Optische Mikroskopie

• Untersuchung verschiedener zellulärer Strukturen von „mouse stem cells“, die zuvor auf Glas bzw. mit Fibronektin fixiert wurden. Dabei wurden die Zellen zuvor mittels Immunfärbung präpariert und danach durch Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie betrachtet und analysiert.

• zu untersuchenden Strukturen waren dabei Aktin, Chromatin und Vinculin

• Durch das einfache Umschalten des Mikroskops von Lichtmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie kann das gleiche Objekt auf verschiedene Art und Weise aufgenommen werden. So kann man die drei Arten hinsichtlich ihrer Qualität und ihrer Auflösung der Zellstrukturen miteinander vergleichen.

• Außerdem zu untersuchen ist, ob sich eine maßgebliche Veränderung der Zellstrukturen bei Glas- und bei Fibronektin-Unterlage zeigt, da Aktin eine fokale Adhäsion mit Fibronektin jedoch nicht mit Glas eingehen kann.

• Fortbewegung der Zelle

• Form und die Stabilität einer Zelle

Strukturprotein, das Aktin bindet und so hauptsächlich für den Aufbau von Zell-Zell-Kontakten und Zell-Matrix-Kontakten verantwortlich

Verpackungsform der DNA und befindet sich im Zellkern. Dabei ist die DNA eng um Histone gewickelt und nimmt so eine kompakte und dichte Form an, was Schäden während der Zellteilung minimiert

• Fluoreszenzmarkierung via primärer und sekundärer AK -> intensiver als Markierung mit nur einem AK, da mehrere Sekundäre an einen Primären binden können -> Vorher Blockieren mit BSA (kein unspezifisches binden von AK)

• außerdem vorher fixieren und permeabilisieren der Membran

• Um Photobleaching zu vermeiden sollten die Proben nach dem Staining so wenig Licht wie mög´lich ausgesetzt sein

• am häufigsten verwendete Beleuchtungsanordnung für sämtliche Mikroskope

• getrennte Einstellung der Objektfeldhelligkeit und der Objektfeldgröße -> bestmögliche Beobachtung nicht-durchlässiger Proben -> gleichmäßige Ausleuchtung durch zweistufige Abbildung

• angewendet bei Proben, die kleinen Kontrast zu Hintergrund (Wasser) haben

• Strahlengang des Mikroskops wird verändert durch Ringblende in Kondensorlinse im Phasenkontrastmikroskop -> gleichphasiges Licht wird erzeugt

• Licht kommt von Objekt mit geringer optischer Dichte in ein Objekt mit hoher optischer Dichte -> Amplitude wird nicht stark verändert aber gebrochen / abgebremst -> Phasenverschiebung zu Licht, das nicht das Objekt durchläuft

• Objektiv leitet gebrochenes und ungebrochenes Licht auf Phasenring (ungebeugte Strahlen gehen durch Phasenmaske hindurch, gebeugt Strahlen treffen auf Material mit anderem Brechungsindex) -> weitere Phasenverschiebung -> zwei Lichtbestandteile (gebrochener Probenanteil und phasenverschobenen Teil)

• Phasenunterschiede werden durch destruktive Interferenz am Detektor in Intensitätsunterschiede umgewandelt -> Detektor übersetzt Intensitätsunterschiede mittels Fourier-Transformation -> Hintergrund wird dunkel, phasenverschobenes Licht das durch Probe ging heller -> Kontrast künstlich erhöht

• um Strukturen besser sichtbar zu machen

• Farbstoffe werden mit Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt -> das anzuregende Molekül absorbiert die Photonen -> Valenzelektronen werden in ein höheres Energieniveau gehoben -> angeregte Elektronen fallen in den Grundzustand zurück -> Energie wird als Wärme und Photon frei -> emittiertes Licht hat eine größere, energieärmere Wellenlänge -> Stokes Shift (“Energieverlust“, der sich in der Wellenlängendifferenz zeigt)

• Energieerhaltungssatz: Energie geht nicht verloren sondern wird zu atomarer Vibration und Wärme

• bei homogener Anregung korreliert Intensität des emittierten Lichts mit Menge an fluoreszierten Molekülen -> quantitative Beurteilung

• Licht aus Quecksilber-Lampe trifft auf Filter welcher nur Licht der Anregungswellenlänge durchlässt -> dichroider Spiegel welcher Licht der Anregungswellenlänge nicht durchlässt -> Reflexion auf Objekt -> Anregung des Fluorophors -> Emission von Licht mit längerer Wellenlänge (Stokes Shift) -> wird vom dichroiden Spiegel durchgelassen -> erneute Filterung -> Betrachtung durch Okular

• Probe von unten beleuchtet -> Probe absorbiert Teile des durchgehenden Lichts -> Amplitude verringert sich -> viele Zellbestandteile können nicht aufgelöst werden, da sie Lichtamplitude kaum schwächen sondern nur Phase verzögern

• Köhlern wichtig für Kontrasverbesserung! Ebenfalls wichtig: Beleuchtung des Raums

• Lichtstrahlen und Objekt werden in alternierenden Phasen scharf abgebildet

• Lichtstrahlen werden absorbiert oder gestreut -> Objektdetails sind dunkel auf hellem Hintergrund sichtbar

• geringer Kontrast, intrazelluläre Strukturen sind erkennbar (aber kein Zellkern), keine eindeutigen Konturen

• Vorteile: einfach Ausführung, geringer Präparationsaufwand

• nur Bruchteil der Probe beleuchtet -> Gesamtbild entsteht bei Zusammensetzung aller Teilbilder -> wird nur Licht um die Fokusebene aufgenommen -> Hoher Kontrast und Schärfe

• Totalrefelxionsfluoreszenz-Mikroskopie:

• Fluoreszenz der Probe über abklingendes Feld angeregt -> Licht wird an der Innenseite eines Refelxionselements (Deckglas) an Grenzfläche zu Substrat totalreflektiert

• Untersuchung von Strukturen die sehr nah an Oberfläche sind (Studien der Exozytose)

• Zeiss Mikroskop mit einer Hamamatsu Kamera

• Konfigurierung des Mikroskops

• Aufnahmen von einem Objektträ- ger mit einer Skalierung in 20-facher und 40-facher Vergrößerung -> experimentelle Bestimmung der Pixelgröße

• Von unseren Proben wurden bei 20-facher Vergrößerung eine Hellfeld-Aufnahme, eine Phasenkontrast-Aufnahme in drei Positionen und bei den gleichen Positionen Fluoreszenzaufnahmen in den Kanälen DAPI, ToxRe und AF488 angefertigt.

• Bei dem Objektiv mit 40-facher Vergrößerung wurden Hellfeld-Aufnahmen in drei Positionen und ebenfalls Fluoreszenzaufnahmen in den Kanälen DAPI, ToxRe und AF488 angefertigt.

• Bei jeder Aufnahme wurde neu fokussiert und innerhalb einer Position durfte der Objektträger zwischen den Aufnahmen nicht bewegt werden, um nachher ein gutes Overlay zu ermöglichen.

• DAPI -> interkaliert in der minor groove doppelsträngiger DNA vor allem in AT haltigen Regionen -> emittiert blaues Licht

• Zweiter AK mit Alexa 488 -> emittiert grünes Licht

• Rhodamine Phalloidin -> bindet F-Aktin -> emittiert rotes Licht

• Zellzahl pro μm2 mit der Software ImageJ unter Anwendung von "Watershed"bestimmen

• Dazu wurde bei 20-facher Vergrößerung an drei Positionen ein Bild, der mit DAPI angefärbten Zellkerne aufgenomen. Ein Bild entspricht einer Fläche von 456 435.36 μm2.

• Ziel: Vergrößerung des Sehwinkels

• -  Bestandteile: Lichtquelle, beleuchtende Optik, abbildende Optik

• -  Aufrechtmikroskop (abbildende Optik befindet sich über dem Objekt)

• -  invertiertes Mikroskop (abbildende Optik befindet sich unterhalb des

  Objektes)

• -  Transmissionstechnik (beleuchtende Optik durchstrahlt das Objekt)

• -  Reflektionstechnik (beleuchtende Optik wird vom Objekt reflektiert)

• besteht aus Objektivlinse (erfasst Lichtstrahlen vom Objekt und projiziert diese nach unendlich -> verlaufen parallel), Tubuslinse (festverbautes, sammelndes Linsensystem, projiziert Zwischenbild) und Okularlinse (zur Betrachtung des Zwischenbilds in Vergrößerung)

• Gesamtvergrößerung = Vergrößerung Objektivlinsensystem x Vergrößerung Okular

• beleuchtende Optik durchstrahlt das Objekt

• beleuchtende Optik wird vom Objekt reflektiert

• optimale Beleuchtung durch zwei Blenden (Leuchtfeldblende, Aperturblende) und die beleuchtende Optik (Kondensor)

• Objektivbrennebene justieren: unnötige Filter und Blenden entfernen und auf Objekt fokussieren

• Leuchfeldblende einstellen: Blende schließen, Kondensor justieren sodass Blende scharf ist, Blende zentrieren -> vermeidet Streuung an Teilen außerhalb des Sichtbereichs

• Minimierung des Streulichts durch Öffnen der Leuchtblende sodass nur Probe ausgeleuchtet wird

• Aperturblende auf 2/3 des Durchmessers der Objektivaustrittpupille einstellen um Kontrast zu erhöhen (Kompromiss zwischen Auflösung und Kontrast: Blende geschlossen -> hoher Kontrast & geringe Auflösung, Blende offen -> höhere Auflösung & geringer Kontrast)

• mathematisch kann Beugung/Brechung des Lichts beim Durchgang durch das Linsensystem durch eine Fourier-Transformation beschrieben werden

• Intensitätsverteilung im Brennpunkt entspricht hierbei der Fourier- Transformation der Intensitätsverteilung über die Einfallswinkel

• konstante Funktion (paralleles Strahlenbündel aus dem Unendlichen mit gleicher Intensität) wird in eine δ-Funktion bei Null (Brennfleck der Linse in der Fokalebene) umgewandelt

• reale Linsen haben keine unendliche Ausdehnung -> Licht wird am Rand gebeugt -> Funktion des Strahlengangs muss mit Funktion der Linsentransmission gefaltet werden

• Beugungsbild in der Fourierebene ist eine Ansammlung von Punktlichtquellen, die in der Bildebene wieder zu einem Abbild des Objekts interferieren

• Kombination aller Fouriertransformationen -> Point-Spread-Function (PSF) kann man mit der Objektintensitätsfunktion die Intentsitätsverteilung mit allen beugungsbedingten Unschärfen ermitteln

• beschreibt das Vermögen eines optischen Elements Licht zu fokussieren

• Frontlinse muss möglichst viel vom Objekt sehen -> unter möglichst großem Winkel Licht einsammeln

• numerische Apertur ist ein Maß für den vom Objektiv zugänglichen Öffnungswinkel -> Produkt aus halbem Öffnungswinkel des Objektivs und des Brechnungsindex des umgebenden Mediums: 𝑁𝐴 = 𝑛 ∗ sin 𝛼

• je höher die numerische Apertur, desto höher das Auflösungsvermögen

• N.A. kann z.B. durch die Verwendung von Immersionsflüssigkeit (Öl) erhöht werden -> Brechungsindex von Öl (~ 1,4 – 1,6) ist besser als der von Luft

  (~ 1,0) -> weniger Lichtverlust durch (Total)-Reflexion

• ebenfalls wichtig: illumination numerical apertur (INA) -> Kondensor sollte gleiche INA haben wie Linse -> großer Beleuchtungsstrahlkegel- Winkel um mehr stark gebeugte Lichtstrahlen vom Objekt einsammeln zu können

• gemessen an der Grenze bis zu der zwei kleine Objekte noch getrennt wahrgenommen werden können

• Lichtquelle wird als Airy-Scheibe abgebildet (umgeben von Beugungsringen, Abbildung der PSF)

• Hauptmaximum des ersten Objekts muss im ersten Minimum des zweiten Objekts liegen damit diese noch getrennt wahrgenommen werden können (Rayleigh-Kriterium)

• -Abstand bei dem zwei Punkte bei bestimmer Wellenlänge noch getrennt aufgelöst werden können: 𝑑 = 1,22∗𝜆 / (INA+NA)

• Sphärische Aberration: fehlerhafte Beugung von Lichtstrahlen -> verfälschter Brennpunkt (Schnittpunkt achsenferner Lichtstrahlen liegt vor dem Schnittpunkt achsennaher Lichtstrahlen) -> scharfes aber kontrastarmes Bild

• chromatische Aberration: Licht kürzerer Wellenlänge wird stärker gebrochen als Licht längerer Wellenlänge -> „Farbfehler“, Brechzahl ist abhängig von Wellenlänge

• Astigmatismus: durch fehlerhafte Verkrümmung der Linsenoberfläche enstehen statt Brennpunkten Brennlinien die das Bild unscharf machen