Filmwaage

Untersuchung des Verhaltens der Lipide bei Phasenübergängen

• Auftragen des Lateraldrucks pro Fläche eines DPPC-Monolayers bei 3 verschiedenen Temperaturen

• Berechnung des Kompressibilitätskoeffizienten und der Übergangswärme

• Visualisierung durch Fluoreszenz

• Kompartimentalisierung, selektive Permeabilität, Transport mit Membranproteinen, Zell-Zell-Interaktionen

• Rigidität und Form wird durch Zusammensetzung (verschiedene Phospholipide) bestimmt

• Flüssig-Mosaik-Modell: ampiphile Phospholipide und Cholesterol bilden eine ca. 5 nm dicke Doppelschicht in die Proteine und Glykoproteine eingebettet werden -> 2-dimensionale Flüssigkeit in der sich alle Bestandsteile relativ frei bewegen können

• Membran wird durch den hydrophoben Effekt zusammengehalten: für H2O ist es entropisch günstiger hydrophobe Anteile der Lipide zu verdrängen. Assoziation der hydrophoben Bereiche ist energetisch begünstigt, da die Oberfläche der hydrophilen-hydrophoben Wechselwirkungen minimiert wird.

• 
  

• Lipide machen circa 50% der Masse von tierischen Zellen aus

• auf einer Membranfläche von 1x1 μm2 befinden sich circa 5x10^6 Lipide, eine komplette Plasmamembran besteht aus circa 10^8 – 1010 Lipiden

• Lipide bestehen aus hydrophiler (polarer) Kopfgruppe und zwei hydrophoben (apolaren) Schwänzen. Schwänze haben eine Länge von 14- 24 C-Atomen und können Doppelbindungen haben (ungesättigte Fettsäuren). Der Kopf besteht aus Glycerol, Phosphatgruppe (negative Ladung bei Phospholipiden) und einer weiteren Gruppe (Ethanolamin, Cholin, Serin).

• hochkomplexes System, welches vereinfacht wird um es untersuchen zu können -> z.B. nur eine oder wenige Lipidsorten, Lipidmonolayer

• analytische Filmwaage zur Untersuchung der thermodynamischen Eigenschaften und Einfluss adsorbierter und eingebauter Proteine einer Lipidmonoschicht an Wasser-Luft-Grenzfläche

• besteht aus einem hydrophobem, temperierbarem Teflontrog (gibt keine Lösungsmittel/Ionen an die Subphase ab) gefüllt mit der Subphase (Milli-Q-Wasser oder Puffer)

  • Temperieren über Kupferplatte die mit trog in thermischem Kontakt

• einer Teflonbarriere (reguliert die Fläche -> lässt sich durch einen Schrittmotor kontinuierlich verschieben)

  • ist hydrophob, damit dicht für oberflächenaktive Substanzen

• einem Filterpapier mit Drucksensor

  • Wilhelmy-System: hydrophiles Plättchen (Platin) an weicher Blatt- oder Spiralfeder und induktiver Wegaufnehmer der Auslenkung der Feder misst -> Aufnahme Druck-Flächen-Diagramme -> Änderung Lateraldruck π = σ0 - σ = F0 / 2b - F / 2b  (F = Kraft auf Feder, b = Breite Blättchen)

• Erhöhung des Lateraldrucks bei Verringerung der Fläche kann in einem Druck- Flächen-Diagramm gezeigt werden

• Monolayer durchläuft Aggregatszustände:

  • isotrope Gasphase: viel Platz zur Verfügung, hoher Freiheitsgrad -> ungeordnete Fettsäurereste

  • Koexistenz gasanaloge/expaniderte fluide Phase: kaum detektierbar, da kaum unterschiedlicher Lateraldruck

  • expandierte / kondensierte fluide Phase: weniger Platz, minimale Freiheitseinschränkung

  • Koexistenz flüssiganaloge/festanaloge Phase: Plateau-Region -> Lateraldruck ändert sich kaum -> Hauptumwandlung: entscheidend für die Beweglichkeit der Membranproteine

  • kondensierte fluide Phase

  • kristalline / festanaloge Phase: wird Fläche weiter verringert, werden die Lipide in die all-trans Konformation gezwungen -> kostet Energie

• Phasen unterscheiden sich in Ordnungsgrad und Symmetrie

• Laterale Beweglichkeit nimmt um mehrere Größenordnungen ab bei der Umwandlung von fluid zu kristallin -> Rezeptorbildung dann z. B. wesentlich langsamer

• Lipide in Chloroform (löst sich nicht in Wasser)

• Lösung auf eine Wasserfläche spreiten

• Verdampfen des organischen Lösungsmittels (Chloroform) -> nur wegen des Lösungsmittels formt sich die Lipidmonolayer und nicht Vesikel

• Lipidmonolayer auf der Wasseroberfläche

• Filmwaage reinigen: Ethanol, Milli-Q-Wasser

  • Subphase wird mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt und mit Milli-Q Wasser wieder aufgefüllt

• Trog mit 180 ml Milli-Q-Wasser füllen und Reinheit prüfen

  • Ob die Filmwaage sauber ist, kann man an der Tröpfchenbildung erkennen (keine Tröpfchen = sauber)

  • Barrieren werden einmal zusammengefahren

  • Oberflächenspannung sollte sich bei reinem Wasser nicht ändern

• Druck / Waage tarieren

• Spreiten der DPPC (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) / Chloroform-Lösung auf die Subphasenoberfläche

  • Aus dem Flächenbedarf pro DPPC-Molekül (ADPPC = 100 Å^2) und der Gesamtfläche der Filmwaage (A = 24225 mm^2) kann die Anzahl an Molekülen und damit die Stoffmenge berechnet werden

  • Aus der berechneten Stoffmenge, der gegebenen Konzentration und molaren Masse kann dann das benötigte Volumen bestimmt werden

    𝑉 = 𝐴 ∗ 𝑀 / (𝐴𝐷𝑃𝑃𝐶 ∗ 𝑁𝐴 ∗ 𝑐)

• Warten bis die organische Phase verdampft ist → Messung starten

  • Lateraldruck der Lösung bei 18,9°C, 20,7°C und 22°C messen

  • dafür Fläche um 4mm/min komprimieren -> bis zum Enddruck 50 mN/m

Je wärmer,desto kleiner ist 𝜅

𝜅(LC) < 𝜅(LE) < 𝜅(LC/LE)

𝜕𝜋 für die Änderung des Lateraldrucks und AN für die Fläche pro Lipid auf der Oberfläche

𝜕𝐴𝑁 / 𝜕𝜋 ist der Kehrwert der Steigung der jeweiligen Regressionsgerade

• Wärmeänderung ∆q𝑀 beim Phasenübergang der flüssiganalogen zur festanalogen Phase

Bei steigender Temperatur sinkt die Übergangswärme

𝑇 : Temperatur 𝑀

𝑑𝜋𝑀/𝑑𝑇 : Änderung des mittleren Übergangsdruck über die Temperatur (Steigung im Diagramm)

𝐴𝑓 − 𝐴𝑘 : Länge des Koexistenzbereichs / Übergangsplateaus -> Berechnet aus Flächenänderung

• Ideales Gasgesetz (pV=nRT) mit der Boltzmann-Konstante kb bei einer Temperatur T wird abgewandelt um es auf 2D Lipidschicht anzuwenden

• Druck p wird durch den Lateraldruck Π und das Volumen durch die Fläche A, die die gegebene Anzahl an Lipidmolekülen N abdeckt, ersetzt

• ΠA= NkbT

• 
  

• Druck kann analog zum Druck im dreidimensionalen definiert werden:

F = freie Energie, σ = Oberflächenspannung, A = Fläche

• Da unsere Filme aus amphiphilen Molekülen bestehen, kann man den Lateraldruck aus der Differenz der Oberflächenspannung der reinen Subphase 𝜎0 und der mit Lipiden gespreitete Subphase 𝜎 beschreiben

• Der Drucksensor besteht aus einem hydrophilen Plättchen, welches aufgehängt an einer Feder und einem Wegaufnehmer in die Subphase eingetaucht wird. Die Kraft auf das Platinplättchen setzt sich dabei aus Gravitation (𝑚 ∗ 𝑔), Oberflächenspannung (2𝜎(𝑎 + 𝑏)cos (∝)) und Auftrieb zusammen. Vernachlässigt man den Auftrieb, und nimmt man an, dass das Plättchen vollständig benetzt (Kontaktwinkel 0° zur Subphase) und sehr dünn ist (Dicke b kann vernachlässigt werden), ergibt sich für die auf das Plättchen wirkende Kraft:

• wobei b die Breite des Plättchens darstellt. Für den Lateraldruck gilt damit:

• Anbringen von Fluorophoren an eine Zielstruktur (Lipide, Lipidmischungen, Mischungen aus Lipiden und Proteinen)

• zum Untersuchen der Distribution und dem Verhalten der markierten Moleküle bei einem Phasenübergang

• Dabei wird Licht in dem Wellenlängenbereich auf die Probe gestrahlt, was die Fluorophore anregt. Das emittierte Licht kann durch eine CCD-Kamera aufgenommen, und das Bild anschließend digitalisiert werden.

Für die Beobachtung des Phasenübergangs mit dem Floureszenzmikroskop wurde jeweils 0.1 – 0.2 mol% fluoreszenzmarkieres TexasRed-DHPE hinzugemischt, in welchem die Konzentration von DPPC 1 mM ist.

hier kann auch die normale Formel in die 2D Form umgewandelt werden

• ΔqM (DPPC) = 6.17*10^-17 mN/m

• Isothermen verlaufen im Koexistenzbereich nicht horizontal (theoretisch: Ordnung auf intramolekularer Ebene vor Phasenübergang) -> in der Praxis geschieht dies nicht wegen Verunreinigungen -> endliche Kompressibilität -> Druckerhöhung

• hohe Kompressibilität -> kleine Flächenänderung führt zu kleiner Druckänderung

• Kompressibilität im Koexistenzbereich viel höher als in den anderen Phasen (aber nicht unendlich)

• höhere Temperatur -> höhere Gesamtenergie des Systems -> weniger Energiezufuhr nötig für Phasenübergang

• Flüssige Phase (Lα):

  • Lipide verhalten sich ähnlich wie flüssige Kristalle

  • „long-range translational“ Ordnung senkrecht zum Layer, aber keine Ordnung innerhalb der Kohlenwasserstoffketten (Lipide benötigen circa 55- 70 Å)

  • sinkt T -> Übergang in die all-trans-Konformation -> Hauptübergang erster Ordnung in die „Ripple“-Phase (Pβ)

• „Ripple“-Phase (Pβ):

  • Kann verhindert werden durch Flucht in die dritte Dimension

• Gel Phase (Lβ‘):

  • entsteht bei weiterer Abkühlung,

  • Kohlenwasserstoffketten aufgrund des Dipolmoments der Kopfgruppen geneigt (Lipide benötigen circa 40 Å)

• kristalline Phase (PC):

  • entsteht bei weiterer Abkühlung,

  • Kopfgruppe frei von Wasser,

  • ist kinetisch behindert und die einzige Umwandlung zweiter Ordnung (dauert sehr lange)