den Begriff Immunhistochemie zuordnen können.
Methode der histopathologischen Diagnostik àAg in Zellen/Gewebeschnitten werden AK ausgesetzt und sichtbar gemacht
Prinzip der Immunhistologie erklären können
spezifische Erkennung von Antigenen in Zellen bzw. im Gewebe mit Hilfe von Antikörpern und der sichtbare Nachweis dieser Antigen-Antikörperreaktion
Beispiele für die Anwendung der Immunhistologie in der pathologischen Diagnostik
nennen können
· Identifikation des Tumortyps
· Klassifizierung von malignen Tumoren,Primärtumoren und deren Metastasen
· Identifikation von infektiösen Erregern (Spirochäten, Heliobacter pylori etc.)
verschiedenen Markersubstanzen benennen
a.) Enzyme oder
b.) Fluoreszenzfarbstoffe oder
c.) Nanogoldpartikel
den Einsatz von konjugierten Antikörpern mit Markersubstanzen begründen
können
Enzymkonjugierte Antikörper sind nicht direkt sichtbar. Sie müssen in einem weiteren Schritt
durch Umsetzung eines geeigneten Chromogens unter Bildung eines farbigen, unlöslichen
Endprodukts am Ort der Antikörper-Bindung sichtbar gemacht werden.
a) Enzyme à HRP ; AP (HRP+ DAB àbraun); AP+ Fast Red àrot
b) Fluoureszenz àFITC
c) Nanogold
‘konjugierte Antikörper‘ definieren
Antikörper binden in immunhistochemischen Methoden an das gesuchte Antigen. Zum
sichtbaren Nachweis werden Markersubstanzen eingesetzt. Diese Substanzen sind an den
Antikörper gekoppelt, man nennt sie deshalb auch konjugierte Antikörper.
das jeweilige Mikroskop benennen können, das den sichtbaren Nachweis liefert beim Einsatz von fluoreszenzkonjugierten,- enzymkonjugierten und nanogoldkonjugierten Antikörpern
Enzym àLichtmikroskop
Fluoreszenz àFluoreszenzmikroskop
Nanogold àElektronenmikroskop
die Enzyme für die immunhistochemischen Methoden nennen können.
HRP ; AP
beschreiben können, wo sich Antigene im Gewebe über die Immunhistochemie
nachweisen lassen
Zellmembran, Zellkern, Zytoplasma
Begriff ‘ Epitope’ erklären
Molekülabschnitt auf einem Antigen, ein Ag kann mehrere und verschiedene Epitope besitzen, gegen jedes Epitop kann ein spezifischer AK gebildet werden
den Aufbau des IgG-Moleküls beschreiben, Kreuzreaktivität, Affinität, Avidität erklären können
Aufbau:
A) Konstante und variable Regionen
B) Leichte und schwere Ketten
C) Disulfidbrücken
D) Scharnierregion
E) Antigenbindungsstellen
Kreuzreaktivität:
· Bindung eines Antikörpers an unterschiedliche Antigene, die identische
oder ähnliche Bindungsstellen (Epitope) verfügen.
Affinität:
Maß der Bindungsstärke einer einzelnen Bindung zwischen Antikörpern und Epitop (monovalente Bindung)
Avidität:
Gesamtmaß aller Affinitäten einer Ag-AK-Bindung
Ak bindet meistens bivalent
Vor,- und Nachteile der polyklonalen und monoklonalen Antikörper für die Immunhistologie benennen können
Art
Vorteile
Nachteile
Polyklonal
· Weniger anfällig bei Veränderungen am Epitop
· Polyklonale Seren sind preiswert in der Herstellung
· Unerwünschte Kreuzreaktionen (falsch positive Ergebnisse)
· Reproduzierbarkeit begrenzt durch Herstellungsweise
Monoklonal
· Erkennen nur ein Epitop eines Ag àsehr spezifisch
· Selten Kreuzreaktionen
· Keine chargenabhängigen Qualitätsschwankungen
· AK kann unbegrenzt hergestellt werden
· Wesentlich empfindlicher gegen Veränderungen des Epitops
· Teuer + aufwändiger in der Herstellung
die Aufgabe des Primärantikörpers in einem immunhistochemischen Nachweis
beschreiben können
spezifische Bindung an Ag
die Aufgabe des Sekundärantikörpers in einem immunhistochemischen Nachweis
Bindung an 1. Ak (+ Farbsignal markiert) + Nachweisreaktion
die Aufgabe des Tertiärantikörpers in einem immunhistochemischen Nachweis
Verstärkung des Signals, Bindung an 2. AK
alle genannten immunhistochemischen Nachweismethoden nennen können
1. Direkte Nachweismethode
2. Indirekte Nachweismethoden
- 2-Schritt Methode
- 3-Schritt Methode
3. Streptavidin-Biotin-Methode
4. Polymerkonjugat-Methode
die einzelnen Nachweismethoden beschreiben und vergleichen können
· Primärantikörper ist entweder mit einem Enzym oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff
· konjugiert.
· Die Signale durch die Antigen-Antikörper Bindung sind eher gering, weil nur ein konjugierter Primärantikörper an das Epitop bindet à Markierung im Vergleich zu anderen Methoden schwächer
· Es treten kaum unerwünschte Kreuzreaktionen auf, da keine Sekundärantikörper benutzt werden.
· Ein unkonjugierter Primär-Antikörper bindet mit dem zu suchenden Antigen. Anschließend wird
der Sekundär-Antikörper aufgetragen (mit Enzym- oder einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert)
· Verantwortlich für die Nachweisreaktion ist jetzt der konjugierte Sekundärantikörper!
· mehrere konjugierte Sekundärantikörper binden an den Primärantikörper àFarbsignal stärker als bei der ‘Direkten Methode‘.
· Nachweis erfolgt beim Einsatz von enzymkonjugierten Antikörpern über eine anschließende
Substrat-Chromogen-Reaktion
· Darstellung : Lichtmikroskop verwendet.
· Nachweis und die Darstellung erfolgt beim Einsatz von fluorozenzkonjugierten Antikörpern mit dem Fluoreszenzmikroskop
· konjugierten Sekundär-Antikörpern + mehrere konjugierte Tertiärantikörper mitderselben Markersubstanz
àweitere Steigerung der Anzahl der Markermoleküle am Ort des Epitops
· Farbsignal wird durch die Tertiärantiköprer noch einmal erhöht.
Wichtig : Beachtung der richtigen Spezies der Antikörper
· starke Affinität von Avidin bzw. Streptavidin zu Biotin
· Komplexbildung Streptavidin-Biotin mit HRP
· Starkes Farbsignal àviel Substratumsetzung
Inkubation
1.unkonjugierter Primärantikörper gegen das gesuchte Antigen
2.biotinylierter (Biotingekoppelter) Sekundärantikörper. Achtung: Biotin ist keine Markersubstanz!
3. an einen biotinylierten Sekundärantikörper bindet ein enzymkonjugierter Streptavidin-Biotin –Komplex.
3. Nachweis durch anschließende Substrat-Chromogenlösung, die eine Farbreaktion ergibt.
Falsch-positive Ergebnisse
· Durch endogenes Biotin (Gewebe) oder endogene Peroxidase àBlockierung notwendig
· nach Primärantikörper: Zugabe eines Polymers (Dextranmolekül), das mit Enzymen (meist Meerrettichperoxidase) und Sekundärantikörpern konjugiert ist
Inkubationsschritte:
1.unkonjugierter Primär-Antikörper gegen das gesuchte Antigen
2. + Polymer, konjugiert mit HRP(Meerrettichperoxidase) und dem passenden Sekundärantikörper.
3. Nachweis durch die anschließende Substrat-Chromogenlösung, die eine Farbreaktion ergibt.
Vorteil: Ein kompaktes Enzympolymer, an dem auf kleinstem Raum Sekundärantikörper und eine
große Anzahl reaktiver Enzymmoleküle konjugiert sind à hohes Farbsignal an der Stelle der Antigen-Antikörperbindung!
· Methode umgeht das Problem des endogenen Biotins, aber auch hier falsch positive Ergebnisse oder Hintergrundfärbung möglich , wenn im Gewebe endogene Peroxidasen vorkommen. àGewebevorbehandlung
den Einsatz von Sekundärantikörper und Tertiärantikörper in den
Nachweismethoden begründen können. ????
erklären können, welche(r) Antikörper innerhalb einer Nachweismethode für die
Nachweisreaktion verantwortlich sind
Methode
Antikörper
Direkt
Primär-AK
Indirekte 2- Schritt
Konjugierte Sekundär-AK
3- Schritt methode
Tertiär-AK
Biotin-Streptavidin
Biotinylierter Sekundär-Ak
Polymerkonjugat
Sekundär-AK mit Polymer
Die Signalwirkung (Sensitivität) der einzelnen Nachweismethoden begründen können
Schwach, da nur Primär-AK
Stärker als bei direkt da sekundär-AK
Nochmal stärker als 2- Schritt duch Tertiär-AK àstark
Sehr hoch durch Starke Biotin-Streptavidin-Bindung
Sehr hoch durch große Anzahl konjugierter Enzymmoleküle auf kleinstem Raum
das Untersuchungsmaterial für den immunhistochemischen Nachweis benennen können
v· Gewebestücke, in Formalin fixiert
· Gefrierschnitte
· Zellkulturen
Antigenmaskierung erklären können
Formalin: Vernetzung und Veränderung der Proteinstruktur àAg sing für Primär-AK nicht mehr zugänglich
die beiden Methoden der Antigendemaskierung benennen können
· Demaskierung durch Hitze: Kochen der fixierten Gewebeschnitte mit Citratpuffer (pH6,0)
im Dampfdrucktopf, im Autoklav bzw. Mikrowelle
· Demaskierung durch proteolytische Enzymen (Protease, Trypsin)
Die Einbettung und Schnittherstellung des Untersuchungsmaterials beschreiben
Paraffin
· Einbettung des Gewebes mit Paraffin àEinbettautomat, nicht heißer als 58°C um Immunreaktivität zu erhalten
· Paraffinblock wird geschnitten, 3 µm dick, auf OT gezogen, bei 37°C getrocknet
Gefrierschnitt
· Unfixiertes Gewebe + Gefriereinbettungsmedium àGefrierschnitte
· Trocknung auf OT àAufbewahrung bei – 20 °C
die Vorbehandlung der Gewebeschnitte benennen und erklären können
1. Entparaffinierung
· Xylol , Rehydrierung durch absteigende Alkoholreihe + A.D. àPuffer àWeiterverarbeitung
2. Antigendemaskierung
· Vernetzungen der Proteinstruktur durch die Fixierung
àReversibel durch hydrolytische Spaltung der
Methylenbrücken
· erfolgt bei allen ausgewählten Nachweismethoden, bei denen das Gewebe mit Formaldehyd fixiert wurde
3. Blockierung von endogener Enzymaktivität im Gewebe
· Blockpuffer auf endogene Enzyme im Gewebe um falsch positive Reaktionen zu vermeiden
4. Blockierung von endogener Biotinaktivität im Gewebe
· Blockpuffer auf endogenes Biotin um falsch positive Reaktion zu vermeiden
die nötigen Blockierungsschritte für die immunhistochemischen
Nachweismethoden beschreiben können????
den Ablauf einer indirekten 2-Schritt Methode mit Enzym,- oder
fluoreszenzkonjugierten Antiköpern an Paraffinschnitten beschreiben können
Fluoreszenz
2. Ag-Demaskierung
3. Blocken unspezifischer Bindungen
4. Primär-AK anti CD20 (monoklonal Maus)
5. Waschen mit PBS
6. Sekundär-AK: Ziege-Anti Maus konjugiert mit Fluoreszenzfarbstoff
7. Waschen in TBS
8. Eindecken
Der Einsatz von Negativ, -und Positivkontrollen erklären können
Negativkontrolle
· Überprüfung, ob der Sekundärantikörper unspezifisch bindet.
à Gewebeschnitt anstelle des Primärantikörpers mit einem Blockpuffer inkubiert
Positivkontrolle
· Überprüfung des Primärantikörpers (Spezifität und Sensitivität)
· Überprüfung an einem Schnitt an dem das gesuchte Antigen bereits nachgewiesen worden ist
Die falsch-positive und für falsch-negative Ursachen in immunhistochemischen Nachweismethoden beschreiben und erklären können.
Falsch-Positiv
Falsch-negativ
A.) endogene Enzyme wie Peroxidase:
· im Dünndarmgewebe in Mastzellen, Granulozyten, Erythrocyten etc.
B.) endogene alkalische Phosphatase
· im Dünndarmepithel, Knochengewebe, Nierentubuli, Leber, Endothelzellen
C.) endogenes Biotin:
· in Leber,-Gehirn,-Mamma,-Nierengewebe
D.) Unspezifische Bindungen durch:
-- elektrostatische Ladungen am Gewebe.
-- Kreuzreaktionen von Primärantikörpern.
-- Sekundär-Antikörper mit dem Fc-Teil auf den Zelloberflächen
Vermeidung durch Einsatz von Blocklösungen und F(ab)² Fragmenten!
E.) Unzureichende Waschritte mit TBS-Puffer: nicht gebundene Antikörper auf dem Gewebeschnitt
werden unvollständig entfernt und reagieren mit der eingesetzten Nachweismethode
alles bis D vermeidbar durch Blocklösungen
A.) Antigenverlust durch mangelhafte Fixierung und Einbettung
B.) Unzureichende Antigen-Demaskierung: Die Einhaltung der Temperatur, der pH-Wert
der Demaskierungslösung (Citratpuffer pH 6) und die Zeitphase sind wichtig.
C.) Falsche Lagerung der Antikörper: Manche Antikörper verlieren bei 4+C. schnell ihre Reaktivität,
deshalb sollten die Datenblattinformationen beachtet werden.
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