Replikation

1. 5’ -> 3’ Polymeraseaktivität

   • Polymerisation

2. 3’ -> 5’ Exonukleaseaktivität

   • entfernt falsch eingebaute Nukleotide am 3’-Ende (Proof reading)

3. 5’ -> 3’ Exonukleaseaktivität

   • Abbau doppelsträngiger DNA / RNA-Primer

   • Reperatur geschädigter DNA

   • vorausschauend

1. 5’ -> 3’ Polymeraseaktivität

2. 3’ -> 5’ Exonukleaseaktivität

DNA-Reperatur (SOS-Antwort)

1. 5’ -> 3’ Polymeraseaktivität

   • DNA-Replikation

2. 3’ -> 5’ Exonukleaseaktivität

   • Korrekturlesen

• bildet Ringklemme

  • ß-Ring aus zwei ß-Untereinheiten

  • gewährleistet Kontakt

• Holoenzym

  • Enzym mit Cofaktor

• Bakterien auf 15N pder 14N Medium herangezogen

  • jeweiliges Isotop über Basen in DNA eingebaut

• 15N Bakterien auf 14N-Medium umgesetzt

• 2 Runden vermehrt

• Auftrennung der jeweiligen DNA der 3 Generationen in einem CsCl-Dichtegradient

• Ergebnis weist semikonservative Replikation nach

5’ -> 3’ Richtung

• alpha-Phosphat, Zucker, Base

  • Radioaktive Markierung durch Einbau über DNA- Polymerase erfordert α- 32P-dATP

• Gamma und Beta-Phosphat als PPi abgespaltet

  • Radioaktive Markierung durch 5’- Phosphorylierung über eine Kinase erfordert Y- 32P-dATP

Entwindung des parentalen DNA-Stranges

• löst H-Brücken unter ATP-Verbrauch

• Mehrere spezifische bekannt

• generell an allen Reaktionen beteiligt, die mit der Ausbildung von Einzelstrangbereichen einhergehen

• verantwortlich für topologische Veränderungen der DNA

  • Lage und Anordnung der geometrischen Struktur im Raum

• Konzertriertes Öffnen und Schließen von DNA-Strängen durch Bruch

• bei allen Reaktionen, bei denen die DNA- Helix-Windungen sich ändern und Verdrillungen auftreten

  • Replikation

  • Transkription

  • Rekombination

Tyrosin

• übernimmt Phosphat

  • DNA geht auf

    • entwindet sich und löst Verdrillung

• Typ-1-DNA-Topoisomerasen

  • vorübergehender Bruch in einem DNA-Strang

    • Typ-1-A Untergruppe: Prokaryoten

    • Typ-1-B Untergruppe: Eukaryoten

• Typ-2-DNA-Topoisomerasen

  • spalten beide Stränge einer DNA

  • leiten intakten Doppelstrang durch die Lücke

  • schließen Spalt wieder

Sie synthetisiert RNA-Primers als Startpunkt für Pol III

• Synonym: DNA-G-Protein

Verknüpfen DNA-Fragmente

• schließen offene Phosphodiesterbindung im DNA-Strang

• erstellen kovalente abindung zwischen 3’-OH-Gruppe und 5’-Phosphatgruppe von zwei Stängen

DNA-Polymerase III

Initiation

• Identifizierung Replikationsursprung

• Entwindung, Stabilisierung DNA

  • Topoisomerase entdrillt

  • Helikase löst H-Brücken

  • Stabilisierungsbindeproteine

Elongation

• kontinuierliche und diskontinuierliche Synthese in 5’-3’

  • Primase liefert Primer

  • Pol III synthetisiert

• RNA-Primer-Abbau

  • durch Pol I

• Verknüpfung Okazaki-Fragmente

  • durch Ligase

Termination

• Abschluss Replikation

• Replikationskomplex löst sich von Matrize

• Start am artspezifischen oriC (origin of replication)

• Bidirektionale Replikation

  • Replikationsgabel in beide Richtungen

1000 Nukleotide pro Sekunde

DNA mit dem Isotop 15N, am schwersten

A

Y-32P-dATP (gamma)

• Abh. vom physiologischen Zustand

• Verfügbare Menge an DNA-A-Protein (bindet und initiiert)

  • Autoregulation: nach Bindung an Boxen im OriC bindet es als Repressor am dnaA-Gen

• Regulation über Methylierung am Adenin der GATC-Folgen

  • alte Stränge sind methyliert, neue nicht: keine erneute Initiation

  • vollständige Methylierung: erneute Initiation

• Terminationsstellen als Bindestelle für das Tus-Protein

  • Blockade der DNA-B-Helikase

    • Stopp der Replikationsgabel

      • Typ-1-Topoisomerase: Ende der Replikation, Trennung der neuen Zirkel

      • Typ-2-Topoisomerase: Weiterlauf der Replikation, Bildung von Catenanen

Mindestens 16

• G1-Phase

  • Transkription, Proteinsynthese

  • 2h - unendlich (G0)

• S-Phase

  • DNA-Replikation (DNA-Synthesephase)

  • 6-10h

• G2-Phase

  • Transkription, Proteinsynthese

  • 2-4h

• M-Phase

  • Verteilung der Chromatiden auf die Tochterzellen (Mitose)

  • 3-4h

• überschreiten des R-Punkts (Restriktion)

• Cyclin-abhängige Proteinkinasen (CDKs) regulieren Übergänge

  • aufeinanderfolgende Aktivierung leitet Zelle durch Zyklus

• Cycline in Wechselwirkung mit CDKs (positive Reguatoren)

• CDK Inhibitoren wirken als negative Regulatoren

• Phosphorylierung / Dephosphorylierung von CDKs

• origin of replication (Replikationsstartpunkt) wird vom origin recognition complex (ORC) erkannt

• ORC lagert sich unter ATP-Spaltung an

• ORC-DNA-Komplex führt zum Anlagern von Proteinen

  • CDC6 (cell division cycle)

  • Cdt1 (chromatin licensing and DNA replication factor 1)

  • MCM (minichromosome maintenance: ATP-abh. Helikase-Aktivität)

• angelagerte Proteine bilden Präinitiationskomplex, welcher anlagern von weiteren Proteinen erlaubt

• neue Proteine bilden CMG-Komplex (aktive replikative Helikase)

• Öffnen DNA-Strang

Durch Ringklemmen (Sliding clamp)

Eukaryoten

• PCNA (Proliferating cell nuclear antigen)

• aus 3 UE

• beladen durch Ladefaktor RF-C (replication factor C)

Prokaryoten

• ß-Ring der DNA-Polymerase III

• Verdrängungssynthese der Polymerase δ

  • löst H-Brücken, aber entfernt noch nicht Primer

• Bindung von RPA (replication protein A) stabilisiert ES-Primer

• Dna2 (Endonuklease) bindet und spaltet Primer ab

• Fen1 oder andere Nukleasen entfernen DNA-Überhang

• DNA-Ligase 1 verknüpft Fragmente

Single molecule real time sequencing

• vermehrter Proliferationsdruck auf Zellen (Teilungszwang)

• Krebs

  • Leukämien

  • Ösophaguskrebs

  • Brustkrebs

• viele Startpunkte

• Replikationsblasen

• Meist in beide Richtungen (bidirektional)

• Blasen vereinigen sich

• Regulation über die Anzahl der gleichzeitig aktiven Startpunkte

spezifische Bereiche mit erhöhter Replikation

• Bereiche die interne Replikationen durchlaufen

• lassen sich einheitlich färben (HSR, honogeneously staining regions) oder bilden abgespaltene Minichromosomen (double minute chromosome)

Problem bei linearen Molekülen:

• Polymerase braucht Primer zum Ansetzen

• wenn Primer am 5’-Ende entfernt wird, kann diese Lücke nicht vervollständigt werden da keine Polymerase ansetzen kann

• Es geht immer ein Stück DNA am Ende durch die Replikation verloren

• Telomere sind Sequenzwiederholungen am Ende der DNA, die bei Replikation zunehmend abgebaut werden, aber so (lange) keine Gene verloren gehen

• Telomerase in vielen Tumorzellen aktiv

  • Protein- und RNA-Bestandteile

  • Keimzellen, Stammzellen

• Proteinanteil und RNA-Anteil

• besitzt RNA-Template (Vorlage für Telomersequenz)

• Reverse-Transkription mittels Template

• RNA-Primer bindet an neuen Einzelstrangrest

• Polymerase vervollständigt

• Telomerase

• Retrotransposition

  • eigenes Transkript ist Template, nicht RNA

• Rolling circle

  • externer Zirkel

• Rekombinations-abhängige Replikation

  • Schwesterchromatid als Vorlage

• Telomerenschleife

  • auftrennung und Replikation in Schleife

• langsamere Synthese (100bp/s)

• Viele Startpunkte

• S-Phase Zellzyklus

• Zusätzliche Faktoren aufgrund DNA-Verpackung in Chromatin

  • Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1)

  • antisilencing funcion 1 (ASF1)

  • facilitates chromatin trancsription (FACT)

• Keine Konsensussequenz (übereinstimmende Sequenz) für Origin of Replication

• Lineare Moleküle erfordern Telomere und Telomerasen