Was verbirgt sich hinter dem Begriff Biotechnologie?
praktische Nutzung biologischer Phänomene
Bitte ordnen Sie zu:
rote Biotechnologie
weiße Biotechnologie
grüne Biotechnologie
rote Biotechnologie = Pharmazie/Medizin
weiße Biotechnologie = Industrie
grüne Biotechnologie = Landwirtschaft
Biotechnologie Geschichte
Worauf geht die Biotechnologie zurück?
Prozesse + 2 Beispiele
Fleming entdeckt…
Watson & Crick veröffentlichen…
60er/70er Entdeckung….
70er Sequenzierung …
80er Erfindung der ….
erstes rekombinantes Medikament …
90er Welches Projekt + erste experimentelle…
2012 erste Zulassung für …
2018 Nobelpreis für ….
2020 Nobelpreis für …
Worauf geht die Biotechnologie zurück? Prozesse + 2 Beispiele
-> empirische Prozesse (Bier und Wein Herstellung)
Fleming entdeckt… Penicillin
Watson & Crick veröffentlichen… DNA-Modell
60er/70er Entdeckung…. Restriktionsenyme
70er Sequenzierung … DNA
80er Erfindung der ….PCR
erstes rekombinantes Medikament Insulin
90er Welches Projekt + erste experimentelle… Human Genome Project und Gentherapie
2012 erste Zulassung für …Gentherapie Medikament
2018 Nobelpreis für ….gerichtete Evolution und Selektion
2020 Nobelpreis für …Genome Editing
Biotechnologische Produzenten
Prokaryonten (3)
Eukaryonten (2)
Teile von eukaryontischen Organismen (2)
Actinomyceten, Archaeen, Bakterien
Hefen, Schimmelpilze
Insektenzellen, Säugerzellen
Relevanz von Organismen für die Biotechnlogie und Nutzung für industrielle Zwecke.
Begründung
viele Organismen sind interessant
wenige können genutzt werden
—> viele Organismen lassen sich nicht gut genetisch manipulieren und nur schlecht/gar nicht kultivieren
Domänen des Lebens
Archaeen
Bakterien
Prokaryonten
Archaeen und Bakterien bilden die Prokaryonten
Archaeen sind den Eukaryonten ähnlicher als den Prokaryonten
Methanbildung
Wo kommen Methanbildene Organismen vor ?
In welcher Domäne sind diese zu finden?
Unter welcher Bedingung läuft dieser Prozess ab?
Termitendarm, Rindermagen, auf Reisfeldern
strikt anaerob
Extremophile
Welche Organismen werden so bezeichnet
Welche Relevanz haben Extremophile für die Biotechnologie und warum?
alle Organismen die unter extremen Bedingungen leben
häufig biotechnologisch interessante Produzenten
—> ABER wenig Einsatz, da sie sehr schwer zu kultivieren sind
Extremophile zuordnen
hyperthermophil
thermophil
mesophil
psychrophil
halophil
alkaliphil
acidophil
barophil
barotolerant
radiotolerant
Definition von Vektoren
Vehikel zur Übertragung von genetischer Information
Überbegriff: Einbringen von fremder genetischer DNA
Orden Sie unterschiedliche Vektoren nach der Größe ihrer Aufnahmefähigkeit (klein—>groß)
Plasmid
Cosmid
BAC
YAC
MAC
Welche Vektoren kann man unterscheiden, was sind ihre Eigenschaften und wo werden sie eingesetzt?
Klonierungvektoren
nicht für die Proteinexpression geeignet
werden meist in E.coli eingesetzt
Expressionsvektoren
sind für die Expression geeignet
Shuttle-Vektoren
funktionieren in mehreren Organismen
häufig zur Klonierung in E.coli und Expression in anderen Organismen
typische Vektorbestandteile und ihre Funktion (8)
ori
für die Replikation des Vektors
Antibiotika-Resistenzgen
für die Selektion auf vorhandensein des Vektors
MCS (=multiple cloning site)
zum einfachen Klonieren
Promotor
für den Start der Transkription
RBS (ribosomale binding site)
für den Start der Translation
Terminator
für den Stop der Transkription
Stop-Codon
für den Stop der Translation
CDS/GOI
codierense Sequenz/gene of interest
Tags
Definiton
Wozu dienen Sie?
Welche Anforderungen werden dafür an tags gestellt?
Welche Technik wird zur Detektion verwendet und welches Hilfsmittel wird benötigt?
kurze Peptidsequenzen oder auch längere Proteinsequenzen, die sich am N- oder C-Terminus des protein of interest befinden
—> Fusionsproteine
dienen zur Detektion und Reinigung
Detektion:
hohe Affinität und hohe Spezifität
Reinigung
mittlere Affinität und hohe Spezifität
Western Blot mithilfe von Antikörpern
Beispiele für tags
Pepti-tags
Protein-tags
Flag-tag, HA-tag, His-tag, Myc-tag, Strep-tag
GFP-tag, GST-tag, MBP-tag
Abbildung beschriften
Welche Reagenzien benötigen sie für eine PCR? (6)
Vorwärts-Primer
Polymerase-Puffer
dNTP
Template
DNA-Polymerase
Rückwärts-Primer
Schritte einer PCR nennen, kurze Erklärung und bei welcher Temperatur ?
Denaturierung
Trennen des Doppelstrangs in 2 Einzelstränge
ca. 94°C
Annealing
binden der Primer
ca. 54°C
Extension
Verlängerung der Primer durch DNA-Polymerase
72°C
Wiederholung der Zyklen
meist 20-30 mal
Wie kann die Schmelztemperatur der Primer für die PCR abgeschätzt werden?
An welchem Ende erfolgt die Verlängerung der Primer ?
Wie werden Primer immer angegeben?
nach der 4+2-Regel
4°C für G-C (3H-Brücken)
2°C für A-T (2 H-Brücken)
immer am 3´-Ende
immer von 5`—>3`-Ende
Sie sollen für die Klonierung des Gens für GFP mittels PCR amplifizieren.
Hierbei soll über den Vorwärts-Primer die Erkennungssequenz für NdeI sowie ein His-tag eingefügt werden.
Über den Rückwärts-Primer soll ein Strep-tag, ein Stop-Codon sowie die Erkennungssequenz für EcoRI eingefügt werden.
5’ - XXXXXX— Erkennungssequenz NdeI — Gen für His-tag — primender Bereich “vorderer” Bereich des GFP Gens -3’
5’ - XXXXXX — Erkennungssequenz EcoRI — Stop-Codon — Gen für Strep-tag — primender Bereich “hinterer” Bereich des GFP Gens -3’
SARS-CoV-2 ist ein … Virus.
Was wird vom Rachen isoliert?
Was muss damit passieren und wie nennt man diesen Prozess?
Wie erfolgt der Nachweis und welche Techniken unterscheidet man?
Erklären sie die Methoden in einem Satz.
RNA-Virus
RNA wird isoliert und in DNA umgewandelt = reverse Transkription
Nachweis mittels PCR
nested PCR
erst normale PCR und anschließend erneute PCR mit weiter innen liegenden Primern
real time PCR
Fluoreszenz gibt einen Hinweis auf die Menge des Ausgangsmaterials
hoher Virustiter führt zu gut detektierbarem Signal nach weniger PCR Zyklen als ein niedriger Titer
SARS-CoV-2
Wie ließen sich mit real time PCR auch Virus-Varianten gezielt detektieren?
gezieltes testen auf mutierte Abschnitte
mit spezifischen Primern
Klonierung über homologe Rekombination
Worüber erfolgt das einfügen?
Wie muss der Vektor vorliegen?
Womit erfolgt die Reaktion?
Können mehrere Fragmente gleichzeitig eingefügt werden?
z.B. SLiCE (Seemless Ligation Cloning Extract)
Einfügen von Inserts über Homologieregionen, welche identisch in Vektor und Insert sind
Vektor muss linear/ offen vorliegen
Reaktion erfolgt mithilfe von E. coli-Extrakt
gleichzeitiges Klonieren von mehreren Fragmenten ist möglich
Homologieregion sollte ca. 36 nt lang sein
gezielte Mutagenese
Definieren Sie den Begriff.
Welche Vorgänge sind möglich?
Wie erfolgt das Einfügen und das Entfernen des Ausgangsvektors?
Methode für die definierte Veränderung in doppelsträngiger Plasmid-DNA
es sind möglich:
Substitution
Veränderung von Basen/Basenpaaren)
Insertion
Einfügen von Basen/Basenpaaren
Deletion
Entfernen von Basen/Basenpaaren
Einfügen erfolgt über entsprechende Primer in einer PCR-Reaktion
zur Befreiung verwendet man DpnI
—> spaltet nur methylierte DNA
Ziel: Ursprungsvektor loswerden
Expressionskontrolle über induzierbare Promotoren
Beispiel lac Operon
Erklären Sie wie es zum reprimierten und zum induzierten Zustand kommt.
reprimierter Zustand
lac-Repressor bindet an die Lac Operator Site
Blockierung der RNA-Polymerase
-> keine Transkription
induzierter Zustand
über Zugabe von Induktor (IPTG (zur Kontrolle der Proteininduktion) oder Laktose)
IPTG = Zucker-Derivat, das besonders fest an den lac-Repressor bindet
bindet an den lac-Repressor
-> Konformationsänderung
lac-Repressor kann nicht mehr binden und RNA-Polymerase ist nicht mehr blockiert
—>Transkription findet statt
Hefeexpressionsvektoren (Promotor und Selektion)
Hefeexpressionsvektoren
induzierbare Promotoren
Resistenzselektion häufig über Magelmutanten
Vektoren für Säugerzelllinien
(Promotor und Selektion)
konstitutive Promotoren oder induzierbare Promotoren
Resistenzselektion meist über Antibiotikaresistenz
Baculovirus
(infizierter Organismus + Funktionsweise)
Baculoviren infizieren Insektenzellen
für die rekombinante Expression wird das Gen für Polyhedrin mit dem GOI ausgetauscht
Säugerzelllinien (3 nennen)
HeLa
HEK-293
CHO
Zellfreie Systeme
(Was sind sie und woraus bestehen sie?)
Verwendung von Zelllysat aus:
Bakterien: Expression mit E.coli-Extrakten
Säugerzellen: Expression mit Reticulozytenlysat
Pflanzenzellen: Expression mit Weizenkeimextrakten
Definition von
Transformation
Transduktion
Transfektion
nicht virale Übertragung freier DNA in E.coli, Hefe,Pilze, Pflanzenzellen
bei Säugerzellen Entartung einer gesunden Zelle zur Tumorzelle
virale Übertragung von DNA
nicht virale Übertragung freier DNA in Säugerzellen
Sterilisation von … mit …
Glaspipetten
Medien für E. coli
Medien für Säugerzellen
Impföse
Einweg-Pipettenspitzen
fester Laborabfall, verunreinigt mit GVOs
Reagenzgläser
Glasgeräte
trockene Hitze:
Autoklavieren:
Medien für E.Coli
Filtrieren:
Abflammen:
Phasen einer Batch-Kultur
In welcher Phase erfolgt die Induktion der Expression?
Batch-Kultur
lag-Phase->log-Phase->stationäre Phase->Absterbephase
Induktion der Expression in der log-Phase
Fed-Batch (halb-kontinuierliche Kultur)
Wie kann das Monitoring erfolgen?
dient zur Verlängerung der Phase der Produktionsbildung. Es wird frisches Medium dazugegeben -> Volumen nimmt zu
Monitoring offline (einfacher, aber zeitverzögert) oder online
Turbidostat und Chemostat vergleichen
Beides kontinuierliche Kultur
Maßstabsvergrößerung schwierig oder einfacher und warum?
In welchen Schritten erfolgt die Maßstabsvergrößerung und womit erfolgt das Animpfen?
Wie kann eine Durchmischung erfolgen, wofür wird welche Methode genutzt?
Welche Verfahren gibt es und welche wird bevorzugt?
scale-up schwierig aus physikalischen Gründen
Schritte der Maßstabsvergrößerung:
Erlenmeyerkolben->Pilotanlage->Produktionsfermentor
Animpfen aus Vorkultur/en
Airliftreaktor für empfindliche Zellen
Rührwerksreaktor für unemfindliche Zellen
Submers-Verfahren wird dem Oberflächen-Verfahren vorgezogen
Aus was ist Lignocellulose aufgebaut und wie können die einzelnen Bestandteile abgebaut werden?
Was sind Cellusomen?
Cellulose: beta-1,4-Glucose mit Cellulase abbaubar
Hemicellulose: verzweigter Zucker-Polymer
Lignin: sehr heterogen, chemisch und enzymatisch schwer abbaubar, oxidative Spaltung durch Lactase und Peroxidase
Cellusom= multi-Enzym-Komplex mit verschiedenen Cellulase-Enzymen auf der Zelloberfläche
Produktionsorte mit den jeweiligen Vorteilen und Nachteilen nennen.
Produkt sezerniert ins Medium:
Vorteil: wenig bis keine Fremdproteine
Nachteil: Produkt ist stark verdünnt -> großes Volumen
Produkt in der Zelle:
Periplasma (oxidierende Verhältnisse)
Vorteil: geringer Anteil an Fremdproteinen
Nachteil: geringere Expressionsrate
Cytoplasma (reduzierende Verhältnisse)
Vorteil: relativ hohe Produktkonzentration
Nachteil: hoher Anteil an Fremdproteinen
Inclusion Body
Vorteil: Produkt relativ rein und in hoher Konzentration
Nachteil: Rückfaltung relativ schwierig bis unmöglich
Insulinproduktion
Biosynthese von Insulin in Stichpunkten
frühere Methode zur Insulinproduktion
heutige Insulinproduktion
Präproinsulin
-> Abspaltung der hydrophoben Signalsequence
Proinsulin
->Ausbildung Disulfidbrücken
->Abspaltung C-Peptid
reifes Insulin
früher Produktion in zwei Stämmen (jeweils einer pro Kette), Produktion als Fusion an beta-Galactosidase
->Ausbildung falscher Disulfidbrücken (Problem)
heute Produktion: Expression in E.coli oder Hefe, Produktion als Proinsulin
->C-Peptid bewirkt korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken
Antibiotika
Was sind es für Metabolite
In welcher Phase werden diese gebildet und wie nnent man die Phase noch?
Wo wirken Antibiotika (3)
Zu welchen Antibiotikan gehört Penicillin und wie wirkt es
Wie erfolgt die Synthese von Penicillin
Sekundärmetabolite
Bildung in der stationären Phase = Idiophase
Proteinbiosynthese, Replikation, Zellmembran/Zellwand
Penicillin:
beta-Lactam ->Wirkungsort Zellmembran/Zellwand
blockieren die Transpeptidase und verhindern Quervernetzung des Mureingerüstes
Synthese
halbsynthetische Synthese
Penicillium chrysogenum mit Phenylessigsäure kultiviert
-> Penicillin G
Acylase führt zur Abspaltung von Benzylgruppen
-> 6-Aminopenicillansäure
weitere Modifikationen erfolgen chemisch
Nennen sie vier generelle Antibiotika-Resistenzmechanismen.
Efflux-Pumpen
verminderte Aufnahme
Inaktivierung Antibiotikum über Enzyme
Mutation der Zielstruktur
Antibiotika-Resistenzgene sind …?
Über welche Mechanismen kann eine Resistenz gegen beta-Lactam Antibiotika erfolgen?
mobile genetische Elemente
Antibiotika-Spaltung durch Enzym beta-Lactamase und Mutation der Zielstruktur (Transpeptidase)
Welche Lösungen gibt es gegen Antibiotika-Resistenzen ?
Welche Substanzen kann man für welche Lösung im Fall von beta-Lactam Antibiotika verwenden?
neue oder modifizierte Antibiotika
Reserve-Antibiotika
Substanzen, die Resistenzen überwinden
Clavulansäure
Olivansäure
=> Inhibieren beta-Lactamase (binden irreversibel)
single cell protein
aus welchen Organismen wird dies gewonnen
Welche Organismen zählen zu diesen?
Wozu werden diese kultiviert?
einzellige Organismen
Algen,Bakterien, Hefe, Pilze
Lieferant von Protein
Bierherstellung
Welche Zutaten werden benötigt?
Schritte der Bierherstellung in der Richtigen Reihenfolge und kurze Beschreibung was dort passiert
Gerste, Hopfen, Wasser und Hefe
Malzen
Bildung von Stärke- und Protein-abbauenden Enzymen (Amylasen und Proteasen)
Darren
Abtöten der Keime
Maischen
Amylasen und Proteasen bauen Stärke und Proteine ab
Läutern
Gewinnung der klaren Würze und Abtrennen des Trebers
Zugabe von Hopfen
wirkt als Antiseptikum
Würze Kochen
Inaktivierung der Enzyme
Fermentierung/Gärung
Hefe setzt Zucker zu Alkohol um
Reifen
Geschmacksverbesserung
Filtration/Pasteurisierung
zur verbesserten Haltbarkeit
Unter welchen Sauerstoffbedingungen verläuft die Bierherstellung und ist dieser Prozess effektiv?
Bierherstellung ist ein anaerober Prozess.
Es ist ein ineffektiver Prozess (Erzeugung von 2 mol ATP pro mol Glucose
Im Gegensatz dazu:
aerob Prozess: Erzeugung von 38 mol ATP pro mol Glucose).
Weinherstellung
Aus welchem Ausgangsprodukt wird Alkohol gewonnen?
Schritte vor der alkoholischen Gärung einfacher/schwerer im vergleich zur Bierherstellung?
Unterschied von Weißwein zu Rotwein
Ausgangsprodukt reich an Zucker
—> Schritte vor der Gärung einfacher
Weißwein
Filtration nach der Fermentation
Mostgärung
Rotwein
Filtration vor der Fermentation
Maischegärung
Milchsäurebakterien
Zu welcher Gruppe von Bakterien zählt man sie und wie werden sie genannt?
Welche Merkmale kann man ihnen zuordnen und wie stehen sie morphologisch zueinander
Was bauen sie ab und welches Produkt entsteht?
Nennen Sie Beispiele für Milchsäurebakterien
gram+ Bakterien, auch genannt Lactobacillales
fakultativ anaerob, können Sauerstoff tolerieren, keine Endosporenbildung, morphologisch sehr unterschiedlich
bauen Kolenhydrate ab und bilden bevorzugt Lactat
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus
Milchprodukte
Bei der Kefirherstellung setzt man neben Milchsäurebakterien auch … ein ?
Edelschimmel im Käse sind Arten von … ?
Hefe Saccharomyces
Penicillium
Essigherstellung
Was ist das Edukt, das Zwischenprodukt und das Endprodukt?
Wie verläuft dieser Prozess ab?
Ist dieser Prozess eine Gärung?
Beispiele für essigbildene Organismen
Ethanol -> Acetaldehyd -> Essigsäure
aerober Prozes und ist keine Gärung
Acetobacter und Gluconobacter
Reisweinherstellung
Beschreiben sie kurz die Schritte
Welchem Prozess ähnelt die herstellung von Reiswein?
Stärke vom Reis wird durch Aspergillus gespalten
-> Zucker wird gebildet
Zucker wird durch Saccharomyces umgesetzt
-> Ethanol
ähnelt dem Prozess der Bierherstellung
(stärkehaltiges Asugangsprodukt)
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