Definition für Biotechnologie
Kommerzielle Nutzung von biologischen Organismen, Systemen oder Prozessen für die Erweiterung des Wissensstandes, für die Gewinnung Produkten bzw. für “Dienst”leistungen.
Biotechnologie = die praktische/ technische Nutzung biologischer Phänomene
Nennen Sie die Hauptzweige der Biotechnologie
Grüne Biotechnologie
(Landwirtschaft, Pflanzenbiotechnologie)
Rote Biotechnologie
(Medizin/ Pharmazeutik)
Weiße Biotechnologie
(Biotech Produkte/ Industrieprozesse)
Biotechnologie “Toolbox”
—> Die drei Hauptgruppen der Biotechnologie
Nutzung von Organismen/ Zellen (z.B. Wein/ Bierproduktion)
Nutzung von Proteinen/ Enzymen (z.B. Waschmittelproduktion, Blutgerinnungsmittel, Insulin)
Nutzung des genetischen Materials innerhalb der Zelle (z.B. Genetischer Fingerabdruck)
Biotechnologie - Worauf geht Sie zurück und aus welchem Wissenschaftsgebiet sind die Kenntnisse besonders wichtig?
geht auf seit Jahrtausenden genutzte empirische Prozesse (Wein, Bot, Bier,…) zurück
moderne Erkenntnise der Molekularbiologie sind besonders wichtig
Einige wichtige historische Ereignisse für die Biotechnologie
1860: Pasteur erfindet die Pasteurisierung
1928: Fleming entdeckt das Penicillin
1953: James Watson und Francis Crick veröffentlichen ein Modell der DNA
1960er und 70er: Restriktionsenzyme
1970er: DNA-Sequenzierung
1980er: PCR und Insulin
1990er: Start Human Genome Project und erste Gentherapie
2012: Zulassung erstes Gentherapie-Medikament
Was sind die drei Domänen/ Reiche des Lebens?
Eukaryonten
Bakterien
Archaea
Bakterien + Archeae = Prokaryonten
Archaeen sind in vielen Aspekten den Eukaryonten ähnlicher
Biotechnologische Produzenten
Prokaryoten (Bakterien, Aktinomyceten, Archaeen)
Eukaryoten (Hefen, Schimmelpilze, Insektenzellen, Säugerzellen)
Enzyme
Es gibt viele biotechnologisch interessante Organismen
—> es werden aber nur relativwenige als Produzent genutzt
Bsp: E. coli, Saccharomyces, Schimmelpilze, Säugerzellkulturen
Nennen Sie 3 Prozesse in denen Schimmelpilze in der Lebensmittelstechnik eingesetzt werden.
Käseherstellung
Fermentationsprozesse (Sojasoße)
Aromaverbesserung (Amine, Aldehyde)
Erhöhung der Haltbarkeit bei Fleischprodukten
Methanogene (Archaeen)
Methanbildung aus organischen Substanzen oder CO2 als Energiequelle
strikt anaerob
Stoffwechsel bei Temperaturen zwischen 0 und 70°C
bevorzugen anoxisches, pH-neutrales bis schwach alkalisches Milieu
Coenzyme z.B. F420
Methanogene z.B. in Termitendarm, Rindermagen
—> Problem: zu viel Methan
Extremophile
Einteilung
Extreme Bedingung
Bezeichnung
besonderer Lebensraum
Temperatur
- sehr heiß
- heiß
- gemäßigt
- kalt
hyperthermophil/ extremophil
(über 50°C)
thermophil
(40-55°C)
mesophil
(20-40°C)
psychrophil
(5-20°C)
Kamine im Meer
Permafrost
pH-Wert
- niedrig
- neutral
- hoch
acidophil
neutralophil
alkaliphil
Säurequellen
Sodaseen
Salz (NaCl)
halophil
Salinen
Sauerstoff
- ohne
aerob
mikroaerophil
anaerob
Umgebung
Seewasser
Tiefsee
Druck
barophil
barotolerant
Strahlung
radiotolerant
Was sind sie?
Gewinnung von Genen?
= Alle, die unter extremen Bedingungen leben
Kultivierung meist schwierig/ unmöglich
Gewinnung der Gene durch DNA Isolierung einer kleinen Kultur oder direkt aus einem Pool von gesammelten Extremophilen
Screening/ Selektion auf Enzyme/ Proteine mit gewünschten Eigenschaften
Nennen Sie die Organismen, die unter extremen Temperaturbedingungen überleben. (4)
Geben Sie jeweils die Temperaturen an, in denen diese optimal wachsen können.
hyperthermophil/extremophil (über 55° C), Karmine Meeresgrund
thermophil (40-55° C)
psychrophil (5-20° C), Eismeer
Wie nennt man Organismen, die unter extremen pH-Werten überleben können? Bei welchem pH wachsen diese optimal?
acidophil (0,7), Säurequellen
neutralophil (7)
alkaliphil (10), Sodasee
In welchem industriellen Zweig werden Acidophile eingesetzt?
Tierfutterherstellung (Pellets)
Welche Organismen (bzw. deren Enzyme) werden in der Waschmittelindustrie genutzt?
alkaliphile Enzyme
psychrophile Enzyme
Wie bezeichnet man Organismen die extrem salzhaltige Lebensräume (Salinen) bevorzugen?
halophile Organismen
Wie heißen die Organismen, die unter hohem Druck überleben?
barophil (in der Tiefsee)
Welche Organismen bezeichnet man als radiotolerant? Wie ermöglichen sie ihr Überleben?
Organismen, die hohe radioaktive Strahlung überleben können
hohe Effiktivität in der DNA-Reparatur
Nennen Sie 3 Beispiele von Enzymen aus extremophilen Organismen, die in der Biotechnologie eingesetzt werden.
Taq DNA Polymerase
Vent Polymerase
Pfu DNA Polymerase
Vektoren: Welche Arten gibt es?
= Vehikel zur Übertragung von genetischer Information
Klonierungsvektoren
meist für E.coli
Vervielfältigung im Organismus aber keine Expression
Shuttle Vektoren
binäre Vektoren, funktionieren in versch. Spezies
z.B. Klonierung in E. coli und spätere Expression im Zielorganismus
(prokaryontische und eukaryontische) Expressionsvektoren
zur Produktherstellung
—> Promotorregion passsend für Zielorganismus
“tags” als Vektorbestandteile
= (kurze) Peptid- oder Proteinsequenzen
Funktion: Detektion und/ oder Reinigung
Detektion:
hohe Affinität
hohe Spezifität
meist über tag-spezifische Antikörper (z.B. im Western Blot)
Reinigung:
mittlere Affinität
über Säulenmaterial, an der das “tag” bindet
Nennen Sie 3 Beispiele für Peptid-tags. Wofür werden sie verwendet?
Beispiele für Peptid-tags:
His-tag
—> für Reinigung und Detektion
Flag-tag
Myc-tag
Strep-tag II
Nennen Sie 3 Beispiele für Protein-tags. Wofür werden sie verwendet?
Beispiele für Protein-tags:
Gluthation-S-Transferase (GST)
—> für Löslichkeit, Reinigung und Detektion
Green fluorescent protein (GFP)
Welcher Protein-tag ist gleichzeitig für die Reinigung und Detektion, sowie das Erhöhen der Löslichkeit geeignet?
Glutathion-S-Transferase-tag
(GST-tag)
Für welche Labormethode ist der Protein-tag “GFP-tag” geeignet?
Reinigung und Detektion
Wie funktioniert die Reinigung und Detektion über einen His-tag? Welche Vorteile hat ein His-tag?
Das Zielgen wird mit dem His-tag fusioniert
Im Säulenmaterial mit Chelatkomplex binden die Histidine an das Nickel-Zentralion des Komplexes
Eluieren mit Imidazol: Ist dem Histidin sehr ähnlich -> verdrängt Histidine + Zielprotein
Vorteile:
wenig immunogen
kleiner tag (“nicht im Weg”)
Mit welcher Substanz kann der Strep-tag II eluiert werden?
Biotin
(Eluation erfolgt bei der Reinigung)
Vektoren:
Nennen Sie 3 Vektoren, die sich in ihrer Aufnahmekapazität unterscheiden.
Plasmid
Lambda-Phage
Cosmid
Was sind die essentiellen Bestandteile von Expressionsvektoren in E.coli? (2)
bakterieller Replikationsursprung (ori)
Antibiotika-Resistenz (eher praktisch)
Was versteht man unter der multiple cloning site (Polylinker)? Wofür ist sie wichtig?
kurzer DNA-Abschnitt eines Plasmids, der Restriktionsschnittstellen enthält
praktisch zum Einfügen von genes of interest (Restriktionsenzyme nötig)
Welche Komponenten werden in einem Vektor für die Proteinexpression benötigt?
(induzierbarer) Promotor
Ribosomenbindestelle
Terminatorsequenz
optional: Fusionssequenz (z.B. tags)
Klonierungstechniken
Klonieren über Restriktionsenzyme
(alle Restriktionsschnittstellen schon vorhanden)
PCR zum Einfügen von Schnittstellen, tags, etc.
(Planung der PCR Primer)
Klonierung über homologe Rekombination (Ohne Restriktionsenzyme)
Gezielte Mutagenese zum Einfügen von Punktmutationen
Klonierungsvektor:
Aus was setzt sich ein Klonierungsvektor zusammen?
Multiple Cloning site
lacZ: Blau-weiß-Sceening
Promotor (Regulation der Expression)
Origin of replication
Selektionsmarker
Klonierung über Restriktionsverdau und Ligation
—> Schritte
“Gene of Interest”
Vektor mit Resistenzgen (Selektion) und origin of replication (Replikation im Wirt)
Ligation (z.B. sticky end und blunt ends)
Transformation in Wirtsorganismus, Amplifikation des Vektors
Ausplattieren auf Selektionsmedium
Was versteht man unter dem Blau-weiß-Screening?
Gehört zu den Selektionsmethoden.
Das gene of interest wird in die multiple cloning site, wo sich das lacZ-Gen befindet, eingefügt.
LacZ codiert für die ß-Galactosidase.
Zur Überprüfung der Insertion wird der gelbe Farbstoff X-Gal verwendet, der durch die ß-Galactosidase-Aktivität eine blaue Färbung annimmt.
Ist das Plasmid erfolgreich eingefügt, wird die ß-Galactosidase nicht mehr produziert und es bilden sich farblose Kolonien.
Klonierung
—> Häufig über Restriktionsenzyme
—> zur gezielten Veränderung eines Organismus
Einbringen von Fremd-DNA meist über Vektoren
Klonierung über Restriktionsenzyme:
Vektorfragment + Insert mit passenden Überhängen “sticky ends” ist bevorzugt
Klonieren über blunt-end ist auch möglich (Blau-Weiß-Selektion)
Wichtig: korrekter Leserahmen, wenn das Protein hinterher exprimiert werden soll
Restriktionsenzyme
erkennen spezifische Basenabfolgen und schneiden DNA Doppelstrang
Schnitt kann in beiden Strängen versetzt (sticky end) oder an derselben Stelle (blunt end) sein
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Reagenzien für die PCR:
Template
Primer
dNTPs
Polymerase
Puffer mit ATP
Schritte der PCR:
Denaturieren: Aufschmelzen der DNA (> 92°C)
Primer Annealing: Anlagern der Primer (ca. 52-58°C)
Extension: Verlängerung der Primer
Wiederholung der Schritte 1-3, 20-30x
Wofür steht die 4+2-Regel?
Methode zur Abschätzung der Schmelztemperatur in der Primerplanung
4° bei G und C
2° bei A und T
Der primende Bereich ist bei Tm = 52-58°C
In welche Leserichtung werden Primer angegeben?
5´ -> 3´
Wie wird der “obere” 5’-3’ Strang auch bezeichnet?
codierender Strang
sense-Strang
(+)-Strang
Nichtmatrizenstrang
engl. coding strand
Wie wird der “untere” 3’-5’ Strang auch bezeichnet?
Matrizenstrang
antisense-Strang
(-) Strang
engl. template strand, codogenic strand
In welche Richtung erfolgt die RNA-Synthese?
erfolgt vom antisense Strang (5’->3’ Richtung)
Das heißt, mRNA Sequenz ist…
… komplementär zum Matrizen-Strang
… identisch (bis auf T -> U) zum sense-Strang
Was für ein Virus ist Sars-Cov-2
RNA Virus
SARS-CoV 2-Impfstoffe:
Welche Arten von Impfstoffen kennen Sie? (5)
DNA-Impfstoff
RNA-Impfstoff
Vektorimpfstoff
inaktivierender Impfstoff
Subunit-Impfstoff
Wie ist ein Vektorimpfstoff aufgebaut? Welchen Nachteil kann die Verabreichung haben?
DNA-Abschnitt eines Virus’ ist in einen Adenovirus-Vektor eingebaut, der sich nicht vermehren kann.
Nachteil: Immunantwort auf Adenovirus
Wie ist ein mRNA-Impfstoff aufgebaut? Was sind deren Vorteile?
ein mRNA-Abschnitt für ein codierendes Protein ist in ein Lipidvesikel verpackt.
Vorteile: hohe Wirksamkeit
Welche SARS-CoV-2 Nachweise kennen Sie? (3)
Wie funktionieren sie?
RNA-Test (PCR)
Vervielfältigung der im Abstrich vorhandenen Virus-RNA
-> Umschreiben in DNA mittels Reverse Transkriptase
-> Detektion mittels spezifischer Primer (Poly-T primer, random primer)
Antigentest
Detektion über spezifische Antikörper, die Antigene des Virus’ binden
Antikörpertest
Bluttest nach Infektion: Untersuchung nach Antikörpern mittels Virus-Antigenen
Wie genau gelingt der Eintritt von SARS-Cov-2 in die Zellen? Welche zwei Methoden zur Impfstoffherstellen wurde aufgrund dessen in Betracht gezogen?
Aktivierung des Spike-Proteins durch Spaltung mittels Furin
Bindung an Rezeptor auf der Zelloberfläche
Zweite Aktivierung durch Spaltung durch TMPR
Zelleintritt
Methodik:
Modifikation der Furinspaltstelle -> protease-resistent
Einfügen von Prolin in Spike-Gen -> schnellere Erkennung von Antikörpern (gezielte Mutagenese)
SARS-CoV-Nachweis:
Wann wir die nested PCR angewendet und was ist das Besondere an der Methode?
bei wenig Genmaterial -> Erhöhung der Detektion des Virus´
mit zwei Primer-Paaren:
1 außenliegendes Primerpaar
1 innenliegendes Primerpaar
höhere Spezifität + Sensitivität
SARS-CoV: Nachweis
Worüber wird der Nachweis in der real-time PCR gebracht?
Fluoreszenz
nach der reverse Transkription lagert sich der Farbstoff an den durch Primer/DNA Polymerase produzierten Doppelstrang an und fluoresziert
Fluoreszenzsignal proportional zur Virus-DNA-Menge
SARS-CoV: Testbeurteilung
Was versteht man unter der Sensitivität und Spezifität?
Sensitivität:
Prozentmaß, dass angibt wie viele Tests positiv anschlagen, wenn die Person wirklich erkrankt ist
beschreibt Fähigkeit eines Tests Patienten mit einer Krankheit korrekt zu identifizieren (richtig-positiv)
Spezifität:
Prozentmaß, dass angibt wie viele Tests negativ anschlagen, wenn die Person nicht erkrankt ist
beschreibt Fähigkeit eines Tests Patienten ohne Krankheit korrekt zu identifizieren (richtig-negativ)
Was sind Homologieregionen?
In vitro angebrachte geplante Gensequenzen, die an einem Insertgen und Vektor identisch sind. Mittels SLiCE Reaction können diese miteinander rekombiniert werden und in die Zielzelle eingefügt werden.
Zu welchem Zweck nutzt man die Klonierung über homologe Rekombination? Welche Methode ist Ihnen bekannt?
Klonierung über homologe Rekombination erfolgt ohne Restriktionsenzyme
Entfernen von Vektorsequenzen
Klonierung mehrerer Fragmente
man benötigt keine Schnittstellen
SLiCE = Seamless Ligation Cloning Extract
Nennen Sie die 4 Phasen des Oligonucleotid-Synthese-Zyklus.
Phosphoamidit-Methode
Detritylation
Kopplung
Oxidation
Capping
Welche Methode eignet sich für die Veränderung in doppelsträngiger Plasmid-DNA? Welche Veränderungen kennen Sie?
Gezielte Mutagenese
Insertion
Substitution
Deletion
Nennen Sie Gründe für die gezielte Mutagenese.
gezielte Änderung von Proteinaktivitäten
Einfügen oder Entfernen von tags, Stoppcodons, ect.
Einfügen oder Entfernen von Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme
Nennen Sie Vorteile von induzierbaren Promotoren.
Kontrolle über die Expression von Proteinen
weniger Stress für die Produzenten
geringere Mutationsrate
Erklären Sie den Prozess des induzierbaren Promotors anhand des lac Operons.
lac Operon = Lactose Operon
Genabschnitt für den Laktose-Metabolismus in E.coli
nur induziert wenn Laktose anwesend
Glucose liegt als Nährlösung vor:
regulatorisches Gen des lac Operons exprimiert Repressorprotein
Repressorprotein bindet an Operator und blockiert das Ablesen des codierenden Bereichs
Lactose in der Nährlösung:
Lactose inhibiert Repressorprotein (Konformationsänderung)
Operator nicht blockiert -> Polymerase kann ablesen
Produktion der ß-Galactosidase, Permease, … ODER für gene of interest
Welche Expressionkontrollen gibt es in Eukaryoten?
Lac-System
induzierte Expression von LacI -> Repression -> Zugabe von Lactose -> LacI inhibiert (Konformationsänderung) -> Induktion
Tet-off System
Expression findet dauerhaft statt (durch Bindung eines Proteins TetR am Operator findet Expression statt)
Zugabe Tetracyclin: Bindung TetR -> Repression
Hormonelle Steuerung
Steroidhormone binden ihren Rezeptor im Plasma -> Wanderung in den Zellkern -> Induktion
Expressionskontrolle:
Was versteht man unter Repression und Induktion?
Repression:
Inaktivierung von Promotoren -> kein Expression
während lag- und exponentieller Phase
Induktion:
Aktivierung von Promotoren -> Expression
nach exponentieller Phase
Begriffe der Steriltechnik erklären:
Inaktivierung
praktisch vollständige Zerstörung der biologischen Aktivitäten von MIkroorganismen und biologischen Agenzien
Sterilisation
Abtötung praktisch aller Mikroorganismen (inkl. Sporen)
Keimzahlreduzierung um mind. Faktor 10^6
Desinfektion (Hygiene)
Abtötung oder Inaktivierung von pathogenen Mikroorganismen, so dass keine Gefährdung mehr von ihnen ausgeht (normalerweise nicht steril)
Keimzahlreduzierung um den Faktor 10^5
Kontamination
Produkte oder Gegenstände die nicht steril sind, werden als kontaminiert bezeichnet
Dezimalreduktionszeit
= Zeit, in der die Population auf ein Zehntel verringert wird
(abhängig von Bedingungen wie Wasser, pH, Temperatur)
Endosporen
-> was lässt sich über sie sagen?
entstehen bei Stress (Hunger) durch ungleichmäßige Teilung
nur bei grampositiven Bakterien
hohe Widerstandsfähigkeit gegen Hitze, Austrocknung, Strahlung, pH
-> durch Dipicolinsäure
geringer Wassergehalt
mehrschichtige Hülle
keine Form der Vermehrung
Sterilisations- und Desinfektionsverfahren:
Welches sind die 4 bzw. 3 Verfahren, die zu den Sterilisationsverfahren sowie Desinfektionsverfahren zählen?
Sterilisationsverfahren:
thermisch (Flamme, trockene Luft, feuchte Hitze)
chemisch
physikalisch: Strahlung
Filtration
Desinfektionsverfahren:
thermisch (Pasteurisierung)
Auf welchem Effekt beruht die Sterilisation auf chemischer Ebene?
Zerstörung der DNA mittels Radikalen, Oxidationsmitteln
Zerstörung der Zellmembran mittels Ethanol
Steriltechnik:
Welches Ziel verfolgt man mit einer Sterilisation und was ist der Unterschied zur Desinfektion?
Sterilisation: Keimreduktion um Faktor 10^6
-> bezieht sich auf lebensfähige Organismen
Desinfektion: Keimreduktion um Faktor 10^5
-> bezieht sich auf lebensfähige Organismen und schließt aber auch nichtzelluläre biologische Agenzien mit ein
Erklären Sie kurz das Pasteurisierungsverfahren.
Welche Vor- und Nachteile hat es?
Es gehört zu den thermischen Sterilisationsverfahren, wobei das kurzzeitige Erhitzen von 60-90° vegetative Keime zerstört (Teilentkeimung)
-> KEINE Abtötung von Sporen
Vorteil: Lagerung von Milchprodukten,Säften,ect. ohne Kühlung möglich
Nachteil: Sporen können überleben
Was wird mit einer Tyndallisierung erreicht?
Was ist ein Nachteil dieses Verfahrens?
Tyndallisierung = fraktionierte, diskontinuierliche Sterilisation
mehrfaches Erhitzen in Intervallen ermöglicht die Zerstörung von Sporen
Nachteil: sehr zeitaufwendig (Dauer 3 Tage)
Bei welchem Lebensmitteln wird die Filtration bevorzugt angewendet? Was ist der Nachteil dieses Verfahrens?
flüssige, gasförmige, hitzeempfindliche Lebensmittel
Nachteil: Viren können nicht zurückgehalten werden
Nennen Sie 3 Techniken der Hitzesterilisation.
Ausglühen/Abflammen
Heißluftsterilisation (trockene Hitze)
Autoklavieren
Sterilisationszyklus (Abbildung)
Bioreaktoren:
Was ist ein optimaler Bioreaktor?
Ein Behälter, in denen Mikroorganismen und Zellen unter optimalen Bedingungen kultiviert werden können.
Ausschluss kontaminierter Organismen
Kulturvolumen konstant
gelöster Sauerstoff über krit. Konzentration
Umgebungsparameter (Temperatur, pH) kontrollierbar
gute Durchmischung
Nach welchen Kriterien werden sie eingeteilt?
Einteilung:
Milieu
nicht-aseptisch
aseptisch
Wachstum
Oberflächenverfahren
Submersverfahren
Nährstoffzufuhr
batch-Kultur
fed-batch-Kultur (halb-kontinuierlich)
kontinuierliche Kultur
Nennen Sie zwei Grundtypen von Bioreaktoren/ Fermentern.
Rührwerkreaktor (kontinuierliches Rühren)
Airlift-Reaktor (aerober Bioreaktor mit Luftverteilung über Pumpen)
Was versteht man unter einer Batch-Kultur?
Diskontinuierliche Kultur:
Zugabe von Zellen in ein Medium mit konstantem Volumen.
Es erfolgt nur eine Zugabe von O2.
Die Kultivierung erfolgt bis zu dem Zeitpunkt, wo die Nährstoffe aufgebraucht oder toxische Nebenprodukte synthetisiert sind.
Die Zellen unterliegen einer wechselnden Stoffwechselanpassung
Batch-Kultur:
Beschreiben Sie die 4 Phasen der Kultivierungsmethode und zeichnen Sie das Diagramm.
Lag-Phase
Zellen passen sich Milieu an; kaum Zellteilung
exponentielle Phase
optimales Wachstum unter besten Bedingunge
Stationäre Phase
Nährstoffe ausgeschöpft
kein Wachstum
Synthese Sekundärmetabolite
Absterbephase
Absterben der Zellen (Nähstoffe aufgebraucht, viele toxische Produkte)
Nennen Sie mindestens einen Primär- und Sekundärmetabolit.
Primärmetabolite: während Anpassung der Zellen ans Milieu
Ethanol
Aminosäuren
Sekundärmetabolite:
Antibiotika
Was versteht man unter der Verdopplung- und Generationszeit?
Verdopplungszeit:
Zeit, in der sich das Gewicht der Biomasse verdoppelt
Generationszeit:
Zeit, in der sich die Zellzahl verdoppelt
Welche 2 Systeme werden für kontinuierliche Kulturen genutzt? Wie unterscheiden sie sich?
Turbidostat
Chemostat
Zelldichte konstant gehalten
Zelldichte passt sich Milieu an
Zelldichte bestimmt Nährstoffzugabe
Nährstoffaustauschrate konstant - immer frisches Medium
hoher Messaufwand
geringerer Messaufwand
mehr Nährstoffe
weniger Nährstoffe
Wozu dient die Verwendung von tierischen Zellkulturen? (4)
Synthese von
Vakzinen
Antikörper
Hormonen
Interferone
Was ist eine kontinuierliche Kultur? Welche Vor- und Nachteile hat sie?
Zugabe eines frischen Mediums und gleichzeitige Abnahme des gleichen Volumens Kulturbrühe (lebendige und tote Zellen, Metabolite)
Volumen bleibt konstant
Vorteil
Nachteil
nur kleine Bioreaktoren nötig
großer Aufwand
keine Totzeiten
Sterilitätsprobleme
Mutationsaufkommen
keine Sekundärmetabolite
niedrigere Produktkonzentrationen
Was versteht man unter einer Fed-Batch-Kultur? Wie unterscheidet sie sich von der kontinuierlichen Kultur?
stufenweise Zugabe von Nährstoffen, um Produktausbeute zu verbessern (Verlängerung der Batch-Kultur)
Hier erfolgt eine Volumenvergrößerung - bei der kontinuierlichen Kultur bleibt es konstant
Welche Methode wird häufig für die Selektion von Hefen angewandt?
Selektion über auxotrophe Hefe-Mutanten, die Leucin nicht selbst herstellen können
in Shuttlevektoren befindet sich dann das Synthese-Gen
Nennen Sie zwei induzierbare Promotoren in Hefen.
GAL (Galactoseepimerase)
PHO5 (Phosphat-induzierbarer Promotor)
Welches Antibiotikum verhindert die Bildung der Peptidbindung im Ribosom?
Blasticidin S
Was sind Baculoviren? Was ist ihre Vermehrungs-Strategie und wie macht sich die Biotechnologie diese zu nutze?
filamentöse dsDNA Virus
Wirbellose (Hauptwirt: Mottenlarven)
Strategie:
Eindringen in Wirtgenom -> Produktion von großen Mengen Polyhydrin
Bildung eines “Ausschusskörperchen”: Virus umhüllt von Polyhydrin-Hülle
Verlassen des Wirts -> Infektion weiterer Organismen
Biotechnologie:
Gen of Interest X für Polyhydrin-Gen ersetzen -> schnelle Expression und große Ausbeute
Nennen Sie zwei pflanzliche Kulturen, in denen Gewebsstücke kultiviert werden.
Explantation
Kalluskultur
Nennen Sie Vorteile von Pflanzenzellkulturen.
Produktion sekundärer Metabolite
Totipotenz
Kultivierung von ganzen Zellen, Gewebe oder ganzen Pflanzen möglich
Herstellung von Hybridpflanzen
Kultivierung von genveränderten Organismen ohne Freisetzung möglich
Was versteht man unter primären Zellen und Zelllinien?
primäre Zellen:
Zellen, die aus frisch isolierten Zellen anzüchtet werden und deren metabolische Prozesse noch einige Zeit voll aufrecht erhalten bleibt (Zellteilung auch begrenzt)
Zelllinien:
Zellen die aus primären Zellen isoliert werden und sich unbegrenzt im Nährmedium teilen können -> “Unsterblichkeit”
Nennen Sie 5 Produkte die aus Säugerzell-Kulturen stammen. Wozu werden sie vor allem genutzt?
Hormone
Impfstoffe gegen Viren
Gerinnungsfaktoren
Wachstumsfaktoren
-> Herstellung von Medikamenten
Nennen Sie 3 Säugerzellkulturen. Welche Arten von Kulturen gibt es für Säugerzellen und wie können sie konserviert werden?
HeLa (1. humane Zelllinie aus Henrietta Lacks)
CHO (chinese hamster ovary cells)
BHK-21 (baby hamster kidney cells)
adhärente Kulturen
Suspensionskulturen (Blutzellen)
Perfusionskulturen
Einfrieren bei -80° in flüssigem Stickstoff -> energieaufwendig, umständlich, riskant
Was versteht man unter Trehalose?
intrazellulärer protektiver Zucker, der Zellen vor Austrocknung und während Gefriertrocknung schützt (Bärtierchen)
Nennen Sie die Bestandteile von Expressionsvektoren für Säugerzellen.
permanent exprimierende Promotoren
regulierbare Promotorsysteme
Terminatorsequenzen
Selektionsmarker (Antibiotika)
Nennen Sie 4 Cytostatika und ihre Wirkungsweise
G418 und
Hygromycin
Hemmung Polypeptidsynthese (Translation)
Bleomycin
verursacht Strangbrüche
Puromycin
hemmt Proteinbiosynthese
Was sind zellfreie Expressionssysteme? Welche kennen Sie?
Expression von Proteinen ohne lebende Zellen
Zugabe von benötigten Aminosäuren, Puffer, ATP, Translations- und Transkriptionsapparaturen
in Retikulozyten (unreife Erys in Kaninchen)
E. coli Extrakten
Weizenkeimextrakt
Welche Formen des Gentransfers kennen Sie?
Transformation
nicht-virale DNA-Übertragung in E-coli, Pilzen,Hefen
Transfektion
nicht-virale DNA-Übertragung in Säugerzellen
Transduktion
virale DNA-Übertragung (Viren->Säuger, Bakteriophagen->Bakterien)
Beschreiben Sie die Methoden, die im Labor für den Gentransfer genutzt werden.
Chemisch
durch Hitze oder Salze wird Zellmembran durchlöchert -> Übertragung der DNA möglich
Elektroporation (Mikroinjektion)
Löchern der Zellmembran
durch virale Vektoren
Calcium-Phosphat-vermittelte Transfektion
Liposomale Transfektion
Vor- und Nachteile von biotechnologischer Produzenten.
Produzent
Bakterium
viele Klonierungs-vektoren
viel Erfahrung
einfache Kultivierung
hohe Ausbeute
Faltung von Proteinen problematisch
Endotoxine durch gram-n. Bakterien
Säugerzelle
gleiche biologische Aktivität wie natürliches Protein
Kultivierung großer Mengen
teure und schwierige Kultivierung
Langsames Wachstum
geringe Ausbeute
Hefen
keine Endotoxine
Glykosylierung möglich
einfache Reinigung
Endproteine nicht in der Form wie gewünscht
(z.B. Glykosylierung)
Insektenzellen (Baculovirus als Vektor)
posttranslationale Modi ähnlich wie Säugerzellen
gute Ausbeute
Proteine nicht immer voll funktionsfähig
Pflanzen
leicht in großen Mengen produzierbar
lange Erzeugungsraten
Pilze
gute Fermentation für Schimmelpilze
preiswert
große Mengen
geringe Expressionsraten
kleine Klonierungsvektoren
Nennen Sie 5 Bestandteile von Kulturmedien für biotechnologischer Produzenten
Wasser
Mineralsalze-Mischung
Energiequelle: Licht, organische oder anorganische Substanzen
C-Quelle
Stickstoffquellen, Vitamine, Spurenelemente (teuer)
Ernährung einer Zelle
Energiequelle für ATP
Licht
Redoxreaktion
Elektronendonator
anorganisch
organisch
zusätzliche Stoffe
Vitamine
N-Quellen
Was bedeutet Bioconversion?
Umwandlung von organischen Verbindungen in energetisch nutzbare Produkte
-> zum Beispiel: Lignocellulose
Wie ist Lignocellulose aufgebaut?
Hemicellulose
leicht hydrolysierbar
verzweigtes Zuckerpolymer
besser als Lignin,schlechter als Cellulose abbaubar
Cellulose
lineares ß-1,4-Glucosepolymer
häufigstes Polymer
nicht hydrosylierbar (speicherfähig wie Stärke)
durch Cellulasen abbaubar
Lignin
Phenylpropan, sehr heterogen
Spaltung durch Laccasen und Peroxidasen
kaum hydrosylierbar
Was ist ein Cellulosom?
Multienzymkomplex aus Cellulasen
aus Endo- und Exoglucanasen + ß-Glucosidase
Welchen biotechnologischen Nutzen hat Lignocellulose? Aus was lässt sich Lignocellulose gewinnen?
nachhaltige C-Quelle
Gewinnung von Chemikalien
nachhaltige Materialien
-> Altpapier
-> Baumwolle
-> Holz
-> Maiskolben
-> Zuckerrohr
Woraus werden Polylactide hergestellt und wofür werden sie verwendet?
Produktionsabfallprodukte (Hemicellulose, Cellulose, Lignin) werden zu Lactat -> Modifizierung zu Polylactiden
Verwendung: Bioplastik
Was versteht man unter Downstream processing? In welche 5 Phasen ist es eingeteilt?
Aufbereitung eines Produkts nach der Herstellung -> Abtragen von Fremdstoffen und Reinigung
Trennung wässrige von fester Phase
Konzentrierung
spezielle Reinigung
Trocknung
Formulierung des Produkts (Proteinfaltung stabilisieren)
Welche Produktionsorte der Endprodukte kennen Sie? Welche Vor- und Nachteile bringen sie mit sich?
Ort
In der Zelle (Cytoplasma)
hohe Produktions-c
(gut für Proteine mit freien SH-Gruppen)
hoher Anteil Fremdproteine
In der Zelle (Periplasma)
wenig Fremdproteine
(gut für Proteine mit Disulfidbrücken)
geringe Expressionsrate
In der Zelle (Inclusion bodies)
reines Produkt, hohe Konzentration
Rückfaltung sehr schwierig
Sekretion in Medium
wenig/keine Fremdproteine (Verunreinigung)
Produkt stark verdünnt
Was versteht man unter Inclusion Bodies?
falsch gefaltete Proteine -> Rückfaltung aufwendig oder unmöglich
Nennen Sie 4 Möglichkeiten zum Trennung von Zellen und Medium.
Zentrifugation
Dekantieren
Fällung
Wie erreicht man einen Aufschluss von Zellen nach der intrazellulären Proteinherstellung?
enzymatisch
bauen Zellwand ab
Detergenzien
osmotischer Druck
mechanisch
Mühlen
Ultraschall
Wie ermöglicht man die Abtrennung kleiner Moleküle?
Extraktion mit organischen Lösungsmitteln
Ausfällen (mit Säuren)
Ultrafiltration
Welche Methoden zur Proteinreinigung kennen Sie?
Ionenaustauschchromatografie
(Antikörper)-Affinitätschromatografie
Größenausschlusschromatografie
Wie ist Insulin aufgebaut und wie wird es im Körper synthetisiert? Wie und wo wird es heute in vitro synthetisiert?
A- und B-Kette
3 Disulfidbrücken
Präinsulin (Signalsequenz, A-Kette, B-Kette, C-Peptid)
Abspaltung Signalsequenz -> Proinsulin
Ausbildung Disulfidbrücken
Abspaltung C-Peptid
-> Produktion Proinsulin in Hefen und E.coli; C-Peptid durch Trypsin enzymatisch herausgeschnitten
Welche modifizierten Insulinvarianten kennen Sie?
für schnellere Wirkung
Hexamerbildung verhindern
schnellere Wirksamkeit und Resorption durch AS-Austausch
verzögerte Wirkung
AS-Veränderungen: Bildung schwer löslicher Hexamer -> verzögerte Aufnahme und Wirkung
Welche Optimierungen und Anpassungen von biotechnologischer Produzenten kennen Sie?
Einführen von Mutationen
-> Strahlung, Chemikalien -> Selektion und Screening der besser wachsenden Organismen
Überproduktion Lysin
durch inaktive Homoserin-Dehydrogenase (Mutation)
unhemmbare Aspartatkinase (Mutation)
Optimierung der Kulturbedingungen
Überproduktion Zitronensäure
durch gezielte Hemmung und Stimulation der Phosphofructokinase -> Anhäufung von Citrat in Citratcyclus
Nennen Sie 3 Antibiotika-Produzenten der Biotechnologie.
filamentöse Pilze
nicht-filamentöse Pilze
Actinomyceten (filamentöse Bakterien)
-> Antibiotika sind Sekundärmetabolite
Nennen Sie Wirkungen von Antibiotika.
Ribosom-UE in Proteinbiosynthese
Tetracyclin
Streptomycin
Kanamycin
Zellwandsynthese
ß-Lactam-Antibiotika (Penicillin)
RNA Synthese
Erythromycin
DNA Zerstörung
Anthracycline
Wie wird Penicillin synthetisiert (halbsynthetisch) und welche Wirkungsweise hat es?
Kultivierung von Penicillium c. mit Phenylessigsäure -> Penicillin G
Abspaltung Benzylgruppe durch Acylase -> 6-Aminopenicillansäure
Chemische Derivatisierung der Seitenketten (chemsiche Amidierung von 6-APA)
-> höhere Wirksamkeit gegen mehrere Bakterienarten
-> orale Verabreichung möglich
vor allem gegen grampositive Bakterien
inhibiert Glucopeptid-Transpeptidase -> Hemmung Aufbau Proteoglykanschicht
Derivate von Penicillin wirken auch gegen grampositive Bakterien
Warum ist die Gefahr zur Übertragung von Resistenzen unter Bakterien groß?
Resistenzgene sind meist auf mobilen Genen codiert, die relativ einfach ausgetausch werden können
Nennen Sie 3 Antibiotika-Resistenzmechanismen?
reduzierte/keine Aufnahme des Antibiotikums über Zellmembran
aktives Herausschleusen über Transporter
Inaktivierung durch Enzyme
Nennen Sie 3 Mechanismen der Resistenzgen-Übertragung.
direkte Übertragung von Bakterium zum Bakterium
Übertragung durch Phagen
Konjugation
Pilus-vermittelte Übertragung von Plasmiden
Worauf beruht der Resistenzmechanismus gegen Ampicillin?
Bildung der ß-Lactamase -> Spaltung des ß-Lactamrings von Ampicillin -> Bindung der Transpeptidase unterbunden
Nennen Sie Produzenten für Single Cell Protein.
Algen (Spirulina, Chlorella)
Welche 4 Zutaten werden im Reinheitsgebot ausschließlich erlaubt?
Hefe
Hopfen
Gerste
Beschreiben sie kurz die 9 Phasen der Bierherstellung
Malzen
Keimung
Bildung stärke- und proteinabbauender Enzyme
Darren
Abtötung Keime durch Erhitzen
Maischen
geschroteter Malz mit Wasser gemischt
Stärke- und Proteinabbau durch Enzyme
Läutern
Abtrennung der Feststoffe
Zugabe Hopfen
geschmacksgebend
Würze kochen
Ausfällung Proteine, Bitterstoffe
Inaktivierung Enzyme
Fermentation
Zugabe Hefen
-> obergärig und untergärig
Reifen
Entfernung Rückstände
Geschmacksverbesserung
Filtration/Pasteurisierung
Nennen Sie Unterschiede von obergärigem und untergärigem Bier.
obergärig
untergärig
Zugabe der Hefen bei 14-25° C
Zugabe der Hefen bei 4-12° C
Hefen steigen nach Gärprozess nach oben
Hefen sinken nach Gärung auf den Boden des Gärtanks
kürzere Dauer als untergärig
Nennen Sie 2 Verfahren zur Herstellung alkoholfreier Biere.
Limitierung des Alkoholgehalts durch Unterbrechung der Gärung
Vakuumdestillation
Was sind die Unterschiede in der Weißwein- Roséwein- und Rotweinherstellung?
Weißwein
Rotwein
Rosewein
Mostgärung (ohne Schale)
Maischegärung
verkürzte Gärung
Herauslösung der Farbe aus der Schale
CO2 muss entweichen, O2 darf nicht eindringen
viele Zusatzstoffe erlaubt
Brotherstellung
Sauerteig: Kombi aus Hefen und Milchsäurebakterien
aerob -> hauptsächlich CO2, nicht Alkohol
Was sind Milchsäurebakterien, welche Funktion haben sie und welche Arten kennen Sie?
fakultativ anaerob
grampositiv, ohne Endosporen
Milchsäuregärung: bauen Kohlenhydrate zur Milchsäure ab
homofermentiv:
Endprodukt > 90% Lactat
heterofermentativ:
neben Lactat auch Ethanol, CO2, Acetat
Nennen Sie 4 Sauermilchprodukte und deren Unterschiede.
Joghurt
neben Milchsäure zutsätzliche Produktion von Ameisensäure -> hohe Kosnservierung (pH gering)
Kefir
Kombi aus Bakterien und Hefen -> Produktion von Laktat, Ethanol + CO2
Sauermilch
nur Milchsäureproduktion
Sauerrahmbutter
neben Milchsäure bildet sich Diacetyl (Butteraroma)
Wie wird Essig hergestellt?
streng aerob
Zucker -> Ethanol -> Essigsäure
Oberflächenverfahren:
Essigsäurebakterien werden mit alkholhaltiger Flüssigkeit berieselt
Submersverfahren:
keine Gärung
immer mikrobioell erzeugt
Was versteht man unter neuartigen Lebensmitteln (Novel Foods)?
LM die vor 1997 nicht für den menschlichen Verzehr zugeordnet wurden.
LM, die
über neuartiges, nicht üblichen Verfahren entwickelt werden
Vitamine, Mineralstoffe und andere Stoffe sind
Wozu dient das Gentechnikgesetz? Wozu dienen die unterschiedlichen Sicherheitsstufen bei gentechnischen Versuchen?
Vermeidung von Gefahren und Ausbreitung gentechnisch veränderter Organismen
Sicherheitsstufen dienen vor allem dem Schutz von Mensch und Umwelt
Wann gilt eine Toleranz von gentechnisch veränderten Organismen/Lebensmitteln?
wenn GVO zufällig und technisch unvermeidbar ins Produkt gelangt
wenn in einem ZUGELASSENEN Produkt 0,9% GVO beinhaltet
wenn in einem von der EU nicht zugelassener, aber als gesichert bewerteter GVO zu 0,5% vorkommt
Was ist Chymosin? Wodurch wird es mithilfe von Gentechnik hergestellt?
Bestandteil des Kälberlabs
spaltet Casein -> Milchdicklegung (Käseherstellung)
Herstellung durch Hefen und Pilze -> Identisch mit natürlichem Enzym
Welche gesundheitlichen Probleme können durch GVO ausgelöst werden?
Entstehung von krankheitserregenden Nebenprodukten während der Herstellung des Zielprodukts
Transgene können für Allergene codieren
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