreisetzung bei AP gekoppelt an die Frequenz des Signals, phasische freisetzung
Sinneszellen Synapse: dauerhafte Freisetzung, Information gekoppelt an die Intensität und damit wird die Menge der Freisetzung kontrolliert, tonische Freisetzung
zwei Klassen von Membrandifferenzierungen?
symmetrische: wirkt inhibitorisch
asymmetrische: wirkt exzitatorisch, PSD stärker ausgeprägt
Schritte der synapsenbildung in ZNS
1. wachsendes Axon kommt in Kontakt mit Dendrit
-> Kontaktaufnahme über Zelladhäsionsproteine in Filopodien
2. Ausbildung des präsynaptischen Teils
-> Vesikel, Proteine die benötigt werden, aktive Zone synCAMPs triggern maturation
3. Ausbildung des postsynaptischen Teils
-> Ausbildung des PSD
In Bild beschriften und charakterisieren
Mitochondrien
Synaptische Vesikel
Welche Aussagen sind richtig?
Nenne Sie den wichtigsten excitatorischen und inhibitorischen Transmitter des ZNS
Glycin: inhibitorisch (Rückenmark)
Glutamat: exzitatorisch (Gehirn)
ACh: modulatorisch (Gehirn), excitatorisch (Muskel)
GABA: inhibitorisch (Gehirn)
Nor/Adrenalin: excitatorisch (Gehirn)
Wie verändern sie das Potential und welches Ion wirkt dabei
Glycin: Cl
Glutamat: Na, Ca
ACh: Na
GABA: Cl
Nor/Adrenalin: sc messenger
Unterschied Ionotrope und metabotrope Rezeptoren
Ionotrop: (Ach, GABA, Glycin) binden an eine Pentamerstruktur, (Glutamat) bindet an eine Heterodimerstruktur welche sich dann öffnet, Natriumkanäle oder Chloridkanäle öffnen sich -> Zelle wird positiver bzw negativer -> excitatorisch (depolarisation) bzw inhibitorisch (hyperpolarisation)
Metabotrop: benötigen einen second messenger, Wirkung über Kaliumkanäle, G Protein gekoppelte Rezeptoren öffnen Kalium-Ionenkanäle -> G Protein löst sich und induziert zelluläre Botenstoffe
Über welche Rezeptoren wirkt Glutamat
AMPA: Inonotrope Rezeptoren: schnelle Depolarisation durch öffnen der Na und K Kanäle, excitatorische Wirkung
NMDA: Metabotrope Rezeptoren: Erst bei mehrmaliger Bindung löst sich der Mg Block und Ca strömt ein, welches als sekundärer Botenstoff wirkt, welches wichtig für die synaptische Plastizität ist
Was beschreibt die synaptische Integration?
Ein Prozess der die synaptischen Potentiale an der Postsynapse kombiniert
-> Neuronen im Muskel: eine große synaptische Endplatte: ein EPSP reicht aus, großes EPSP
-> Neuronen im ZNS: EPSP werden zunächst aufsummiert, Reaktion der Zelle abhängig von der Entfernung des EPSP vom Axonhügel, Signal muss zunächst wandern bis dort hin um weitergeleitet zu werden, ein inhibierendes Signal reicht aus, um das EPSP zu stoppen Es kann verschieden aufsummiert werden: über mehrmaliger kurz hinterienander wirkende Signale oder mehrere Signale an einem Dendrit gleichzeitig, somit ist die zeitliche Konstante ebenso wichtig wie die räumliche
LTD und LTP Rezeptor und Prozess beschreiben, welche Bedingungen müssen herrschen
LTP: langanhaltende wiederkehrende Stimulation führt zu einer Veränderung der synaptischen Aktivität und damit eine Verstärkung der Synapse
->langfristige Veränderung der synaptischen Aktivität bei anhaltender Reizung
-> Entstehung nur bei präsynaptischen Eingang und gleichzeitiger Depolarisation
-> In der CA1 Region des Hippocampus: Mg Block der Postsynapse wird aufgehoben, Ca strömt mit ein und verstärkt das nachfolgende Signal, somit wird die AMPA Rezeptordichte erhöht, welche die synaptische Effizienz erhöht, ausserdem werden Calmodulinkinase abhängige Transkriptionsfaktoren (CREB) aktiviert
LTD: langanhaltende Abschwächung der synaptischen Aktivität
-> niedrigfrequente Reizung, schwache depolarisation und präsynaptische Aktivität führend zu einem schwachen Anstieg von Ca in der Postsynapse und damit eine verringerung der AMPA Dichte
2 Faktoren, die LTP und LTD beeinflussen
Abhängig von der Stärke der Rezeptoraktivierung und der postsynaptischen Ca Konzentration bzw der zeitlichen Abfolge der Aktivierung
Bei Langzeitplastizität, was ändert sich an der Präsynapse und an der Postsynapse?
Präsynaptisch: erhöhte Transmitterfreisetzung, Präsynaptische Proteine werden verstärkt exprimiert
Postsynaptisch: höhere Dichte der AMPA Rezeptoren, CREB Abhängige Gene werden exprimiert
Mechanismus und welche Kinase für Langzeitplastizität nötig
Calmodulinkinase: daran bindet Ca, phosphorylierung der AMPA Rezeptoren (erhöhung der Permeabilität),
Calmodulinkinase II: Einbau von zusätzlichen AMPA Rezeptoren, Autophosphorylierung bietet eine verlängerte starke Aktivität der Synapse
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