Immunologie - Fragen aufgesplittet

primäre lymphatische Organe

• Thymus

  • Reifung der T-Lymphozyten

• Knochenmark

  • Blutzellbildung, Reifung der B-Lymphozyten

Prozesse

• primäre lymphatische Organe

  • Bildung, Entwicklung und Reifung der Immunzellen (B- und T-Lymphozyten) aus Stammzellen

  • klonale Selektion

  • somatische Rekombination = V-(D-)J Rekombination von TcR und BcR

• sekundäre lymphatische Organe

  • Antigenkontakt, klonale Vermehrung —> Differenzierung zu Effektorzellen

  • somatische Rekombination, Hypermutation, class switch

Primäre lymphatische Organe:

• Thymus, Knochemark

  —> Vorläuferzellen werden zu B- und T-Lymphozyten differenziert.

  —> Entstehung und Reifung

  -> Ag-unabhängig!

Sekundäre lymphatische Organe:

• Lymphknoten, Milz, Muköses und lymphatisches Gewebe, Tonsillen, Appendix

  —> Versammlung und Aktivierung von Lymphozyten

  —> Lagerung, Proliferation, Mutation, class switch

  —> B-Lymphoyzten treffen auf Helferzellen

  —> T-Helferzellen treffen auf dendritische Zelle und Makrophagen

  -> Ag-abhängig!

angeborene Immunität

• keine frühere Exposition mit einem Antigen erforderlich (immunologisches Gedächtnis)

erworbene Immunität

• reagiert Antigen-spezifisch—> benötigt Antigenkontakt

• Lysozym

• antimikrobielle Peptide

• Cytokine (Interleukine, Typ-I-Interferone)

• Akute-Phase-Proteine

• Komplementsystem

Akute-Phase-Proteine: z.B. (CRP=C-reaktives Protein)

opsoniert

aktiviert Komplement

Fibrinogen: Gerinnungsgefahr

Komplementsystem:

• Lyse von Bakterien

• Chemotaxis: Anlocken von Pathogenen

• Opsonisation (Markierung Pathogene)

• membrane attac complex

Typ-I-Interferone:

• wird von virusbefallenden Zellen produziert

• Hemmung Replikation

• Zerstörung virale mRNA + Proteine

• Aktivierung NK-Zellen (NK=natural killer)

Virusbefall der Zelle:

1) “Anti-viral-state”: virale mRNA degradiert, Translation gehemmt

-> Inhibition der Virenreplikation in der Wirtszelle

2) erhöhte NK-Liganden Expression

3) Aktivierung von NK -> Tod der infizierten Zelle

alpha-Interferone

• Bildung durch Makrophagen, Monozyten, virusinfizierte Zellen

beta-Interferone

• Bildung durch Fibroblasten

• Phagozyten

• verschiedene Granulozyten

• NK-Zellen

• ILCs (innate lymphoid cells)

Dendritische Zelle (DC):

Ag-Präsentation

Befähigt zur T-Zell-Aktivierung

Makrophagen:

Ag-Präsentation

Phagocytose (Erkennung und Verzehr von Erregern, Abfallprodukten)

Aktivierung bakterizider Prozesse -> adaptiven IMmunabwehr

Natural Killer (NK)-Zellen:

Einleitung Apoptose -> Können infizierte Zellen vernichten, ohne mit Erreger in Kontakt zu kommen

Erkennt nicht-Vorhandensein von MHC-1-Komplex auf Zelloberflächen

Granulozyten:

Enthalten Granula (Vesikel) mit aggressiven Stoffen -> unschädlich machen von Krankheitserregern

Basophile -> anti-parasitic immunity

Eosinophile -> killing AK coated parasites

Neutrophile -> Phagocytose, bakterizide Prozesse

Mastzellen -> Granula mit Histamin und aktiven Stoffen

klassischer Weg: Antigen-Antikörper-Komplex

aktiviert durch Bindung des Komplementfaktors C1 an einen Antigen-Antikörper-Komplex -> Zelllyse ausgelöst

alternativer Weg: spontanes tick-over

aktiviert durch Antigene (ohne Beteiligung von Antikörpern).

passiert dauerhaft im Körper = spontane Aktivierung des Komplementfaktors C3. Dieser hydrolysiert zu C3b und C3a.

C3b bindet an Faktor B. C3b muss dabei an eine Oberfläche binden, hat es keinen Reaktionspartner, bindet es an Wasser und

wird inaktiviert

Lektinweg:

MBL (mannosebindendes Lektin) bindet an Zuckerstruktur (Mannose) auf Oberflächen von

Bakterien, dies führt zur MASP-Aktivierung

Folgen:

• Zelllyse

• Phagozytose

• Opsonierung

Löcher in Membran, Zelle läuft aus (Zelllyse)

Schutzmoleküle an Zelloberfläche

-> CD59 (cluster of differentiation)

-> Markierung aller Zellen, körpereigene Zellen können CD59 abbauen

-> Zellen die es nicht abbauen können werden zerstört

-> Verhindert Komplementaktivierung

Erkennung von Selbst:

-> Erkennung von MHC-Molekülen schützt vor einer “Attake” durch NK-Zellen (mit KIR)

-> Zellen ohne MHC werden zerstört

-> Erkennung CD47 durch Makrophagen

-> Verdau der Makrophage verhindert

Toleranz und Regulationsmechanismen:

Eliminierung von Selbst-reaktiven B- und T-Lymphozyten in primären lymphatischen Organen. -> ZENTRALE TOLERANZ

Regulation der Aktivität von B- und T-Lymphozyten.

• Granulozyten

• Phagozyten

• Lysozym

• NK Zellen

• TLRs

• Cytokine

• B-Lymphozyten

• T-Lymphozyten

• spezifische Antikörper (Igs)

• Cytokine

• Rezeptoren durch Keimbahn kodiert

• Reaktion erfolgt Antigen-unspezifisch

• relativ schnelle Reaktion

• kein Gedächtnis

—> PAMPS (=pathogen-associated molecular patterns)

durch PRRs (pattern recognition receptors)

Rezeptoren der angeborenen Immunität:

• NOD-ähnliche Rezeptoren = NLR

• Toll-ähnliche Rezeptoren = TLR

• C-Typ Lektinrezeptoren = CLR

Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die zur Klasse der PRRs (Pattern Recognition Receptors) gehören

Transmembran Protein

erkennen PAMPs (Pathogen associated molecular patterns)

Beispiele:

• Lipoproteine von Bakterien und Mycoplasma (durch TLR2)

• Lipopolysaccharid auf der Zelloberfläche (durch TLR4 zusammen mit MD2)

• Bakterielles Flagellin (durch TLR5)

Auf der Oberfläche oder in intrazellulären Vesikeln von Phagozyten, z.B. Makrophagen

Erkennen PAMPs (Pathogen associated molecuar patterns)

aufgelöster Signalweg aktiviert Transkription von Genen, die z.B. eine Entzündungsreaktion auslösen

Gruppe: ILC = innate lympoid cells

zählen zum angeborenen Immunsystem

Bildung im Knochenmark —> Lernprozess

Erkennen virusinfizierte Zellen und Tumorzellen

Aktivierung

• Fehlende MHC-I-Moleküle

• Stress potentieller Targetzellen

• AK-markierte Zellen

Killing-Mechanismen: -> kontrollierter Zelltod

ADCC (Antibody dependent cell-mediated cytotoxcity), FasL

• Aktivitätsmessung über NK-Zell-Cytotoxizitätstest

• Funktion: Apoptose von körpereigenen, virusinfizierten, tumorösen Zellen induzieren

• T-Zell-vermittelte Immunreaktionen benötigen MHC1-Moleküle, NK-Zellen reagieren auf das Fehlen ebendieser

• Zytotoxische T-Zellen haben einen antigenspezifschen Rezeptor (MHC1 erkennen), die Rezeptoren (KIR-Rezeptor) der NK-Zellen sind unspezifisch (MHC1 fehlt -> das erkennen)

• Beide Zelltypen bewirken Apoptose

Fc-Rezeptor CD16 auf (in)aktiven NK-Zellen

Bindung eines verdächtigen Antigens durch AK auf Zielzelle

Anlockung von NK

CD16 bindes IgG

—> Aktivierung NK

—> Degranulation (Perforin, Granulysin, Granzym)

Apoptose Zielzelle

Schmackhaft machen durch Markierung von Fremdzellen mit AK oder Komplementfaktoren und indem sie besser zugänglich gemacht werde

—> führt zu einer schnelleren und effektiveren Phagozytose

Beteiligt:

- Fremdzellen

- Antikörper

- Komplementfaktoren

- Opsonine

Ziel: durch Opsonierung werden Fremdzellen für phagozytierende Zellen des Immunsystems markiert

• phagozytierende Antigen-präsentierende Zellen

• nehmen Ag als inaktive Langeranszellen auf

• werden aktiviert zu DC

• wandern in Lymphknoten

• B7 Expression

• costimulierende Aktivierung der T-Zellen

Opsonierung durch AK, Komplement oder CRP

Aktivierung von Phagocyten durch T-H1 Zellen

von Wirbeltieren als Antwort auf ein Antigen gebildetes (lösliches) Molekül, welches dieses Antigen spezifisch (aber reversibel) bindet

ein Molekül, das eine Immunreaktion induziert und das mit spezifischen Rezeptoren von B-Lymphozyten (Antikörpern) und T-Lymphozyten (T-Zell-Rezeptoren) reagiert

Immunogenität ist die Fähigkeit eines Antigens, eine mehr oder weniger heftige Immunreaktion auszulösen

der Teil eines Antigens, der mit der Antigen-Bindungs-Region eines Antikörpers oder T-Zell-Rezeptors in Kontakt tritt

-> wird immer durch den Antikörper definiert der daran bindet

chemisch definierte niedermolekuöare Substanz, die mit Antikörpern reagieren kann (d.h. als Epitop fungieren kann), aber allein keine Antikörperbildung induziert

ein Maß für die Bindungsstärke zwischen der Antigen-Bindungs-Region eines Antikörpers und dem entsprechenden Epitop

ein Maß für die funktionelle Bindungsstärke zwischen einem Antikörper und einem Antigen

Antikörper bzw Immunsystem reagiert mit einem Epitop

Antikörper bzw Immunsystem reagiert auch mit anderen Epitopen

Antikörper bzw Immunsystem reagiert mit mehreren nichtverwandten Epitopen

ein künstlicher Antikörper mit zwei verschiedenen Antigenbindungsstellen

ein Antikörper mit zwei verschiedenen Bindungsfunktionen

Heavy chain:

VH -> Ag-Bindung

CH 1-3 -> Zusammenhalt, Bindung an Fc-Rezeptor von Makrophagen = Bindestelle für Phagozyten

Light chain:

VL -> Ag-Bindung

CL -> S-Brücke zu Heavy chain

Hinge: 2 S-Brücken

-> gewährleistet Flexibilität der „Molekülarme“

variable Region: verschieden

→ Antigenbindungsstelle

→ Aminosäuresequenz im N-Terminus unterscheidet sich von einem spezifischen AK zum anderen

→ Variabler Teil = erste 100 AS

konstante Region: identisch

→ Effektorfunktion

→ AS-Sequenz verschiedener AK bei gleicher Klassenzugehörigkeit ist im C-Terminus identisch

→ bestimmt die Zugehörigkeit zur Ig-Klasse

Proteine mit Immunglobulin-ähnlicher Domäne bzw. Faltung. Mitglieder haben gemeinsame funktionelle Eigenschaft: Interaktion, Erkennung und Bindung von Zellen.

MHCs, CDs, NK-Zell-Rezeptoren (KIR), TcRs

- Co-Rezeptoren

- Growth-Factor-Rezeptoren

- Cytokin-Rezeptoren

- MHC-Moleküle

- Anzahl/Lage der Disulfidbrücken, welche die Ketten verknüpfen

- An/Abwesenheit von Gelenkregion

- Unterschiede in der Verteilung von N-verknüpften Kohlenhydratseitenketten

weiterhin gibt es noch Unterschiede:

→ biologische Funktion

→ Aminosäuresequenz der konstanten Regionen der schweren Ketten

→ Molekulargewicht

→ Anteil im Blutserum

→ Halbwertszeit

Neutralisation von Antigenen

Opsonierung

Aktivierung des Komplementsystems

antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity

Agglutination

- bilden Dimere (und Trimere, zusätzliches Polypeptid = J-Kette)

- sind vorrangig in den Schleimhäuten aktiv (auch im Serum vorhanden) -> schützt vor Pathogenen

- wichtige Fkt = neutralisation

- Transcytose durch Epithelien mittels Poly-Ig-Rezeptor

• wirkt als Antigenrezeptor

• in geringen Mengen und sezernierter Form in Blut und Lymphe vorhanden

• mit IgM als B-Zell-Rezeptor auf reifen, naiven B-Zellen membranständig coexprimiert

• Schutz vor Parasiten

• können allergische Reaktionen auslösen

• Quervernetzung bei Antigenkontakt

  -> Ausschüttung von Histamin und Granzym durch Mastzellen und Granulozyten

  -> Gefäßerweiternde Wirkung

• befinden sich auf der Haut und auf Mastzellen von Fc-Rezeptor gebunden

• fast vollständig membrangebunden, im Blut praktisch nicht vorhanden

• verzögerte Bildung

• längste Halbwertszeit aller AK -> Nachweis von Infektion/ Impfung

• Komplementaktivierung (IgG3) durch zwei antigengebundende IgG

• über Blut und Plazenta in den Fötus transportiert (IgG1)

  -> Schutz vor Infektionen

• Rhesusfaktor D kommt von IgG

  -> Komplikationen bei Schwangerschaft, da es plazentagängig ist

• Fc-Rezeptor vermittelt Phagocytose

• bei Erstkontakt mit Antigen gebildet

• zeigt akute Infektionsphase an

• bilden Pentamere (+ J-Kette), die ein hohes Molekulargewicht besitzen

• Komplementaktivierung

• im Blut- und Lymphsystem

• 10 identische Antigen-Bindungstellen

  -> Agglutination

- IgM: Wirksame erste Abwehrlinie gegen Mikroorganismen im peripheren Blut

- IgG: Schutz des Extravaskulärraumes vor Mikroorganismen und deren Toxinen

- IgA: Schutz an Schleimhautoberflächen

- IgD: Beeinflusst evtl. Lymphozytenfunktion, weitgehend unbekannt

- IgE: Schutz vor Darmparasiten, Auslösung von anaphylaktischen Reaktionen

CDRs: complementary determining region

3 CDRs pro leichte und 3 CDRs pro schwere Kette

(L1-L3, H1-H3—> 12 pro Antikörper)

In der variablen Region des AK, TcR, BcR

Moleküle: AK, TcR, BcR

3 CDRs pro leichte und 3 CDRs pro schwere Kette (variable Region)

(L1-L3, H1-H3—> 12 pro Antikörper)

spezifische Bindung von Antigenen

bilden Paratop, VH & VL Domäne

—> Erhöhte Diversität

—> Erkennt großes Antigen-Repertoir

Variabilität entsteht im Laufe der Ontogenese durch:

1. V-(D-)J-Rekombination (somatische Rekombination) zwischen Gensegmenten zur Kodierung der variablen Region

2. class-switch Rekombination beteiligte Genabschnitte: multiple Kopien von AK-Gensegmenten (V-, D- und J-Gen-Segmente

   für schwere Ketten; V- und J-Gen-Segmente für leichte Ketten)

3. Einführung von P und N-Nukleotiden an den Schnittstellen -> zusätzliche Variation

4. Kombination verschiedener schwerer und leichter Ketten

5. Punktmutation in V-Region-Genen durch somatische Hypermutation während der AK-Reifung

n-Nucleotide (non templated Nucleotids)

- Nukleotide, die nach Aufschneiden der Haarnadelstruktur, mithilfe der terminalen Desoxyribonucleotidyltransferase (TdT) an die aufgetrennten Einzelstränge angehängt werden

nicht codiert, zufällig

p-Nucleotide (palindromische Nukleotide)

- Nucleotide in den Verbindungsstücken zwischen den rekombinierten Gensegmenten für die V-Region der Antigenrezeptoren

- entstehen bei VDJ-Rekombination aus Hairpinstrukturen nach Abtrennung der Loop-Struktur und Recombination-Sigma-Sequences

zufällige Auftrennung der palindromischen Sequenz

-> überstehende Nucleotide = p-Nukleotide

Rezeptoren:

BcRs (membranständiger AK und freie AK)

TcRs (𝛼 und 𝛽 Kette)

• CDR3 —> am variabelsten

  • Rekombination zwischen V und J bzw. V,D und J findet im Bereich von CDR 3 statt

    —> daher die größte Längen- und Sequenzvariabilität

    —> Vielzahl unterschiedliche Peptide können gebunden werden

• CDR1/2: weniger variabel

• somatische Rekombination

  • Umlagerung der V-, D- und J- Gensegmente in den Loci der Ig, TCR

• schwere Kette: V, D, J

• leichte Kette: V, J

Rekombination Gensegmente auf somatischer Ebene

neue Kombinationen innerhalb von CDR 3

V,D und J Segmente, D nur bei Heavy Chain

zwischen Segmenten, direkt neben Segmenten liegen RSS Heptamer und Nonamer, je durch 23 oder 12 bp Spacer getrennt

RAG-Complex1+2 → Loop, Heptamere und Nonamere gepaart, dadurch zufällig ausgewählte Segmente verschiedener Arten (z.B. V und J) räumlich beisammen

Loop entfernen → Hairpinstrukur an Enden der Gensegmente

Öffnen der Hairpins → p-Nukleotide, Einfügen von n-Nukleotiden durch Terminale-desoxynukleotid-TransferaseSynthase füllt auf, Ligation

Moleküle: variable Regionen von BcRs, TcRs, Antikörper, CDRr der variablen Region

• konstante Region stark glykosyliert

• ohne hinge region

• kann mit anderen IgM über Disulfidbrücken oligomerisieren-> stabilisiert über J-chain -> hohe Avidität

• in der Membran gebunden an Igα-und Igß-Proteinen, die für das signaling bei Antigenkontakt über ITAMS Richtung Zellinneres zuständig sind

Funktion:

• Aktivierung Komplementsystem

Aktivierung der Mastzellen -> Mastzellen setzen Histamin aus Granula frei, dass toxisch auf Pathogene wirkt

Ziel: Erweiterung der Gefäße um Pathogen “auszuschwemmen”

Aufbau

schwere Kette:

• jeweils aus 4 Domänen

• glykosyliert

leichte Kette:

• aus jeweils 2 Domänen

• hinge region

Funktion

• kann dimerisieren

• Aktivierung des Komplementsystems

• Bindung von Phagocyten über Fc-Rezeptor

• Neutralisierung von Pathogenen

• Wirkungsort: Mucosaassoziiertes Gewebe

  
  

Sekretion des IgA-Dimers:

• IgA-sekretierende Plasmazellen —> dimeres IgA

• überwinden Basalmembran

• Bindung an Poly-Ig Rezeptor

  —> Transcytose

  —> Freisetzung IgA Dimer, glykolisierte sekretorische Komponente

  —> Bindung der Oligosaccharide an Schleim (Mucin)

• Komplex: schwerer IgM Kette+ Ersatzleichter-Kette = Prä-BCR

• Prä-BCR mit Igalpha und Igbeta assoziiert

• Entstehung

  • Assoziation einer umgelagerten leichten Kette mit µ-Kette

  • im Knochenmark

  • alternative RNA-Prozessierung

• Prüfung auf Toleranz gegenüber körpereigener Antigene

Wann

• nach Antigen-Kontakt

Wo

• Keimzentren der Lymphknoten

Veränderung der schweren Kette (downstream)

—> Wechsel der Antikörperklasse

Auslöser

• Aktivierung durch T-Zelle

• Zytokine

somatische Hypermutation:

• nur in B-Zellen

• Veränderung der V-Regionen von Antikörpern

• sekundäre lymphatische Organe

class switch:

• Rekombinationsprozess in aktivierten B-Zellen, bei denen konstante Region der schweren Kette gegen ein Isotop ausgetauscht wird

• Keimzellen der Lymphfollikel

BCR mit niedriger Affinität können das Antigen nicht binden und dies somit nicht auf ihrer Oberfläche den MHC Zellen präsentieren.

BCR mit hoher Affinität, die das Antigen präsentieren, empfangen unterstützende Signale von T-Helferzelle durch IL-21 (Cytokine) und CD40L, die das Überleben der Zelle fördern

Neutralisation

Opsonierung

Komplementaktivierung

Nein

• Maus-Antikörper (murine Antikörper) wirken im menschlichen Organismus als Antigen

  —> Serumkrankheit, Immunkomplexbildung (Antikörperbindung an Antigen)

• Neutralisation durch Antikörperbindung

  —> Virus bindet keinen neuen Rezeptor mehr zum Befall

• Opsonierung

  -> Stimulation der Phagozytose

• Aktivierung von Effektorzellen (NK-Zellen ,Mastzellen)

pathologische Wirkung I Überschuss Immunkomplexe

• Bildung von Immunkomplexen bei Ag-Ak-Reaktion

• fixierte Ak —> klassischer Weg der Komplementaktivierung über Fc-Rezeptor

• Ablagerung der Komplementkomponenten (C3b) auf den Komplex

• C3b bindet an Rezeptor der Erythrozyten

  —> Verdau in der Leber

• Anlagerung an Endothelien über Fc-Rezeptor

  —> Komplementaktivierung

• örtiliche Entzündung

pathologische Wirkung II Mastzellaktivierung

• Mastzellen mit Fc-rezeptor —> IgE bindet mit hoher Affinität

• Vernetzung der IgE —> Degranulation

pathologische Wirkung III Rezeptorblockade

• Antikörper gegen Ach-Rezeptoren —> Signalblockade, Zerstörung der Rezeptoren über Internalisierung

  —> Muskellähmung

pathologische Wirkung IV Rezeptorstimulation

• Antikörper bindet TSH Rezeptor

  —> Ausschüttung von Tyroxin

Epitop

• Antigendeterminante bindet an den TCR/Ak

lineare/kontinuirliche Determiante

• Aminosäuren der determinante liegen nebeneinander

diskontinuirliche Determiante

• Kontaktstellen zum Ak von Aminosäuren gebildet, welche im Protein nicht unmittelbar aufeinander folgen

Synthese kontinuirlicher Epitope ist am einfachsten

—>Proteinkonformation muss nicht beachtet werden

• diskontinuirliche Epitope

• Proteine denaturieren

• —> natürliche Konformation geht verloren—>Ak kann nicht mehr binden

Hapten (=unvollständiges Antigen)

• chemisch definierte niedermolekulare Substanz

• Raktion mit Antikörper (fungiert als Epitop)

• induziert keine Antikörperbildung = nicht immunogen

  (Ak-Bildung nur durch Konjugatbildung mit Carrier)

• Beispiele: Thyroxin, Ampicillin, Diuron

• Denaturierung im Western Blot

  —> eventuell neue Epitope zugänglich

  (Konformationsepitop zerstört)

• große Mengen

• unlöslicher NS

• äquimolar -> bessere Vernetzung

• Test: Agglutamination (große Partikel/Zellen), Präzipation (freie Ag-Moleküle)

• Antikörper werden benutzt um Antigene aus einem komplexen Stoffgemisch spezifisch auszufällen

• anschließend erfolgt eine Analyse des Präzipitats (WB, MS, Sequenzierung)

• Immundiffusion im Agarosegel

• Immunelektrophorese

• Hemmagglutination

• Immunprecipitation mit 35S-Met

Kompetitive ELISA

• 1 MoAk

• Ag < 5kDa

• keine 2 Epitope

Kompetitionsassay 1

• Ak immobilisiert

• markiertes Ag + Ag-Mischung

• je mehr Farbe, desto weniger Antigen

Kometitionsassay 2

• Ag immobilisiert

• markierter Ak + Ag-Mischung

• je mehr farbe, desto weniger Ak durch Ag aus Mischung abgefangen

• Radioisotope

  • Radioimmunassay (RIA)

• Enzyme

  • wandel farbloses Substrat in farbiges/fluoreszierendes Produkt um

  • z.B Peroxidase, alkalische Phosphatase

  • Festphasenassay (EIA,ELISA), Blots, Histologie &ELISPOT

• fluoreszierende Marker

  • Fluoreszin, Rhodamin, Phycoerythrin,…

  • Hostologie, Cytologie, Western Blot

• elektronendichte Marker

  • kolloidales Gold, Ferretin

  • Elektronenmikroskopie

• Nachweis kontinuirlicher Epitope

  • da diskontinuirliche Epitope denaturieren

• SDS-Page

• Elektronentransfer auf z.B Nitrocellulose

• primärer Antikörper bindet Antigen

• sekundärer Antikörper + Enzym binden primären Antikörper

• Enzym —> Farb- oder Chemoluminiszensreaktion

• kompetitve ELISA

  • Tetracyclinderivat an Carrier (Ovalbumin) binden

  • Hapten-Carrier immobilisieren

  • Platte absättigen

  • enzymmarkierten Antikörper binden lassen

  • Substrat auftragen

    —> wenig Farbe bei viel Tetracyclin

Ablauf:

• MoAk (catcher) immobilisieren

• absättigen (BSA)

• Antigen

• enzymmarkierter Ak (tracer)

• Substrat —> Farbreaktion (OD messen)

Waschschritte, Inkubation nach jeder Zugabe !

Voraussetzung:

• Antigen mit 2 Epitopen

• 2 MoAk für verschiedene Epitope

• Antigen > 5 kDa

• ELISA

• Virus-Antigen auf Well Platte

  —> Serum des Geimpften + Antikörper + Peroxidase

• spezielle Antikörper mit POD bindet Virus-Antigen und wenig Serum-Antigen (wegwaschen)

• kompetitiver ELISA

• Adsorption Hapten-Carrier-Konjugat

• Absättigung

• enzymmarkierter MoAk 1

• Substratreaktion

Sandwich ELISA

• Adsorption Catcher Ak

• Absättigung

• CEA Zugabe

• enzymmarkierter Ak (Tracer)

• Substrareaktion

• Stopp der Reaktion

• OD-Messung

kompetitiver ELISA

• Anti-T4-Antikörper auf Well Platte

• Serum + enzymmarkiertes T4

• Inkubation (Konkurrenz markiertes/unmarkiertes T4)

• Substrat

  —> Menge markiertem T4 ist umgekehrt proportional zur Menge im Serum

Na251CrO4 Labeling

• Target + radioaktives 51 Cr (VI) —> Cr(VI)-Aufnahme

• CTL zytotoxisch —> Cr(III) freigesetzt, supernant messen

Lymphozyten Stimulationstest

• Blut + Dichtemarker (Ficoll Isopaque)

• Lymphozyten-Isolation

• Zugabe Antigen-Suspension, Makrophagen, Kulturmedium, 3H-Thymidin

• Kultivierung

• Zellübertragung auf Filterscheibe

• Radioaktivitätsmessung (16h nach Enbau von 3H-Thymidin in DNA)

Analyse der Zellproliferation durch CFSE-labeling

• Lymphozythen mit CFSE (Fluoreszeinderivat) labeln

• Zugabe von Antigen,APCs —> Proliferation

• Aufteilung des Fluoreszensfarbstoffes auf die Nachkommen

  —> Analyse Durchflusschromatographie

  (Teilung der Peaks durch Teilung der Zellen)

• CD8-spezifische Antikörper (für Tc)

• Ak fluoreszensmarkieren

• FACS/MACS

• 51Cr-Test

• CD4-spezifische Antikörper

• Ak fluoreszensmarkieren

• FACS

• FACS

• panning

• Cytotoxicity

• Rosetting/magnetic beads

• fluoreszensmarkierter Antikörper bindet Antigen

• Untersuchungsstrahl wird über Vibration zu spezifischen Tropfen

• Laser bestrahlt Tröpfchen mit Zellen

• Detektion Fluoreszenzlicht —> aufladen der gewünschten Zellen

• Ablenkplatten —> Tröpfchen in gesuchte Fraktionen

• Ag + MoAk + magnetic beads (ferromagnetisch)

• MACS-Säule mit ferromagnetischer Matrix und Magnetisierung über Permanentmagnet

• zurückhalten markierter Zellen

• waschen

• Magnet entfernen

• waschen —> Eluat enthält gewünschte Zellen

• enzymatische Abtrennung der beads

• Bedinung: Zellen kaputt (saurer Elutionspuffer)

• zu groß für die Matrix

• Quervernetzung löst Aktivierung aus und ohne Signal

  —>Apoptose

• Moleküle: Proteine, Antigene, welche nicht zu stark an Ak binden

• Antikörper kovalent an beads/Matrix (porös) koppeln

• Stoffgemisch über Säule —> Antigen-Antikörper-Bindung

• waschen

• Elution mit saurem Elutionspuffer

• Reinigung Antikörper

Immnaffinitätschromatographie

• Ag immobilisieren

• kovalent auf unlöslicher, poröser Matrix

• Serum durchlaufen lassen

• waschen

• eluieren

Immunaffinitätschromatographie

• Antigen an feste Phase

• max. 10% der Antikörper-Fraktion

• höher als bei einfach Immunisierung

• MoAk oder Ag, kovalent

• Enyme+ Substrate/Inhibitoren/Cofaktoren

• Lektine + zuckerhaltige Moleküle

• NS + Histone/Polymerase

• Hormone/Vitamine + Rezeptoren

TCR

• Komplex: fremde Peptide + eigene MHCs auf der Oberfläche körpereigener Zellen

  —>MHC-Restriktion (Fremdes Peptid wird immer nur dann vom TCR erkannt, wenn es auf dem richtigen MHC-Molekül klebt!)

Antikörper

• Epitoperkennung auf Ag-Oberfläche

• höhere Affinität durch Hypermutation möglich

• zwei Fab-Regionen —> höhere Valenz

• Transmembrandomäne

• zytoplasmatische Sequenz ohne ITAMs

• SS-Brücken

• Co-Rezeptoren: Igaplpha, Igbeta + je ein ITAM

• Vernetzung der ITAMs —> Signaling

• Funktion: 1.Signalaktivierung der B-Zelle via Ag-Bindung

• transmembran-Region mit geladenen Aminosäuren

  —> Interaktion mit signaling-Kette

• zytoplasmatische Sequenz ohne ITAMs

• SS-Brücken

• variable und konstante Region, Antigen-Bindungstelle

• keine Hypermutation, kein class switch

• Antigenbindung alpha- und beta-Kette

• Corezeptor CD3

  • 1 ITAM pro Kette

  • negative Ladung in transmembran Region

• Zeta-Kette

  • negative Ladung in Transmembran-Region

  • 3 ITAMs pro Kette

• Funktion: 1.Signal —> Aktivierung der T-Zelle

  Spez. Bindung an Antigenfragmente, von MHC-Molekülen präsentiert

CDR 1

• aplpha Kette: Antigenbindung (N-Terminus)

• beta Kette: Antigenbindung (C-Terminus)

CDR 2

• Interaktion mit alpha-Helices an der Peptidbindungspalte der MHC-Kette

CDR 3

• größte Variabilität durch VDJ-Rekombination

• Antigenbindung

• ITAMs: Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs

  —> Tyr-Phosphorylierung

• BCR: Igalpha und Igbeta

• TCR: Zetta-Kette, CD3

Funktion:

• Vermeidung von Fehlreaktion

• Antigenpräsentation

• T-Zell Aktivierung

Dendritische Zellen

• Ag-Aufnahme als Alngerhanszellen

• Ag Prozessierung -> Präsentation

• B7-Expression

• costimulatorische Aktivierung T-Zellen

Makrophagen

B-Lymphozyten

• Wo: APC-Oberfläche

• Sicherheitsmechanismus (Antigen Präsentation über MHC ist ungenügend für T-Zell-Aktivierung)

• Costimulatoren: B7, CD28(T-Zellen)

• Fehlen -> Anergie/Apoptose

Kreuzpräsentation

• extrazelluläres Antigen aufgenommen, daraus antigene Peptide

• Antigen-Aufnahme durch dendritische Zellen

• Präsentation auf MHC I

  —> Aktivierung von CD8+ T-Zellen (cytTC)

• Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz gegenüber körpereigenen Proteinen

Kombiniert Eigenschaften der klassischen Präsentationswege, d.h. es werden Antigene bzw. Proteine aus dem extrazellulären Raum aufgenommen, die daraus hervorgehenden antigenen Peptide jedoch auf MHC-I Komplexen an CD8+-zytotoxischen T-Zellen präsentiert.

• MHC-Genotyp beschränkt Antigen-Spezifität von TCRs

• Erkennung eigener MHC-Moleküle

• Antigen-Bindung

MHC-Restriktion ist ein Effekt, durch den T-Zellen eine spezifische Gruppe von Peptiden erkennen, die an bestimmten MHC-Molekülen gebunden ist.

Polymorphismus

• Variation eines Genlocus und Genprodukts innerhalb einer Spezies

• individuelle Genvarianten heißen Allele

Polygenie

• Anwesenheit mehrerer ähnlicher Gene in einem Gencluster

• Genprodukte aller Gene exprimiert und besitzen ähnliche Funktionen

MHC

• alle Menschen in bestimmten MHC-Genen heterozygot

  (Polymorphismus), Mensch 2 Allele

• 3 loci MHC I (gleiche Funtion, andere Eigenschaft)

  —> 6 MHC I Moleküle

• Antigen-Prösentation

• T-Zell-Aktivierung

• Makrophagen-Aktivierung

• Antigen-Präsentation durch B-Zelle

• CTL erkennt virusinfizierte Zelle (MHC I)

• NK-Aktivierung bei fehlen von MHC I

• MHCs werden nicht als eigene erkannt

• mitgebrachte APCs aktivieren T-Zellen

• Autoimmunreaktion, wenn aktive T-Zellen auf transplantiertes Gewebe treffen

  —> cytotoxisch, eventuelle Ak-Bildung

  
  

MHC I

• Genloci Mensch

  • HLA-A/B/C

• Expression

  • T/B-Zellen, APC, epitheliale Zellen des Thymus

    Neurophile, Hepatocyten, Niere, Gehirn

• Antigenpräsentation für CD8+ T-Zellen, Tc

• präsentierte Antigen

  • cytoplasmatische, körpereigene, virale

  • Peptide 8-10 Aminosäuren

• Molekülaufbau

  • alpha- und beta2-kette

• Peptidpräsentation

  • cytosolischen Protein

• 6 Typen

• Genloci Mensch

  • HLA-DR/DP/DQ

• Expression

  • T/B-Zellen, APC, epitheliale Zellen des Thymus

• Antigenpräsentation für CD4+ T-Zellen, TH

• präsentierte Antigen

  • extrazelluläre, körpereigene, Bakterien,Toxine

  • Peptide 12-25 Aminosäuren

• Molekülaufbau

  • alpha- und beta-kette

• Peptidpräsentation

  • Endocytose des Antigens

• 8-12 Typen

Enzymkomplex zum Abbau polyubiquinierter Moleküle

Fragmentierung cytosolischer Proteine und defekter ribosomaler Produkte (DRiPs)

Aktive Immunisierung

• Antigen gespritzt —> Antikörper-Bildung

• Windpocken, Masern, Mumps, Röteln

• Gedächtniszellen —> schnelle sekundäre Antwort

Passive Immunisierung

• Antikörper gespritzt (eines zuvor aktiv immunisierten Tieres)

• Tetanus, Tollwut

• erneuter Antigenkontakt —> keine Immunität

• Fusion Plasmazelle (immunisiertes Tier) mit Myelomzellen über elektrischen Impuls

  —> Hybride überleben

• Selektion gegen Myelomzellen mit HAT-Selektion

• Reklonierung

• Massenproduktion

• Cryokonservierung

Wahrscheinlichkeit = 0

Glutaminsäure ist ein Hapten

Vorgehen für Antikörper:

• Zugabe von Adjuvans + Carrier —> Hapten-Carrier-Konjugatbildung

• —> APC/T-Zell-Aktivierung

• —> Ausschüttung Cytokine, IL

• —> B-Zell Proliferation und Differenzierung

• MoAK über Hybridomtechnik

B-Zell-Differenzierung

• Einwanderung der Vorläuferzelle —> Teilung

• Rezeptorbildung (1.Schwere Kette, 2. leichte Kette)

  V,D,J- Rekombination in primären lymphatischen Organen

• Überprüfung durch Antigene auf Oberfläche von Phagozyten, epithelialen Zellen

• Apoptose potentieller autoreaktiver Zellen

Orte

• DC, B-Zelle

  • Antigen-Bindung, Internalisierung —> Aktivierung

  • Antigenerkennung: Th über TCR-Bindung an DC

    —> 2. Aktivierung —> Proliferation

    • Bildung Primär-/Sekundärfollikel in B-Zell-Zone

    • Gedächtniszellen

    • Plasmazellen verlassen Lymphknoten

    • Antikörper-Produktion

• Antigen spritzen —> nichts

• Lag-Phase: Aktivierung, Vermehrung von zellen der adaptiven Immunität

• Antikörper-Produktion nach 1. Woche

• Sekundärantwort = Reaktion auf das immunologische Gedächtnis

• gereinigtes Antigen + Carrier + Adjuvans

• Versuchstier wird immunisiert, nachimunisiert

  —> Blutabnahme/Eidottergewinnung

• Anteil spezifischer Antikörper 1-10% bei schwachen Immunogenen weniger

• Reinigung über Affinitätschromatographie

Thymus-abhängig

T-Zellen sind notwendig

• Antigen-Bindung 1 -> BCR-Vernetzung->Internalisierung->Peptidbildung->Antigen-präsentation über MHC II

• B-Zell-Aktivierung durch T-Zell-Bindung über TCR (CD40/CD40L) -> Proliferation, Differenzierung

• Antigen-Bindung 1 -> TCR/MHC

• Aktivierung der T-Zelle durch dendritische Zellen (CD28/B7)—> Proliferation,Differenzierung

Thymus-unabhängige

2.B-Zell-Aktivierung durch Antigen (IgM-Antikörper)

• Antigen -> BCR-Vernetzung, TLR-triggern

  —->vollständige B-Zell-aktivierung

• kein class switsch oder Hypermutation

• Adjuvanzien

• Carrier

• Antigendosis

• Molekülgröße

• denaturiert

• unlöslich

• Immunogen

• groß

• unlöslich

• molekular unterschiedlich zum Wirt

• Aluminiumhydroxid

• Antigen-Immunogenität erhöhen

• Wirkung:

  • Beschleunigte Aufnahme durch Makrophagen

  • verzögerte Antigen-Freisetzung

  • APC—>Zytokine

zytotoxische T-Zellen

• Aktivierung von Tc über Kreuzpräsentation

• Tc bindet Target über MHC I

• Freisetzung cytotoxischer Granula -> Apoptose

NK-Zellen

• MHC I fehlt -> NK-Zell-Aktivierung

• Freisetzung cytotoxischer Granula

• Interferone -> Anlockung

  -> antiviral-state —> Liganden-Produktion für NK-Zellen

• Th1: aktivieren Makrophagen

• Th2: aktivieren B-Zellen

• Treg: regulieren andere Immunzellen

• Tc: töten virusinfizierte Zellen

• Aktivierung von Tc: Kreuzpräsentation

• Antigen durch APC aufgenommen

• Verdau

• Ausbruch viraler Proteine ins Cytoplasma -> ER

• Peptidpräsentation über MHC I Moleküle

• Aktiverung der Tc über MHC I (B7/CD28)

• Proliferation Tc

• vollständige T-zell-Aktivierung

• IL-2-Sekretion -> Selbstaktivierung

• klonale Expansion, Differenzierung zur T-Effektorzelle

• Antigenkontakt -> Effektorfunktion -> töten

• Stammzellen aus KM -> Cortex-> TCRalpha/beta oder TCRgamma/delta, CD4 oder CD8 Expression

• Selektion über Thymusepithelzellen, dendritische Thymuszellen

• Interaktion mit MHCI/II auf Cortex-Epithelzellen

• geringe und mittlere Affinität vermehren sich

  —> positive Slektion

• Interaktion mit MHC-Selbst-Peptid-Komplexen auf medullären DC und Makrophagen

• stark reaktive Zellen sterben, schwachh reaktive Zellen werden vermehrt und verlassen Thymus

  —> negative Selektion

1. Lymphocyten mit einem Rezeptortyp und einer Spezifität

2. Wechselwirkung Antigen-Rezeptor, der diese Molekül mit großer Affinität bindet -> Lymphocytenaktivierung

3. von einem aktiviertem Lymphocyten abstammende ausdifferenzierte Effektorzellen tragen Rezeptoren derselben Spezifität wie die Mutterzelle

4. klonale Deletion potentiall autoreaktiver Lymphocyten

Antikörper-Variabilität

• somatische Rekombination

• class-switch

• Punktmutation in V-Region-Genen durch somatische Hypermutation

• Einführung von P- und N-Nukleotiden

TCR-Variabilität

• somatische Rekombination

• Einführung von P- und N-Nukleotiden

  —> kein class sitch, keine Hypermutation

  
  

• keine weitere Kontrolle durch z.B B-zellen

• autoreaktive Zellen

• Autoimmunreaktion

Immuntoleranz von Lymphozyten, die sich in den zentralen lymphatischen Organen entwickeln gegenüber Autoantigenen

=> Ausbleibende bzw. stark verminderte Reaktion des Immunsystems gegenüber einem Antigen.

• Effekt: autoreaktive Lymphozyten -> Anergie/Apoptose

• Organe: Thymus und KM

• Prozesse: positive Selektion und negative Selektion

• gesunde Zellen:

  • präsentieren permanent über MHC I

  • keine TCR mit spezifität für eigene MHC/Peptid-Komplexe -> zentrale Toleranz

    
    

in peripheren Geweben entwickelte Toleranz reifer Lymphozyten

• Lymphozyt benötigt 2 Signale zur Aktivierung

• fehlen 2. Signal —> Apoptose

• begrenzte Lebensdauer aktivierter Lymphozyten

• Treg können Th, Tc, B, DC unterdrücken

• einige Gewebe sind unzugänglich

• Konkurrenz um Wachstumsfaktoren mit T-Zellen (IL-2)

• inhibitorische Cytokine an T-Zellen (IL-10, TGF-beta)

• Funktion Treg können andere Immunzellen inhibieren

Zustand fehlender Reaktivität auf Antigene

• T-Zellen werden anergisch, wenn das costimulatorische Signal über CD28/B7 fehlt

• bei B-Zellen, wenn CD40/CD40L fehlt

  
  

• Apoptose (zentrale Toleranz)

• Regulation der Aktivität durch u.a. Treg

autoreaktive Lymphozyten sind vorhanden, aber keine Reaktion an immunologisch privilegierten Orten

• Gehirn, Auge, Uterus, Hoden, Hamsterbacke

• hochaffiner inhibitorischer Rezeptor für B7-Moleküle auf T-Zellen

• Bindung -> blockiert die Aktivierung einer T-Zelle

• CTLA-4 Dimer bindet zwei verschiedene B7 Dimere -> Cluster hoher Affinität

1. Uterus immunologisch privilegiert

2. Produktion immunsupressiver Substanzen

3. Treg-Aktivierung

4. geringe NK-Zell-Aktivierung

5. Komplementinhibierung

• T-Zellen binden Transplantat -> Autoimmunreaktion

• NK-Zellen-Aktivität, CTL

• Immunsupressiva verhindern Reaktion gegen Transplantat

• Transplantatpeptide über T-Zellen, APC präsentiert

Nein

• werden nicht in der Niere filtriert (zu groß 150kDa)

• nude Mäuse ohne Thymus -> kein Immunsystem

• keine Erkennung von fremd oder selbst

• charakteristische morphologische Änderungen

  • Zellen und Kerne schrumpfen, kondensieren, fragmentieren, Kein platzen

  • DNA Abbau durch Endonukleasen CAD

    -> Bruchstücke entstehen

  • Veränderung der Zelloberfläche (find me eat me)

    -> Erkennung durch Makrophagen

  • Phagozytose (Verdau durch Makrophagen, Nachbarzellen)

Schritt 1

• Chromatin wird kompakter, Faltung, Cytoplasmakondensation

Schritt 2

• eat me signal, Zerstörung der Kernmembran, Fragmentierung

Schritt 3

• Phagozytose

in primären lymphatischen organen ca. 97% durch Selektion

• Apoptose -> inaktivierung Flippase

• Fluoreszensmarkierung von Annexin V

• Bindung von Annexin V -Phosphatidylserin

• FACS -> Aussorierung

• Fluoreszensmikroskopie

• DNA-Spaltung —> Gelelektrophorese

• TUNEL= terminale transferase sUTP nick end labeling

Nekrose:

• Ursache Unfall (akute Verletzung)

• Zellen, Organellen schwellen an -> platzen -> Zellinhalt in extrazellulären Raum

• Phagozytose nekrotischer Zellen durch Makrophagen

• Zellkerne bleiben lange intakt

• Freisetzung Entzündungs-induzierender Signale -> Entzündung