AK
BCA-Assay: Erklären Sie kurz die Funktionsweise des BCA-Assays (Teilreaktionen ohne
Strukturformel) Was ist das Ziel des BCA-Assays?
In alkalischer Lösung werden zweiwertige Cu-Ionen reduziert, Protein und reduziertes
Cu sind proportional zueinander → Chelator Bicinchoninsäure komplexiert Cu und
wird violett → Wellenlänge von 562 nm absorbiert
o Ziel: Menge an Protein in Probe herausfinden, damit überall gleich viel aufgetragen
wird auf das Gel für die PAGE
SDS-PAGE: Nennen Sie die fünf wichtigsten Inhaltsstoffe des Probenpuffers sowie knapp deren Funktion
o SDS = Sodium-Dodecylsulfat – Eigenladung der Proteine überdecken, konstantes
Masse/Ladungsverhältnis, unabhängig der funktionalen Reste
o BME - Reduzierend: DTT = Dithiotreitol oder beta-Mercaptoethanol, spalten
Disulfidbrücken → Tertiärstruktur wird aufgelöst, Denaturierung/Linearisierung der
Proteine → MW am Ende ermittelbar (Primärstruktur)
o Glycerol - relativ dicht → erhöht Dichte, Probe sinkt besser in Probentasche,
gleichmäßiger
o Bromphenolblau - Visualisierung der Probe, anionisch, in Elektrophorese vorne →
bildet Lauffront und zeigt an, wann das Gel fertig ist
o Tris/HCl pH 6,8 - Puffer
SDS-PAGE: Ihr Polyacrylamidgel polymerisiert schlecht/ungleichmäßig. Nennen Sie drei mögliche Fehlerquellen
o Nicht ganz luftdicht gewesen – Sauerstoff fängt Radikale ab und verhindert
Polymerisation
o Falsches Verhältnis von Acrylamid, Bisacrylamid
o Zu wenig TEMED
SDS-PAGE: Sie erhalten ein Gel ohne jegliche Banden. Nennen Sie 2 mögliche Ursachen
o Fragmente zu groß/Poren zu klein
o Proteine verklumpen, bevor sie aufgetrennt werden können
Western Blot: Welche 2 Methoden gibt es, alle Proteine auf der Membran für die Normalisierung anzufärben? Nennen und kurz Mechanismus beschreiben.
o Zur Korrektur von nicht-sample assoziierten Effekten auf die Signalstärke
o Auf Housekeeping-Protein (HKP)
▪ HKP-Menge als Background abziehen von Menge an Protein in Lane???
▪ Overloading: Zielprotein und HKP müssen im „dynamischen Range“ des
Assays liegen
▪ Kein universelles HKP: Mengen abhängig von Zelltyp, Krankheitsstatus,
Probenvorbereitung, …
▪ Z.B. beta-Aktin, GAP-DH, Tubulin, …
o Auf Gesamtprotein (TP)
▪ Menge an Protein in Lane durch Gesamtmenge an Protein teilen
▪ Funktioniert über alle Gewebetypen hinweg
▪ Overloading geringes Problem, da die meisten Gesamtproteinfärbungen
einen weiten „linearen Bereich“ aufweisen
▪ Unzureichende Sensitivität bei geringen Gesamtproteinmengen (heute aber
schon im unteren µg-Bereich möglich)
WB: Welche Alternative gibt es zur Normalisierung? Bsp. Und wichtige Voraussetzungen nennen.
o Ich denke es ist Gesamtprotein-Normalisierung gemeint, somit wäre die Alternative
Normalisierung auf Housekeeping-Protein, Bsp. GAP-DH und Voraussetzung ist die
gleiche dynamische Range des Assays
WB: Bestandteile und Funktion des Lysepuffers:
o THB-C Puffer mit
▪ Saccharose – stabilisiert und für Isotonie
▪ EGTA- cheliert zweiwertige Kationen, somit Proteasen inaktiv
▪ Tris/HCl - pH 7,4
▪ Complete Proteinaseinhibitormix 1x – damit Proteine intakt bleiben
WB: Welche Methode wurde zur Detektion aller Proteine benutzt? Erklären Sie.
Stainfree (Trihaloverbindung)
Vorteil: Gel kann wiederverwendet werden
• Trichlorethanol verwendet
• Schon beim Gelgießen hinzugefügt → beim UV-Beschießen, bindet kovalent an Tryptophan →
Eigenfluoreszenz des Proteins wird erhöht durch einen Shift im Exzitations- und Emissionsspektrum
• Nachteil: müssen Tryptophan enthalten
Wie schwer ist APP?
120kDa
Wie schwer sind die UE von GAPDH?
36 kDa
Warum ist GAPDH so eine gute Kontrolle?
House-keeping gene
konstante Expression (über Zelltypen, Zellzyklus, unabhängig vom Alter, Geschleecht, und Treatment darf auch keinen Einfluss aufs Housekeeping gene haben)
Einfach detektierbar
Tween in PBS why?
Gegen unspezfische Bindungen
HRP - Detektion der Proteine auf der Membran
Horse radish peroxidase:
Luminol als Substrat
setzt Photon frei (im blauen Bereich)
CCD KAmera visualisieren
größere Signalverstärkung und kontinuierliche Signalgenerierung
Warum sind positiv und negativ Kontrollen wichtig?
damit man weiß, ob Ab spezifisch gebunden haben
negativ Kontrolle : entweder KO Maus für das Protein oder Protein vorher ausfällen
positiv Kontrolle: Ein paar µg des Proteins extrahieren
Milchpulver
Mischung aus Proteinen
günstiger
hat Kasein —> Phosphorylierungen —-> unspezfische Bindungen von Abs
weniger background noise
BSA
Ein Protein:
Bovine serum albumin
teuer
viel noise (blockiert schlecht)
THB-C (Tris-basiert) im LYsepuffer - why?
Nahe IEP (Isoelektrischer Punkt), damit Proteine löslich bleiben, pH 7- 9 (physiologisch)
• Je weniger mild der Lysepuffer, desto mehr Organelle aufgelöst
• Enthält Saccharose, EGTA und Tris/HCl pH 7,5 und Complete
Proteinaseinhibitormix 1x
Aufschluss der Zellen Methoden
Mechanisch: kühlen!
o Zerschneiden (große Proben, Pflanzen/Zellteile, Fett
abschneiden, …)
o Scherkräfte → Zellorganellen bleiben erhalten
o Ultraschall (hochfrequente Wellen, funktioniert nur, wenn
schon vorher zerkleinert)
o Bead Mill
• Enzymatisch (z.B. Bakterien)
• Osmotisch (Salz oder Zucker, hohe Konzentration, Platzen durch
osmotischen Druck)
Proteinbestimmung:
▪BCA-Test (Bicinchoninsäure)
In alkalischer Lösung werden zweiwertige Cu-Ionen reduziert, Protein
und reduziertes Cu sind proportional zueinander →Chelator
Bicinchoninsäure komplexiert Cu und wird violett → Wellenlänge von
562 nm absorbiert
Homogenisierung:
o mit THB-C Puffer: Saccharose, EGTA, Tris/HCl pH 7,4,
Complete Proteinaseinhibitormix 1x
o Testen von 10 sec und 40 sec Bead Ruptor zum
Homogenisieren a 2 Zyklen, zentrifugieren und Überstand
abnehmen, 1:20 und 1:50 Verdünnung benutzen
o Doppelbestimmung, Platte bei 56°C inkubieren →
beschleunigt die Reaktion der Enzyme?, auf RT abkühlen
lassen, weil immernoch kurzzeitig die Reaktion weiter abläuf
Biuret-Reaktion
—> da im WB die Proteinmenge pro Tasche möglichst ähnliche Proteinmengen vorhanden sein sollen
• Mögliche Nachteile: spezifische Range, Störanfälligkeit (Reaktion auf Reagenzien etc.), Vergleichsprotein, z.B. BSA, und immer Blanc- Messungen durchführen, um ungewünschte Reaktionen auszuschließen
• Auch möglich: reines Protein messen, absorbiert bei ca. 280 nm, abhängig von Extinktionskoeffizient, sehr reine Lösung muss vorhanden sein
Bradford-Test
Coomassie bindet an Proteine → Wellenlänge verschoben
Nachteil: Laugen und manche Detergentien können die Reaktion stören
• Protein-Identifizierung
o Größe→Gelelektrophorese
o Ladung → isoelektrische Fokussierung
o Sequenz → Gen- und Proteinsequenzierung
o Identität → Identifizierung mit Antikörpern
o (Re)Aktivität → enzymatische Assays
o Interaktion→Co-Immunpräzipitation
o Struktur → NMR, IR-Spektroskopie
Ziel der Homogenisierung?
Proteine aus dem Gewebe lösen, um sie im Gel individuell laufen lassen zu können
Vorgehen Homogenisierung
Hemisphären mit THB-C Lysepuffer auffüllen
Hemisphären im Bead Ruptor homogenisieren Ø Sample 1 für 20 s, Sample 2 für 80 s
Proben zentrifugieren
Überstand behalten, Pellet verwerfen
Bestandteile THB - C Puffer und Funktionen
Methoden: Homogenisierung
• Ultraschall (mechanisch)
• enzymatisch
• osmotisch
Was machen wir? Homogeniserungsmethode
mechanischer Aufschluss der Zellen durch Scherkräfte im Bead Ruptor
Vorteil: viele Proben gleichezeitig homogenisieren (36 Stück)
relativ wenig Wärme
man muss nichts groß desinfizieren
Potter
Glaswand und Teflonstempel —> dazwischen ist unsere Probe —> Zerdrücken manuell und so homogenisieren
Ziel des BCA-Assays?
Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben
Wie funktioniert BCA Assay?
Reagenzien: BCA (Bicinchoninsäure) und Kupfer(II)-Sulfata —> 50:1
• Reaktion 1: Peptidbindungen (und einige Aminosäuren) reduzieren Cu2+ zu Cu+
—> 96-well-Platte bei 65°C inkubieren!
• Reaktion 2: BCA und Cu+ bilden violette Farbkomplexe (562 nm)
Was ist der Standard beim BCA Assay?
indirekte Methode: es wird ein Protein-Standard bekannter Konzentration benötigt —> BSA (Bovine Serum Albumin)
Acrylamid - was macht es?
Ist für die Quervernetzung des Gels zuständig
Ammoniumpersulfat —> Radikalstarter
TEMED —> Katalysator
Stainfree
TCE (ist eine Trihaloverbindung) und Tryptophand reagieren unter UV Beschuss —> es werden zwei mal HCl abgespaten und das entsehende Molekül fluoresziert
TEMED steht für?
Tetramethylendiamin
Was sind die SDS Pufferkomponenten?
SDS : Lämmli-Gel - Was passiert im Sammelgel?
pH 6.8
Glycin bei 6.8 nahe isoelektrischem Punkt
Glycin ist Folgeion (hat eine hohe Feldstärke)
Glycin hat eine geringe elektrophoretische Mobilität
Chlorid sind die Leitionen (geringe Feldstärke)
Feldstärkegradient führt zu Stacking-Effekt → werden nach Mobilität aufgelöst aber werden von Glycin vorgeschoben und Laufen nicht weiter als bis zu den Chloridionen während im Sammelgel→deutlich schärfere Banden durch Vor-Auftrennung
SDS : Lämmli-Gel - Was passiert im Running gel?
pH 8.8
es gibt keine Folge- und Leitionen
Glycin ist klei also läuft es nach vorne (ist jetzt btw auch negativ geladen, sonst wurde es auch nicht zur Anode laufen)
Proteine werden nach der Größe getrennt
Kleinere Poren → größere Auftrennung → Glycin wird nicht beeinflusst und läuft mit dem Leition vorne weg, daher in homogenem Elektrischem Feld statt Feldstärkegradient→ Auftrennung aufgrund von Größe im Gel→Größere wandern langsamer
Bromphenolblau
klein anionisch, läuft schneller als kleinste Proteine, wenn aus dem Gel gelaufen dann war Gelelektrophorese vollständig
PVDF Memmbran - wofür steht es und was gibt es für Vor- und Nachteile?
Polyvinylidenfluorid = PVDF
Vorteile:
hohe Protein Bindekapazität —> Sensitivität
chemische/thermische/mechanische Beständigkeit
Nachteile:
Hintergrund noise
PVDF MUSS MIT METHANOL AKTIVIERT WERDEN
Welche Bande schaut man sich bei GAPDH an? Und wofür steht das?
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
nur die oberste Bande
Ist der Ab für APP polyklonal oder monoklonal?
Polyklonal
Ist der Ab für GAPDH polyklonal oder monoklonal?
monoklonal
Wenn man große und kleine Proteine analysieren will, kann man welches Gel benutzen?
Gradientengel:
große Poren oben und kleine Poren unten
d.h. man trennt die die großen Proteine zuerst auf und dann die kleinen Proteine
Was für eine Beziehung hat die Prozentualität der Gele?
Logarithmische Beziehung
Was für eine Beziehung haben Laufweite und Proteingröße zueinander?
Alternativmembran?
Nitrozellulose weil es billiger ist
Alternative zur Stainfree nennen und erläutern
Ponceau S :
roter Azosäurefrabstoff —> bindet an positiv geladene Aminogruppen der AS
aber färbt nur Protein nicht das Gel
Coomassie (organischer Farbstoff) —> Färbt nur Protein an und man würde zweil Gele brauchen, weil es nicht mehr geblottet werden kann
Detektion der Proteine auf der Membran - andere Methode ohne HRP
Avidin und Biotin binden stark aneinander → Fluoreszenzmakiertes Streptavidin oder enzymgekoppeltes Streptavidin→viel mehr Enzymgekoppeltes Signal
Freigesetztes Photon: im Imager mit CCD-Kamera visualisieren
Warum Acrylamidgele unter O2 Abschluss?
Unter Sauerstoffabschluss, da O2 Radikale abfangen kann und das Gel nicht auspolymerisieren würde
Agarosegele im Gegensatz dazu vertikal, da der Sauerstoff die Polymerisation hier nicht beeinträchtigt
Warum geben wir Isopropanol dazu?
Isopropanol, reagiert damit nicht und beeinflusst die Polymerisation nicht→schottet Sauerstoff ab und verhindert Kapillareffekt
Gelsysteme nennen und bisschen erläutern
GAPDH - welcher Ab ist das?
rabbit anti GAPDH
APP - welcher Ab ist das?
mouse anti APP —> M3.2
warum sind Positiv- und Negativkontrollen wichtig?
Damit man weiß, ob die AK spezifisch gebunden haben
AK:M3.2 und anti-GAPDH als primary antibody und anti-
mouse-HRP und anti-rabbit-HRP als secondary antibody
Negativ-Kontrolle: EntwederKO-Maus für dieses Protein
oder Protein vorher ausfällen
o Positiv-Kontrolle:Paar μg des Proteins extrahiert
„Strippen“ der Membran möglich: Detektieren des gleichen Blots mit mehreren Antikörpern
Fall 1 : Unterschiedliche Spezies Erstantikörper: es reicht nur die HRP des SekundärAKs mit NaN3 zu zerstören
Fall 2: Gleiche Spezies des Erstantikörpers: komplettes „Stripping“: Denaturierung der gebundenen AK mit saurem/basischen pH, Wärme, Mercaptoethanol, Detergenzien, ...
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