Struktur des Stx
jede der 5 identischen B-Untereinheiten weist 3 Bindungsstellen auf -> insgesamt 15 Andockstellen für B-Pentamer
Gb3Cer hochaffiner und Gb4Cer geringaffiner Rezeptor
Biosynthese von neutralen GSL der Globo-Serie
Globotriaosylceramid (Gb3Cer)
der wichtigste aber nicht der einzige Rezeptor für Stx
für die Stx-Bindung verantwortliche Glykoepitop die terminal an Lc2Cer in α1-4-Konfiguration gebundene Galaktose
Enzym α1,4Gal-Transferase generiert dieses Epitop, einmalig für GSL, kommt noch auf N- oder O-Glykanen von Glykoproteinen vor
Struktur von lipid rafts
für Isolierung Eigenschaft zunutze, dass Cluster gegenüner Detergenzien stabil (“resistent”) sind, während umgebende Membran solubilisiert und in Einzelkomponenten aufgelöst wird
raft-Bereiche auch als liquid-ordered-membrane phase und weniger strukturierte Membranumgebung als liquid-disordered membrane phase
lipid raft marker: Cholesterol, Sphingomyelin, GSL (und einige Proteine)
bei DRMs lipid raft-analoge Strukturen
Schema für Isolierung von DRMs
für Zerstörung der Zellen hypotoner Puffer (hypotone Lyse) verwendet
Zentrifugation bei 400g, Sediment aus Zellorganellen (Mitochondrien, Zellkerne usw.), gewünschte Membranstücke im Überstand
Überstand abgenommen
Ultrazentrifugation des Überstandes (150.000g), Membranstücke sedimentieren
in Saccharosegradienten 19h bei 200.000g zentrifugiert, DRMs wandern aufwärts, siedeln sich je nach spezifischer Dichte zwischen 5-30% an
Volumina nach oben und unten abgenomen, Dialyse (Entfernung der Saccharose), dann Gefriertrocknung
mit Rest Lipidanalyse, gesamte Prozedur bei +4°C durchgeführt
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