SDS-Page und Westtern Blot

• Polyacrylamid bzw. Acrylamid/Bisacrylamid (15% für das Trenngel) - Bestimmt Vernetzungsgrad des Gels (je höher Anteil an Acrylamid/Bisacrylamid, desto engmaschiger das Gel)

• ddH2O

• Trenngelpuffer bestehend aus HCl/Tris und SDS ( —> Trenngel pH 8,8. —> Sammelgel pH 6,8)

• APS (Radikalstarter)

• TEMED (Katalysator)

• Fixierung (MeOH/Essigsäure) der Proteine an Gelmatrix

• Waschen (EtOH) um MeOH und Essigsäure zu entfernen (Verlangsamen Reduktion)

• Imprägnierung ( H2O,Formaldehyd, Na-Thiosulfat) um Gel wieder aufzuquellen, das dann Thiosulfat aufzunimmt - sorgt dafür, dass nur die Proteine und nicht das Gel selbst die Ag-Färbung annimmt

• Waschen (H2O) überschüssiges Thiosulfat weg

• Silberinkubation ( AgNo3 und Formaldehyd) —> Silber lagert sich an Proteine an

• Waschen (H2O) nicht gebundenes Ag weg

• Reduktion ( Na2CO3, Formaldehyd, Na-Thiosulfat) —> Silbercarbonat wird entfernt, bevor es sich auf Gel niederschlägt - Proteinspezifische Reduktion des Ag wird durch Auftreten der Banden sichtbar

• Waschen (H2O)

• Stoppen ( Kalte Essigsäure) —> Zugabe der Säure stoppt Reduktion

• Waschen (H2O)

• Großporig

• pH 6,8

• Proteine laufen schnell durch das Gel und sammeln sich an der Grenzschicht zum Trenngel

• SDS-markierte Proteine sammeln sich zwischen Folge- und Leitionen an

• engporig

• PH 8,8

• Dient der AUftrennung der Proteine nach ihrer Größe (bzw. Molekularen Masse)

• Chlorid-Ionen sind die Leitionen. Sind von vorn herein negativ geladen und klein und laufen daher Richtung Anode (Pluspol)

• Glycin-Ionen liegen als Zwitter-Ionen vor und sind daher nur schlecht in der Lage Strom weiterzuleiten und sind daher die Folgeionen

Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese

• anionisches Detergens

• Bewirkt die Denaturierung nicht-kovalenter Bindungen (Außer Disulfidbrücken)

• Maskiert EIgenladung der Proteine —> Ladung wird negativ

Behandlung der Proteine mit SDS und ß-Mercaptoethanol

• SDS: Denaturiert und Maskiert Proteine

• ß-Mercaptoethanol: Reduziert Disulfidbrücken

—> Hitzedenaturierung bei 95*C für 5min

• Fixierung der Proteine im Gel durch essigsaure Coomassielösung

• Bindet an basische Seitenketten

• Nachweisgrenze: 0,1-1ug Protein

• Proteine werden im Gel fixiert

• Inkubation in Silbernitratlösung —> Anlagerung von Ag-Ionen an negativ geladene Seitenketten der Proteine

• Entwicklung durch Zugeabe von Formaldehyd —> Ag-Ionen werden zu elementarem Ag reduziert —> Stellen an denen Protein ist, färben sich dunkel

• Nachweisgrenze: 0,1-1ng

• Blockieren (Milchpulverlösung)

• Waschen (TBST)

• Erstantikörperlösung

• Waschen (TBST)

• 2.Antikörperlösung

• Waschen (TBST)

• Detektion

• 2. Antikörper ist enzymgekoppelt

• Gebundenes Enzym: HRP (Horse Radish Peroxidase)

• HRP kann das Substrat Luminol unter Einfluss von H2O2 unter Lumineszenzentwicklung umsetzten