WiFo Praktikum

• Hämatoxylin-Eosin-Färbung

• Hämatoxylin färbt saure/ basophile Strukturen blau (DNA, rER)

• Eosin färbt basische/ acidophile Strukturen rot (Plasmaproteine, Mitochondrien, sER, Kollagen, Keratin)

Defekte DNA Mismatch Reparatur führt zu MSI und einem erhöhtem Krebsrisiko.

Hohe Mutationsrate und Neoantigene führt oft zur hohen Immunaktivierung.

Wird autosomal dominant vererbt

junges Erkrankungsalter

• Färbung dient zur Unterschiedung Gewebestrukturen in Lichtmikroskopie

• Bläuen: pH-Wert erhöhen zB durch Leitungswasser. Zellkerne werden blauviolett

1. MSI-Analyse von Tumorgewebe / Immunhistochemische Färbung MMR Proteine

2. Keimbahnsequenzierung Blut

MS im Intron: alternatives splicing

Exon: translationaler Frameshift (-> Frameshift peptides)

UTR: veränderte Stabilität des Transkripts

kurze DNA-Sequenzen, die sich bis zu hunderte von Malen wiederholen und tausendfach im Genom verteilt sind. Infolge der repetitiven Natur von Mikrosatelliten kommt es dort bei der Replikation häufiger zu sogenannten Mismatch-Fehlern (wegen slippage der DNA Polymerase)

MLH1 Protein dimerisiert mit PMS2 Protein und koordiniert das binden von DNA helicase + ssDNA binding protien + DNA polymerases.

MSH2 Protein dimerisiert mit MSH6 Protein um Mismatches via “sliding clamp” zu identifizieren

Serin/Threonin Kinase B-Raf steuert MAP-Kinase-Signalweg (Zellteilung)

Protoonkogen (braucht nur 1 aktivierende Mutation!)

Ist in der Hälfe der Melanomen mutiert

Mutation führt zur Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren

Mucosa:

• epithelium with goblet cells (crypts)

• lamina propria

• muscularis mucosae

Submucosa

Muscular layer

Serosa / fatty tissue

Mucin bubbles

small cell nuclei at the walls of crypt

gutartiger Tumor aus Drüsengewebe oder Schleimhaut

im Darm: häufig in Form von Polypen

Bei Lynch Syndrom gibt es eine nachgewiesene Keimbahn Mutation (betrifft jede Zelle im Körper)

HNPCC ist die Häufung von Tumoren in der Familie

→ Jedes Lynch Syndrom ist eine HNPCC aber nicht jede HNPCC ist ein Lynch Syndrom

hereditäre non-polypöse Kolonkarzinom

321-Regel (Amsterdam Regel): 3 Fälle in der Familie über 2 Generationen (direkte Linie) mit 1 Fall unter 50

MMR Defizienz → MSI → Antigene → hohe Immuninfiltration → gute Prognose

Ovarien, Dünndarm, Galle, Leber

→ MSI ist eine Multiorganerkrankung

• Checkpoint Inhibitoren: anti PD-1 und anti CTLA-4

• Tumor Vakzine: 

  • Vor allem für Melanome und Glioblastome → nehmen häufig vorkommende Epitope

  • Kloor: prophylaktische Impfung gegen Lynch

• CAR-T-cell therapy

• T cell priming

• Bispecific T cell activators

• Pro-Tags

Die Fragmentlänge von Tandem repeat Regionen variiert

Nachweisbar zB durch Gelelektrophorese → Bei MSS Patienten 1-2 Banden (je nach Allel ob homozygot oder heterozygot), bei MSI Patienten viele Banden

CAR T cells = chimeric antigen receptor T cells

zerstören B-Zellen

1. T-Zellen vom Patienten nehmen

2. Gentransfer (Virus Vektor mit chimären Antigen Rezeptor gegen CD19)

3. Klonale Expansion CAR-T-Zellen

4. Chemotherapie

5. Infusion mit CAR-T-Zellen

• nur für B-Zell-Leukämien

• Target: CD19 und/oder CD20 (auf B-Zell Vorstufen aber nicht auf Stammzellen)

• auch gesunde B-Zell Vorstufen werden zerstört aber man kann ohne B Zellen leben

• nicht für solide Tumoren:

  • erschwerte Bedingungen in der Tumor Umgebung zB Hypoxie

  • schwerer zugänglich weil nicht im Blut (müsste schon direkt in den Tumor injizieren)

  • Tumor rekrutiert Helfer T-Zellen um die Immunantwort auszuschalten

  • solide Tumoren sind sehr heterogen und es gibt meistens kein offensichtliches Target (meistens finden sich die Targets auch im Normalgewebe wieder → starke UNW)

Autoimmunkrankheiten durch hyperaktives Immunsystem → Colitis (Entzündung des Colons), Dermatitis, Thyrroiditis, geschwächte Leberfunktion

Behandlung durch IL-6 Rezeptor Blocker

ß-Galactosidase

Zelle wird durch DNA Schädigung in Seneszenz getrieben → die vielen genetischen Mutationen erschweren ein Targeting der seneszenten Zelle durch Medikamente

zb:

• BRAF

• KRAS

• ABL1

• MYC

zb:

• p53

• Rb

• APC

wird durch DNA Schäden von seinem Inhibitor freigesetzt

• aktiviert DNA Reparaturproteine

• unterbricht den Zellzyklus 

• leitet bei nicht reparierbaren DNA Schäden Apoptose ein

baut beta-catenin ab. Ohne APC ist beta-catenin stabilisiert, was den Zellzyklus aktiviert.

1. Elimination (von präkanzerose Zellen) → extrinsic tumour suppression

2. Equilibrium → tumour dormancy and editing (Gleichgewicht zwischen Zellteilung und Immunüberwachung)

3. Escape → tumour growth promotion

Die Tumorantigene müsen naiven T-Zellen durch antigenpräsentierende dendritische Zellen präsentiert werden

Immuninfiltration

-> weniger “Budding” -> Lokalisierung des Tumors

→ Klare Korrelation zwischen lymphozytärer Infiltration und Überleben der Patienten nach Chirurgie

Bei Tumorsuppressorgenen müssen beide Genkopien inaktiviert werden um einen Effekt zu haben. Der first hit kann vererbt werden. Vererbung des first hits ist autosomal “dominant”, auf zellulärer Ebene zwar rezessiv, aber die eine Mutation reicht für das erhöhte Krebsrisiko.

Mutation, Überexpression & posttranslationale Modifikationen

• Zellwachstum

• Immortalisierung

• Unterdrückung Apoptose

• Immunevasion

• Angiogenese

• Zellinvasion, Metastasierung

One non-functional (or attenuated, semi-functional) APC gene copy. -> Darmwand ist mit Polypen bedeckt. 2nd Hit führt über beta-catenin zu unkontrollierten Zellwachstum. Darmkrebs kann nicht vermieden werden. Chirurgische Entfernung Dickdarm.

• MMR

• Base excision repair (single strand breaks, deamination, alkylation)

• Nucleotide excision repair (cyclopurine, UV thymine dimers)

• homologous recombination (ds break, accurate mechanism using template) 

• non-homologous end joining (ds break, direct ligation)

• (Polymerase proofreading)

• junges Erkrankungsalter

• familäre Häufung

• viele Primärtumoren

Kompetitive Hemmung der Rezeptoren die die Selbstlimitierende Wirkung des Immunsystems über T Helferzellen zuständig sind

PD-1 und CTLA-4 sind die häufigsten Targets

Wnt signaling pathway!! (zB APC oder NKD1) 

p53

TGF-beta

• gutartig/ benigne: kohäsives, expandierendes Wachstum keine Infiltration von umliegendem Gewebe

• semimaligne: infiltrierend, keine Metastasierung

• bösartig/ maligne: invasiv, infiltrierend, Fähigkeit zur Metastasierung, häufig schnelles Wachstum

karzinome: epithelgewebe

sarkome: mesenchymales Gewebe

lymphome: leukämien

neuroektodermale: Gliome, neuroblastome, …

Partikel, die von einer Lipid-Doppelschicht umgeben sind und natürlich von Zellen freigesetzt werden (aber selber keine Fähigkeit zur Replikation haben).

EVs werden bei allen Zellen sezerniert: normale und Tumorzellen

EVs spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation indem sie verschiedene Cargo Moleküle transportieren: DNA, RNA, Proteine, Lipide

EVs haben verschiedene Rollen in unterschiedlichen Phasen der Karzinogenese und sie beeinflussen verschiedene onkogene Prozesse wie Angiogenese, Metastasierung und Immunsuppression

1. Immortalisierung

2. Proliferation, Transformation

3. Malignes Wachstum: Invasion, Infiltration

Tumorspezifisches Cargo zB

• tumorspezifische genomische DNA

• Onkogene

• tumorspezifische Mutationen zB in

  • KRAS

  • BRAF

  • TP53

• Aus dem Plasma isolierte EVs beinhalten DNA mit dem MSI-Phänotyp

• EVs sind einfach aus Körperflüssigkeiten zu isolieren: Plasma oder Urin

• minimally-invasive and repeated sampling

  
  

Gen, welches Teil des normalen Genoms (sog. Proto-Onkogen) ist, trägt infolge von aktivierender Mutation (Bsp. KRAS, BRAF) oder Fehlregulation (c-ABL, c-myc) zur Tumorentstehung bei.

„gain of function“, spezifisch

Gen, das für ein Protein kodiert, welches das Zellwachstum kontrolliert. Inaktivierende Mutationen können zu Tumorentstehung führen (Bsp. Rb, p53).

„Loss of function“, unspezifisch

Verhältnis von Mutationen, welche die Aminosäuresequenz ändern (n = nicht-synonym) zu neutralen Mutationen (s = synonym).

Es zeigt an ob positive oder negative Selektion vorliegt

• Sekretion von immun-suppressiven Zytokinen (TGF-ß, IL10)

• Weniger Antigen-präsentierende Moleküle (B2M Mutation)

• regulatorische T Zellen

• verminderte Expression der relevanten Antigene

• Induktion von Apoptose von cytotoxischen T Zellen durch Fas-L (Counter attack model)

• Regulatorische T Regs blockieren spezifische cytotox T Zellen

Bei Krebszellen beobachtete Veränderung des Glucose Stoffwechsels

Selbst bei ausreichender Sauerstoffversorgung: Glycolyse mit anschließender Milchsäuregärung (statt Citratzyklus in Mitochondrien)

gesunde Zellen machen diese Verstoffwechselung nur bei Sauerstoffmangel (anaerobe Glycolyse), Krebszellen machen sie immer (aerobe Glycolyse)!

Diese Art der Energiegewinnung ist sehr ineffizient, weswegen die betroffenen Krebszellen einen erhöhten Glukose-Verbrauch haben. In 70 % der Krebsfälle konnte eine Überexpression Glykolyse-relevanter Enzyme und Membrantransporter nachgewiesen werden.

wichtig bei dsDNA break repair

EV DNA may show great potential to be used as biomarker for various clinical applications e.g. early cancer detection and therapy monitoring in MSI cancer patients

• HPV

• EBV

• Hepatitis B

• MMR Lynch

• BRCA Brustkrebs

• intragenische Mutation

• chromosomale Translokation

• Amplifikation

Die Positionen und Art (SNV, Indel…) von Mutationen in einer Tumorzelle geben Aufschluss über Krebsursprung, Evolution, mögliche Therapien und Prognose.

• Punktmutation (KRAS, BRAF)

• Genamplifikation (EGFR)

• Chromosom Translokation (BCR-ABL, c-myc)

Invasives Wachstum aber keine Metastasierung

zb Desmoide, Basalkarzinom

Inzidenz = Häufigkeit des Auftretens von Neuerkrankungen

Prävalenz = Zahl der Krebspatienten

Gleiche Inzidenz, erhöhte Prävalenz

L1 Oberflächenprotein des HPV

E6 und E7

Löst Zervixkarzinome aus

Charakteristische Kombinationen an Mutationstypen, die aus spezifischen mutagenen Prozessen entstehen zB DNA Replikationsfehler

Autosomal dominant

• TSA kommen nur in Tumoren vor

• TAA kommen auch in gesunden Zellen vor aber sind in Tumorzellen differenziell exprimiert

• TSAs werden direkt als nicht körpereigen erkannt —> gut für Immuntherapie

18F-Deoxyglucose ist ein radioaktiver Marker

Warburg Effekt: erhöhte Glucose Aufnahme von Tumorzellen: die Verteilung der 18F-Deoxyglucose speigelt die Verteilung der Glucoseaufnahme im Körper wieder —> Lokalisation der Tumore im Körper

• FAP: durch APC Mutation, jedes Polyp ist eine Visualisierung des 2nd Hit Modells

• HNPCC: durch dMMR und darauffolgende MSI

Einzelne MSIs sind viel immunogener als APC (frameshift peptide) —> die meisten Zellen werden frühzeitig eliminiert

Jede Zelle hat eine natürliche Selbstlimitierung: bei langanhaltender Aktivierung gehen die T Zellen in einen exhausted State über, der durch PD-1/PDL-1 oder CD80/CTLA-4 mediiert wird

Checkpoint Inhibitoren verhindern diese selbstlimitierende Aktivität von T Zellen mit anti-PD-1 und anti-CTLA-4 Antikörpern: T Zellen bleiben aktiviert und der Tumor wird aggressiver angegriffen

Dient als eindeutiger NW HPV-transformierter Zellen

• p16INK4a positive Zellen sind Zellzyklus-arretiert

• Ki67 positive Zellen sind proliferierend

Zellen die positiv für Ki67 und p16INK4a sind, sind transformierend

Primärprävention: prophylaktisch zB Impfungen

Sekundärprävention: verhindert das Fortschreiten der Krankheit. Setzen immfrühen Krankheitsstadium an und unterstützen die Erkrankung zu vermeiden oder den Krankheitsverlauf zu mildern