05_Proteinstrukturdetermination

• Roentgenkristallographie

• Nuklear-Magnetische-Resonanz (NMR) Spektroskopie

• Elektronenmikroskopie

• Kristallisierung des Proteins (nicht bei allen moeglich)

• Ablenkung der Lichts durch Proteinmolekuels, wenn >= Wellenlaenge lambda

• kein klarer Fokus moeglich

• einzelnes Molekuel fuer Ablenkung zu schwach

-> Messen der Richtung und Intensitaet der Ablenkung und Simulation der bildrekonstruierenden Linse durch Computer

-> Analyse der Ablenkung von Kristallen statt von einzelnen Molekuelen

• Richtung und Intensitaet -> Computerberechnung -> Interpretation

• komplizierte Produktion der Kristalle und Praeperation im chemischen Labor

• benoetigen: Koordinaten (x, y, z), Kurve und Intesitaet => Ablenkungsmuster

  -> Erhalt der (h, k, l) - Koordinaten und Intensitaet -> Umwandlung zu (x, y, z) - Koordinaten durch Berechnung (Bragg’sches Gesetz, Fourier-Transformation)

  => je groesser der Winkel, desto besser die Aufloesung

• Kettenverfolgung: elektronische Dichte -> Kettenverfolgung -> finales Model durch finden der AS-Reste/Ketten und Filtern nach Rueckgrad

  
  

• R-faktor: Uebereinstimmung zwischen beobachteten und berechneten Daten

  -> je geringer, desto besser (typischerweise: 20 %)

• Aufloesung: je hoeher die Aufloesung, desto bessere Details (je geringer Angstroem, desto besser)

• B-Faktor: Messen der thermalen Bewegung zur Erhalt von Energie, Mobilitaet und Stabilitaet eines Atoms

• Abweichung der Verbindungslaenge und Winkel vom Ideal (RMS Abweichung)

Betrachten der Atome als kleine Magnete -> Messen der Distanz zwischen den dynamischen Strukturen

-> moegliche Spins (nicht alle) -> Messen der abgegebenen Energie nach dem Einschalten des Magnetfelds

• Anpassung der Intensitaet, Winkel und Radiofrequenz moeglich

• normale Proteine: 10 x 300 Atome, abhg. von Protein

• COSY: kovalente Bindungen der Wasserstoffatome, typischerweise in der Seitenkette

• nuklearer Overhauser effekt: “Kontaktkarte”, Liste von Distanzen

=> Ableitung der Koordinaten und Strukturen

-> bei multiplen Datensaetze: Nehmen des Ersten

Betrachtung der Elektronen mit Energie (geringe Wellenlaenge)

• Kryo-/Plaque-Gefrieren der Probenloesung auf einem Gitter

• Feuern von Elektronene darauf -> verschiedene Konfirmationen des Proteins

• Erhalt eines 2D-Bilds

• Verarbeitung des 2D-Bilds durch Computer

-> Membranproteine extrem hydrophob -> auch Schleifen schwer zu kristallisieren => Entfernen dieser oder Einbau von Mutationen oder Zusatz von Eisenionen