DNA-Klonierung
Definieren Sie „Klonierung“
Methode zur identischen Vervielfältigung von DNA-Fragmenten
DNA-Klonierung:
Was sind Vektoren und welche Aufgaben übernhemen sie?
„Genfähren“: Übertragung von DNA von einem Organismus zum nächsten
Welche verschiedenen Arten von Vekotren gibt es?
1. Plasmide
2. Bacteriophagen (Viren)
3. Cosmide
4. BACs = Bacterial Artificial Chromosome
5. YACs = Yeast Artificial Chromosome
Skizzieren Sie einen allgemeinen Aufbau eines Plasmides. Welche Funktionen haben Plasmide in Bakterien?
Antibiotikaresistenz: Einige Plasmide tragen Gene, die Bakterien gegen Antibiotika resistent machen
Vektoren: Plasmid
Welche Aufgaben übernimmt der Selektionsmarker?
in Bakterien: Antibiotikaresistenz —> nur Bakterien, die auch noch ein Plasmid besitzen sind antibiotikaresistent!
in Hefen: Autotropher Marker, z.b. Enzym des Aminosäurestoffwechsel
Welche Aufgaben übernimmt der Replikationsursprung (ORI = Origin of Replication) ?
Startpunkt der Replikation,
sorgt für die autonome Vermehrung/Replikation des Plasmids,
die Stärke des Replikationsursprung regelt die Kopienzahl des Plasmids (bis zu 500 Kopien pro Bakterien-Zelle möglich, high copy)
Welche Aufgaben übernimmt die multiple Klonierungsstelle (Multiple Cloning SITE MCS)?
Region in der viele Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme liegen;
unicale Schnittstellen, nur hier und nirgends sonst im Plasmid vertreten:
- Fremd-DNA wird hier hinein kloniert.
Eingefügte DNA-Fragment-Länge: bis 5 kB
Manche Vektoren enthalten auch noch Promotor zur Expression des eingeschleusten Gens
Wie unterscheidet sich ein Plasmid, der als Klonierungsvektor benutzt wird von natürlicherweise in Bakterien vorkommenden Plasmiden?
Vektor = Genfähre
In dieses Plasmid wurde Fremd-DNA eingebaut.
Was sind Restriktionsenzyme? Welche Funktion haben sie in Bakterien?
Restriktionsenzyme = Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen hydrolysieren (= spalten sie innerhalb einer bestimmten Frequenz) DNA
Restriktionsenzyme sollen Bakterien vor eindringender Fremd-DNA schützen
Warum zerschneiden die Restriktionsenzyme nicht die chromosomale DNA in den Bakterienzellen?
Weil sie nur unmethylierte DNA-Fragmente zerschneiden
chromosomale DNA ist methyliert
Wenn ein Restriktionsenzym BamH I heißt, welche Aussage können Sie dann über das Enzym treffen? Welche Erkennungssequenz hat dieses Enzym?
Durch die Spaltung mit Restriktionsenzymen entstehen DNA-Enden. Je nach Enzym können bei der Spaltung drei Typen von DNA-Enden entstehen.
Das Enzym erkennt eine bestimmte DNA-Sequenz und schneidet an dieser Stelle den Plasmidring eines Bakteriums . Erkennungssequenz GGATCC
Bam= Bakterium
Stamm= H
I= erstes Enzym
Welche 3 Klassen von Restriktionsenzymen gibt es?
Welcher Typ von Restriktionsenzymen wird in der Regel bei molekularbiologischen Arbeiten verwendet?
Typ II
Wenn in einem linearen DNA-Molekül 4 Restriktionsschnittstellen für ein bestimmtes verwendetes Restriktionsenzym vorhanden sind, wie viele Fragmente sind nach der Auftrennung in einem Agarosegel zu erkennen?
5 Fragmente
Beschreiben Sie kurz die Klonierung eines Gens. Welche Enzyme werden dafür benötigt?
Worauf müssen Sie bei der Wahl der Bakterien achten, in die Sie einen Vektor vermehren wollen, in den Sie ein Stück DNA eingebracht haben und der ein Fragment des lacZ-Gens enthät – zur späteren Blau-Weiß-Selektion?
Plasmid enthält lacZ-Gen, das für α-Fragment der β- Galactosidase kodiert (ω-Fragment fehlt noch; kommt aus Bakterium)
Das vollständige Reportergen für β- Galactosidase spaltet X- Gal, was zur Bildung von Indigofarbstoff führt
Die MCS befindet sich im Reportergen des Vektors
Bei Einbau des Inserts wird das Gen unterbrochen = weiße Kolonien.
Wird kein Insert eingebaut, Genprodukt = blaue Kolonien
Dies muss dabei beachtet werden:
Bakterienstamm muss LacZ-Gen im Vektor komplementieren, d.h. besitzt das ω-Fragment der ß- Galactosidase besitzen (Genotyp- Beschreibung lacZΔM15
Bakterien enthalten unterschiedliche Selektions-, Methylierungs- und Restriktionssysteme
Erklären Sie kurz den Begriff „rekombinante DNA“.
sind DNA-Moleküle, die künstlich durch das Zusammenfügen von DNA-Fragmenten aus verschiedenen Quellen erzeugt wurden.
Prozess wird als DNA-Rekombination bezeichnet
kann durch verschiedene Techniken:
wie Restriktionsenzymverdau und
Ligationsreaktion durchgeführt werden.
Was sind „Nachteile“ von Bakterien bei der Expression von Fremdgenen
Bakterien haben kein Spleißsystem
Sehr große Polypeptide werden oft nicht synthetisiert
Glykosylierung und Phosphorylierung der Proteine ist oft nicht entsprechend
Häufig werden daher Hefen z.B. Saccharomyces cerevisiae verwendet
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