Vorlesung Tanaka

1. Coulomb (ionische) Kraft

2. Wasserstoffbrückenbindungen

3. Ladung-Dipol Interaktion

4. Dipol-Dipol Interaktion

5. London Dispersion Force

• Kraft zwischen zwei Ladungen oder Ionen

• die potentielle Energie der Ladungen wird durch das Integral der Kraft über den Abstand r, zwischen den Ladungen, berechnet

• Berechnung der potentiellen Energie zwischen den beiden Ionen -> kommt was negatives raus, ist das Potential anziehend

• Vergleich der potentiellen mit der thermischen Energie bei 300 K

  • Die Bindungsenergie von ca. 200 kBT ist vergleichbar mit der Energie einer kovalenten Bindung

  • Ist der Abstand zwischen den Ionen größer als 55 nm, fällt die potentielle Energie unter die thermische Energie

Die Coulomb-Kraft ist eine starke, über große Distanzen wirkende Interaktion

Wie groß ist die Distanz bei der zwei Elektronen die Interaktionsenergie von kT bei 300 K in reinem Wasser haben?

• Verwendung der Coulomb-Kraft mit der Dielektrizitätszahl εr = 80

• Berechnung des Abstandes r

  • Ergebnis ist die Bjerrum-Länge (Länge bei der kbT = Coulomb-Kraft) von r = 0,7 nm (Kraft wird durch Wassermoleküle abgeschirmt)

  • Verglichen mit der Länge im Vakuum von 55 nm

1,38 * 10-23 [J/K]

• Wasserstoffbrückenbindungen entstehen zwischen einem Wasserstoff, welches an ein elektronegatives Element in einem Molekül gebunden ist (H-Brücken-Donor) und einem freien Elektronenpaar an einem benachbarten Molekül (H-Brücken-Akzeptor)

• Dabei ist das Wasserstoff-Atom am Donor partial positiv (δ+) geladen

  • Alle elektronegativen Elemente im Periodensystem wie Sauerstoff, Stickstoff, Halogene (und teilweise auch Kohlenstoff) sind H-Brücken-Donatoren

• Die Wasserstoffbrückenbindung hat einige Gemeinsamkeiten mit Dipol-Interaktionen (Summe der van-der-Waals Radien) und auch kovalenten Bindungen (Valenzelektronenzahl)

  • Die Stärke der H-Brückenbindung ist abhängig von Temperatur, Druck, Bindungswinkel und dem Medium

  • Typische Bindungsstärke zwischen 0,02 und 0,7*10^-19 J (0,5 - 20 kBT, abhängig von den Molekülen)

Beispiel (1): DNA-Doppelhelix mit H-Brückenbindungen zwischen den Basenpaaren AT und GC (2 und 3)

Beispiel (2): α-Helicale Peptide, bei denen zwischen Aminosäuren H-Brücken ausgebildet werden

Ist der Unterschied in der Elektronegativität der Atome nicht groß genug, um die Elektronen auf eine Seite zu ziehen, nennt man diese Bindungen polar, da sie sowohl ein positives als auch ein negatives Ende besitzen (Pole).

Analog kann das Dipolmoment auch die Polarität einer chemischen Bindung in einem Molekül anzeigen

• Wird ein Molekül mit einem Dipolmoment p in das elektrische Feld E enigebracht ist die Interaktionsenergie V

• ist der Winkel θ = 0, wird die Interaktionsenergie zwischen den beiden Kräften maximal

• Im Gegensatz zur Coulomb-Kraft, sinkt die Energie hier mit 1/r2 ab, also deutlich schneller! (Ohne die thermische Bewegung, richten sich frei bewegliche Dipole immer mit dem elektrischen Feld aus 􏰀 θ = 0)

Debye [D]

1 D = 3,33564 *10^-30 Cm (Coulomb-Meter)

• Im Falle der Dipol-Dipol Interaktionen (permanente Dipole) wird die geometrische Betrachtung der Ausrichtung beider Dipole stärker mit einbezogen.

• Die Interaktionsenergie erreicht ihr Maximum, wenn die Ausrichtungswinkel beider Dipole 0 sind

• Hier sinkt die Energie mit 1/r3 ab und somit noch schneller als vorher

In ungeordneten Phasen (Gas/Flüssig) kämpft die Fluktuation (willkürliche Ausrichtung) gegen das Interaktionspotential (Alignierung) an

-> Keesom Force mit f(r) (Gewichtungsfaktor, der die Orientierung der beiden Dipole zu einander mit einbezieht (nach der Boltzmann-Verteilung))

-> Die Energie fällt jetzt mit 1/r6 ab und liegt typischerweise in der Größenordnung zwischen 0,05 und 0,4*10^-19 J (Vergleich Thermale Energie bei 300K = 0,04*10-19)

-> Sehr schwache Interaktion, die den Siedepunkt entscheidend beeinflusst:

bei ähnlicher Masse größerer Dipolmoment -> höhere Verdampungstemperatur

• Weitere Interaktion, die aus der schwachen Anziehung zwischen transienten Dipolen oder Multipolen in Molekülen resultiert

  • Schwache nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen Atomen und Molekülen

  • Die London-Force kommt zumeist in unpolaren Molekülen vor, bei denen die Elektronendichte ungleich ist und somit eine Art Multipol entsteht

  • Interaktion zwischen Multipolen wie Edelgasen (z.B. Helium) -> Die Edelgase können durch die schwache Anziehung bei niedrigen Temperaturen flüssig sein

• Die London-Force ist auch in polaren Molekülen vorhanden, allerdings macht sie dort nur einen sehr geringen Teil der Anziehungen aus

• vdW Kraft: Kraft, die aus der Polarisation von Molekülen zu Dipolen hervorgeht

• Umfasst somit auch die Keesom Force (zwischen zwei permanenten Dipolen), die Debye- Force (zwischen freien oder rotierenden Dipolen -> nicht erwähnt hier) und die London Force (Verschiebung der Elektronenwolkenverteilung)

  • Die London-Force wird dabei zumeist als die van-der-Waals Kraft bezeichnet

• Einfaches mathematisches empirisches Modell (no theoretical justification)

• beschreibt die Wechselwirkungen zweier ungeladener, nicht aneinander gebundener Atome in Abhängigkeit des Abstands (besonders gut bei Edelgasen (Argon Dimer))

• Dabei kommt es zu Anziehungs- und Abstoßungskräften, die durch je einen Term des Potentials definiert sind. Der anziehende Anteil des Potentials wird dabei aus der London-Force abgeleitet.

• Das Minimum liegt dabei bei r = σ -> van der Waals Radius (= kleinster Abstand zwischen den Teilchen bevor die Atome starke Abstoßung erfahren)

• Fundamentales Prinzip, welches die strukturelle Organisation von kleinsten Molekülen bis hin zu Galaxien beschreibt.

• Es benennt einen reversiblen Prozess, in welchem schon existierende Teile oder ungeordnete Komponenten zu Strukturen zusammengesetzt werden.

• Zusammenlagerung von Molekülen ohne Anleitung oder Management einer außenstehenden Quelle

• Es gibt zwei Arten: intermolecular und intramolecular self assembly

• Komplexe Polymere, die sich zu einer definierten, stabilen Struktur zusammenlagern (z.B. Proteinfaltung)

• Die Eigenschaft von Molekülen, sich zu supramolekularen Zusammenlagerungen zu formen (z.B. biologische Membranen)

• surface active agents

• Werden auch Amphiphile genannt und sind Moleküle die einen hydrophilen Kopf und einen hydrophoben Schwanz haben

• sie reduzieren die Oberflächenspannung zwischen Luft und Wasser

• aus Surfactants können sich Lipiddoppelschichten, bicontinuous cubics und inverted micelles bilden

• Die Kraft, die auf eine Linie oder Fläche wirkt

• Effekt der eine Oberfläche einer flüssigen Phase als elastisches Blatt beschreibt (Bsp: Miniskus bei Wasserglas)

• Einheit in [J/m^2] oder [N/m] = γ

• Die Oberflächenspannung ist Temperaturabhängig und sinkt mit zunehmender Temperatur ab

  • Ursache dafür ist die Änderung des chemischen Potentials und die Anzahl der Moleküle Γ

  • Die intermolekularen Abstände werden größer mit zunehmender Temperatur

• bei RT 72,2 mN/m

• bei höheren Temperaturen geringer

• bei tieferen temperaturen höher

Darstellung eines idealen drei Phasen Kontakts am “semi-infinite” Keil.

γsv = Oberflächenspannung zwischen der festen und gasförmigen Phase;

γlv = Oberflächenspannung zwischen der gasförmigen und der flüssigen Phase

γsl = Oberflächenspannung zwischen der festen und der flüssigen Phase;

dx = Bewegung; θ = Kontakt zwischen Flüssig- und Festphase

• Es wird die Änderung der freien Oberflächenenergie (dg) entlang der Kontaktlinie um die Strecke dx betrachtet

• Im Gleichgewicht (dg/dx = 0) ergibt sich daraus die Young-Gleichung:

Dargestellt ist ein Draht, welcher einen Seifenfilm zwischen sich aufspannt. Bei Bewegung des Drahtes entgegen des anderen Endes, wird eine Kraft F aufgewendet, um den Film zu vergrößern.

In dieser Abbildung wird zum einen die frontale Sicht (links) und der Blick von der Seite (rechts) dargestellt. Dabei geht es um eine senkrecht aufgehängte Platte, welche eine flüssige Oberfläche oder Grenzfläche berührt. Auf die Platte wirkt dann eine Kraft F, die in Korrelation mit ihren Ausmaßen, sowie der Oberflächenspannung und dem Kontaktwinkel steht.

F = Kraft mit der eingetaucht wird; H = Höhe des eingetauchten Bereichs der Platte; W = Breite der Platte; L = Höhe der Platte; D = Tiefe der Platte; θ = Kontaktwinkel mit der Flüssigkeit

• Mit Hilfe des Versuchs kann dabei die Nettokraft berechnet werden, sowie die Änderung der Oberflächenspannung

• Ist ein Surfactant Film auf der Oberfläche, kann man einen Oberflächendruck berechnen

die Konzentration bei der die Surfactants in der Lösung im Gleichgewicht sind mit den Surfactants in Aggregaten

• Wird die Konzentration der Surfactants nach der CMC weiter erhöht, bilden sich nur noch weitere Aggregate in der Lösung, es kommt allerdings nicht mehr zur Veränderung der Oberflächenspannung

• Vor der CMC reichern sich die Moleküle an der Oberfläche an

• Auftragung der Oberflächenspannung (y-Achse) gegen den Logarithmus der Konzentration (x-Achse)

• [mol/m2]

• Oberflächenaktivität = Menge an Molekülen an der Oberfläche pro Fläche

1. Die Oberflächenspannung der Polymerlösung ist im allgemeinen niedriger als die des Wassers

2. Bei der Polymerlösung mit den Surfactants bildet sich ein weiteres Plateau aus, bei dem sich auf dem Polymer Mizellen bilden (CAC) und somit die Mizellbildung des Surfactants in der Lösung aufgeschoben wird.

   • Auftragung der Oberflächenspannung gegen den Logarithmus der Konzentration der Surfactants

Beispiel: Chitooligosaccharide der Mytilus Muschel wurden auf ihre amphiphile Natur getestet und die CAC bestimmt.

• beschreibt die Differenz des chemischen Potentials

1. Δµ > 0 = Der Transfer eines Lipids in die Lösung kostet Energie

2. δH < 0 = Der Transfer ist ein exothermer Prozess (es wird Wärme erzeugt)

3. δS < 0 = Wasser tendiert dazu, sich um die nicht-polaren Moleküle anzuordnen und es kommt somit zur Senkung der Entropie

• Erhöhung der freien Energie durch Reduktion der Oberfläche durch Zusammenlagerung/Aggregation der hydrophobischen Moleküle.

• Dies kann beispielweise auf die Faltung von Proteinen, die Proteinwiederherstellung und die Surfactantaggregation angewendet werden.

• Kontrolle der Synthese und des Abbaus von Lipiden

• Einfügen von Proteinen in die Membran

• Drug Design

• Wird eine Kette eines Lipids abgeschnitten wird es deutlich löslicher als zuvor und kann aus einer Membran entfernt werden

• Phospholipasen können Lipide abbauen

• Hexosamidasen bauen Sphingolipide ab, brauchen dafür aber ein Helferprotein

• Der hydrophobe Kern der Integralproteine muss mit Hilfe von Surfactants stabilisiert werden, um die Denaturierung zu verhindern

• Bei einer gewissen Konzentration (unterhalb der kritischen Surfactantkonzentration), können die Proteine dann in die Membran eingefügt werden

• Aufnahme des Wirkstoffs und Interaktion mit der Plasmamembran wird durch die Lipophilie (Hydrophobizität) bestimmt

• Log(PC) - partition coefficients

  -> Bestimmung des log(P) oder log(c) um die Lipophilie eines Drugs zu bewerten

• Lipophilicity Assay = Messung des Partition Coefficient zwischen Membran und Wasser, als direktere Messung im Gegensatz zu Octanol und Wasser (früher so gemacht)

  -> MA = Membran affinity

Zellmembranen bestehen aus Polysacchariden (extrazellulär), der eigentlichen Lipidmembran mit Membranproteinen (peripher und integral) und dem angeschlossenen Cytoskelett (intrazellulär)

• Zellmembranen agieren als selektiver Filter und als Plattform für diverse Prozesse

• Erlauben self-assembly und die laterale Diffusion ihrer Komponenten

• extrazelluläres polymerisches Material, was von Bakterien, Epithelien, etc. produziert wird

• Die bakterielle Glycokalix dient den Bakterien als Schutz vor der Phagozytose und hilft bei der Bildung von Biofilm

• Die Glycocalix in roten Blutkörperchen hilft diesen, sich an der Oberfläche von Kollagen, an verletzten Gefäßen oder auch an Endothelialzellen festzuhalten

• Die Glycocalix auf endothelia Zellen reduziert die Reibung des Blutflusses und verhindert als Barriere den Blutverlust durch die Gefäßwand (Hämostase)

• Zelluläres Gerüst/Skelett, welches im Cytoplasma von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen enthalten ist

• Wichtig für die Zellbewegung, den intrazellulären Transport, die Zellteilung und die Zellgestalt

• Sehr gut erforschte, einzigartige Membran

• Sehr flexible, sodass sie auch durch enge Gefäße gelangen können ohne kaputt zu gehen

• Halten sehr hohe Scherkräfte, Biegung und Kompression aus

• Die Verteilung der Lipide ist selektiv unterschiedlich zwischen der innen und Außenseite

• Negativ geladene Lipide befinden sich in der inneren Membranschicht

• Dient der Identifikation der Zusammensetzung der exo (außen)- und endoplasmatischen (innen) Seite der Membran

• Verwendung verschiedener Phospholipasen, die die Grundgerüste an unterschiedlichen Stellen spalten

• Anschließende Chromatographie der Produkte

• Phospholipide werden im ER aus Diacylglycerol synthetisiert, indem durch spezifische Transferasen eine zufällige Kopfgruppe an das Gerüst gebunden werden.

  -> Diacylglycerol ist auch bei der Synthese von Cardiolipin in Mitochondrin involviert

• Sphingomyeline werden an der luminalen Seite der Membran des Golgi-Apparats zusammengefügt, indem sie an Ceramidvorläufer gebunden werden.

• Ganglioside werden ebenfalls im ER und Golgi-Apparat durch Glycosyltransferasen hergestellt. Dabei werden Saccharide an Ceramidvorläufer gebunden.

Packing parameter

-> Phospholipide mit kompakten Kopfgruppen tendieren zur Bildung von tubulären Mizellen

-> Lösung der Natur: Mischung diverser Lipide um die Balance zu halten

Die Abbildung zeigt eine polymere Monolage auf einer speziell präparierten Glasoberfläche. Diese Apparatur dient der Untersuchung von Oberflächenfilmen wie organischen Monolagen. Dabei wird zuerst eine Portion Lipid auf die Wasseroberfläche gegeben. Nachdem die Lösung verdunstet ist, kann die zurückbleibende Monolage durch Bewegung der Barriere entspannt oder komprimiert werden. Thermodynamische Parameter wie der Oberflächendruck, die mittlere molekulare Fläche oder auch die Temperatur können dabei exakt kontrolliert werden bzw. über einen Sensor ermittelt werden.

Die ideale 3D vdW-Gasgelichung lässt sich durch Vereinfachungen in die 2D vdW-Gleichung umstellen

• Dadurch lässt sich das vdW-Gasmodell auf die Thermodynamik von Lipidschichten anwenden

• Der Druck p wird durch den Oberflächendruck ausgetauscht, während das Volumen durch die Fläche ersetzt wird

• Langmuir Isotherme

• Betrachtung der Langmuir Isotherme bei Auftragung des Drucks gegen die Fläche (hier ist der Druck essentiell, während bei DSC die Temperatur im Gegensatz zum Druck wichtig ist).

• Zwischen den Phasen befinden sich Übergangszonen, in denen die einzelnen Phasen nebeneinander vorliegen

  • Die LE/LC Koexistenzphase ist dabei detektierbar und beschreibt die isotherme Kompressibilität

    -> Die Kompressibilität ist dabei unendlich (diskontinuierlicher Phasenübergang = erste Ordnung)

    -> Die Kompressibilität einer realen Lipidschicht ist allerdings endlich

  • Die G/LE Koexistenzphase ist dagegen nicht detektierbar, da der Oberflächendruck nahe 0 ist

Beispiel: Dipalmitoyl Phosphatidylcholine (DPPC) zeigt bei einem Temperaturanstieg, auch einen Anstieg im Druck und verkürzt die Koexistenzphase

Tricritical point: Übergang von LC-LE, welcher normalerweise erster Ordnung ist, wird zur zweiten Ordnung

Auftragung des Phasenübergangs einer Lipidschicht als Plot des Drucks gegen die Fläche. ALC bezeichnet dabei den Schnittpunkt (Wendepunkt) mit der Clausius-Clapeyron-Gleichung bei LC, während ALE den Schnittpunkt (wendepunkt) der Kurve mit dem Phasenübergang bei LE beschreibt. Die Enthalpie nimmt dabei mit zunehmender Temperatur ab, während der Oberflächendruck zunimmt.

Den kritischen Druck kann man dann über Extrapolation des Oberflächendrucks gegen T erhalten. Bei der gestrichelten Linie handelt es sich um die Koexistenzlinie an deren Hochpunkt der kritische Druck p* und die kritische Fläche Ac erreicht sind. Sie beschreibt außerdem den Verlauf der Isotherme für die höheren Temperaturen, sowie die niedrigeren.

Berechnung der kritischen Temperatur über (Hochpunkt der Parabel ist der trikritische Punkt an dem die Phasen ineinander übergehen)

• Sobald Lipiddoppelschichten in Wasser suspendiert werden, formen sie spontan Vesikel aus, die hinsichtlich ihrer Form sehr hohe Stabilität aufweisen. Grund dafür ist der hohe innere Druck (niedrige Oberflächenspannung), geringe Biegungssteifheit und leichte Asymmetrie. Übergang von der fluiden Form (smectic A) zu der festen Form (smectic B).

• Die Formation solcher Vesikel kann als Zusammenspiel von Biegungs- und Grenzflächenenergie beschrieben werden

• Nimmt man an, das R ungefähr der Radius r ist, kann man den Gleichgewichtsradius Req eines Vesikels durch die Minimierung der freien Energie G abschätzen als

• κ kann experimentell bestimmt werden, während γ über das chemische Potential über die critical aggregate concentration berechnet werden kann

Unterschiedliche strukturelle Phasen einer Lipidmembran werden durch unterschiedliche Funktionen wie die Molekulare Struktur(Geometrie), die Konzentration(Lyotropic) und die Temperatur (thermotrophe Polymorphismen) bedingt.

• Allgemein = Der Phasenübergang kann durch die Ableitung der freien Energie, welche an der Stelle des Phasenübergangs diskontinuierlich ist, bestimmt werden.

• 1.Ordnung Phasenübergang = Zeichnen sich durch Diskontinuität in der ersten Ableitung der freien Energie aus. Alle Übergänge von fest, flüssig oder gasförmig sind Phasenübergänge der ersten Ordnung und weisen diskontinuierliche Dichte auf.

• 2.Ordnung Phasenübergang = Zeichnen sich durch Diskontinuität in der zweiten Ableitung der freien Energie aus.

Alle Phasenübergänge von Lipiddoppelschichten, sind Phasenübergänge der ersten Ordnung:

• Fluid Phase Lα

• Ripple Phase Pß

• Gel Phase Lß

• Crystalline Phase LC

lange translationale (parallele) Ordnung der Köpfe, allerdings keine Ordnung innerhalb der Doppelschicht, in der die Kohlenstoffketten freie Konformationen einnehmen können

• Da Lipide Ähnlichkeiten mit Flüssigkristallen aufweisen, entspricht diese Phase der smectic A Phase in der Flüssigkristall (LC)-Terminologie

Bei Abkühlung der Membran in Phase Lα, werden alle Kohlenstoffketten in die trans- Konformation umgeordnet. Dieser Phasenübergang wird “Main transition” genannt.

Die Phase zeichnet sich auch durch eine drei dimensionale Veränderung aus, bei der die Membran eine Oberfläche gewisses Muster annimmt und unterschiedliche Strukturen sichtbar werden.

• Die Phase kann verhindert werden, wenn der Membran die drei-dimensionale Änderung genommen wird, und sie nicht in die Tiefe gehen kann

Wenn die Membran weiter abgekühlt wird, kommt es zu “Pre-Transition” von der Ripple Phase zur Gelphase.

In dieser Phase weisen die ausgerichteten Kohlenstoffketten meistens eine gewisse Neigung zu den Kopfgruppen auf, was in dem Dipolmoment der Lipide begründet ist.

• Kann auch keine Kettenneigung aufweisen (=smectic B Phase in der LC-Terminologie)

Durch weiteres Abkühlen kommt es zur “sub-transition”, bei der die Kopfgruppen frei von freien Wassermolekülen vorliegen.

Dieser Übergang ist oft kinetisch verhindert.

• Einziger Phasenübergang der der zweiten Ordnung folgt (Diskontinuität in der zweiten Ableitung)

• Differential Scanning Calorimetry (DSC)

• Messung der Wärmeänderungen während der Erhöhung oder Erniedrigung der Temperatur

• Endotherme Peaks werden dann mit einem Phasenübergang assoziiert

  • Durch Berechnung der Wärme über die Fläche der Peaks kommt man dann zur Phasenübergangsenthalpie

• Dabei wird ein power compensated DSC verwendet, der die relative Temperatur einer Probe und einer Referenz misst und die Temperaturänderungen der beiden immer gleich ansetzt

•  Je länger die Kette, desto höher die Temperatur, die für den Übergang benötigt wird

• Mit Doppelbindungen ist die Temperatur niedriger

• Eine Doppelbindung in der Mitte der Kohlenstoffkette, stört die Ordnung der Membran am meisten und senkt dadurch die Temperatur

• zur Bestimmung der Phasenübergänge

• Wichtiger Bestandteil ist ein Interferometer, dass dazu dient, Interferenzen festzustellen

  • Zumeist Verwendung eines Michelson-Interferometers bei der die Interferenz nur bei Verwendung spezieller Lichtquellen wie einem Laser gemessen werden kann

  • Michelson-Morley-Experiment zur Untersuchung des Lichtäthers als Medium für die Ausbreitung von Licht

• Die Fourier-Transformation ist eine Methode, die es erlaubt kontinuierliche, aperiodische Signale in ein kontinuierliches Spektrum zu zerlegen

• Berechnung des Spektrums durch die Fourier-Transformation eines gemessenen Interferogramms

• Die Main Transition zeichnet sich durch eine Verschiebung der Absorption einer charakteristischen Vibrationsbande aus

• zur Bestimmung der Phasenübergänge

• Untersuchung der elektronischen Umgebung einzelner Atome und ihrer Wechselwirkung mit den Nachbaratomen

• Beruht auf der magnetischen Kernresonanz (=Wechselwirkung zwischen dem magnetischen Moment der Atomkerne von Proben mit einem hochfrequenten magnetischen Wechselfeld)

  • Isotope müssen ein magnetisches Moment und damit einen Kernspin unterschiedlich von Null haben

• Der Phasenübergang zeichnet sich durch eine Verschiebung der Resonanzfrequenz aus

• Methode zur Bestimmung der Kristallstruktur eines Polymers

• Basiert auf der Analyse von Bragg Peaks, die von Strukturen, die kleiner als die Größenordnung Nanometer sind herrühren

• Unterschied zwischen small und wide-angle ist die Distanz der Probe zum Detektor

  • Bei WAXS ist der Detektor näher an der Probe und ermöglicht so die Aufnahme der Beugungsmaxima bei höheren Winkeln

• Ermöglicht die Identifikation von Eigenschaften wie Kette-Kette-Interaktion, Membrandicke und Elektronendichte

Die Carboxy-Gruppen sind in der Lα-Phase klar von der Kette abzugrenzen das Lipid selbst nimmt eine größere Fläche ein als in der Lß-Phase, in der die Gruppe tiefer in der Kettenregion verankert ist

• Die Laterale Expansion kann durch die Mikropipetten Absaugung bestimmt werden, während die transversale Expansion durch x-ray oder neutron scattering bestimmt werden kann

• Der Volumenexpansionskoeffizient kann aus der Summe von Lateraler und transversaler Expansion bestimmt werden

1. Konformationsübergänge und Defektverschiebung

2. Rotationsdiffusion entlang der vertikalen Achse

3. Laterale Diffusion

4. Kopfgruppenrotation

5. Unplanmäßgie Verschiebung

6. Kollektive Fluktuation

1. NMR T1 Measurment

   Messung der Relaxationszeit aus der Längsmagnetisierung in den Gleichgewichtszustand bezüglich des Kernspins. Dies wird durch die thermale Relaxation des Magnetisierungsvektor S bestimmt. (für schnelle Bewegungen)

2. Incoherent Quasi Elastic Neutron Scattering

   Messung des elastic incoherent structure factor (EISF), der die räumliche Vergrößerung der molekularen Bewegung angibt. Dabei wird die Breite der Linie gemessen, die dann die Korrelation mit der Bewegungszeit liefert. Beide Werte können über den Scattering Factor bestimmt werden.

Das Cytoskelett besteht aus drei Hauptfamilien, den Microfilamenten (MF, Aktin), den Microtubuli (MT, Tubulin) und den Intermediär Filamenten (IMF).

Die drei Hauptfamilien werden über das Protein Plectin miteinander verbunden (sehr großes Protein).

1. Instandhaltung der Zellgestalt

2. Zellbewegungen

3. Transport von Molekülen in das Cytoplasma

1. Lamellipodia (Protrusions)

2. Filopodia (Fingers)

3. Stress fibers (Cell body)

• globuläres Aktin

• Macht einen sehr hohen Anteil der Proteine der Zelle aus (1-5%, in Muskelzellen 10%)

• Besteht aus vier Domänen mit einer ATP Bindungsstelle

• Sehr hoch konserviert in fast allen Lebewesen

• G-Actin Monomere polymerisieren zu F-Actin Filamenten (= zwei, als alpha Helix angeordnete, Actin-Polymere) unter Anwesenheit von zweifach positiv geladenen Kationen und ATP

• filamentous Aktin

• weist eine polare Struktur auf, da es über ein + und ein - Ende verfügt

• +Ende (barbed end) = ATP-Actin kann binden und polymerisiert schnell

• -Ende (pointed end) = Die ATP-Bindungstasche ist versteckt und die Polymerisation findet nur langsam statt

1. Nucleation = Bildung eines stabilen Kerns aus 3 - 4 Monomeren

2. Elongation = Actin-Monomere lagern sich an beiden Seiten des Kerns an und verlängern ihn

3. Steady state = Stationärer Zustand indem sich Bindung und Ablösung der Monomere von den beiden Enden das Gleichgewicht halten

Fällt die Konzentration an frei vorliegenden Monomeren unter die kritische Konzentration c*, kommt es nicht mehr zur Polymerisation, sondern zur Depolymerisation

• Einfacher Fall: Einzelsträngige Polymerketten

• Double Stranded Polymer Chains

  • Bindung an ein schon bestehendes Filament An (starke Interaktion)

  • Bindung zweier Monomere A1 (schwache Interaktion) -> Stärke der Interaktion ist proportional zur Fläche

Insgesamt zeigt sich, dass nur eine geringe Anzahl an Filamenten wirklich wachsen kann. Die Konzentration an freien Dimeren ist außerdem sehr gering. Moleküle wie der arp2/3-Komplex können als Nucleus (Ausgangspunkt) fungieren und dienen der Induktion der Verzweigung eines Filaments in zwei gleiche Tochterfilamente.

• ATP-Aktin bindet stärker an das +Ende, allerdings auch stärker an das - Ende als das ADP- Aktin

  • Die Dissoziation ist nicht so stark ausgeprägt

• ADP-Aktin ist dagegen deutlich schwächer in seiner Bindung, weshalb es leicht dissoziiert

  • Dissoziation stark ausgeprägt (sowohl an + als auch am - Ende)

• Ebenfalls sehr stark konserviert in allen eukaryotischen Zellen

• Kommen sowohl in permanenten (Flagella und Neuronen) als auch in dynamischen Strukturen (Mitose) vor -> Aktin ist nie permanent

• Neben seiner Rolle im Cytoskelett, sind die Strukturen auch im intrazellulären Transport wichtig (Vesikel, Granulen, Organellen)

• Besteht aus Heterodimeren, die aus α und ß-Tubulin bestehen

• Jedes Heterodimer bindet zwei GTP-Moleküle

• Polare Dimere (α-Tubulin mit GTP gebunden und ß-Tubulin mit GDP gebunden) polymerisieren zu Protofilamenten, von denen 13 zusammen eine zylindrische Röhre formen

• Alle Mikrotubuli starten vom Zentrum, wobei das negative Ende immer am Zentrum liegt

1. Formation der Protofilamente aus α und ß-Tubulin

2. Zusammenlagerung der Protofilamente

3. Elongation der Mikrotubuli

1. Die Polymerisation von Microtubuli findet nur bei physiologischer Temperatur von ca. 30 °C statt (Aktin kann auch langsam bei kalten Temperaturen (4 °C) polymerisieren)

   • Die Temperaturabhängigkeit zeigt, dass die Polymerisation abhängig von der Dissoziation von Wasser ist (Hydrophober Effekt)

2. Die Polymerisation von Microtubuli ist abhängig von GTP und Ca2+ (Aktin - ATP und Mg2+)

• zur Organisation von Cilia und Flagella (dienen beide der gezielten Bewegung) und vom Spindelapparat (um die Chromsomen zu trennen)

  • Cilia = Zuständig für den Vesikeltransport, sehr klein und in einer Zelle in einer Vielzahl vorhanden

  • Flagella = Zuständig für die Zellbewegung, lang und ein bis zwei pro Zelle vorhanden

• Zwei einzelne MT sind im Zentrum lokalisiert, während an der Außenseite neun weitere MTs vorhanden sind, die jeweils durch Nexin verbunden werden

• Neun radiale Speichen zeigen von den äußeren MT zu denen im Zentrum

• Dynein auf den MTs ist für die Kraft, die für die Bewegung gebraucht wird zuständig, während die direkte Bewegung durch die MTs entsteht

• Fasern, die durch die Polymerisation von Proteinen wie Keratin, Lamin und Vimentin gebildet werden

• Wichtig für Haut und Haar, sowie das Gerüst für die Myofibrilen in Muskeln und der Stabilisation der Struktur von tierischen Zellen und Gewebe

• “Stress-Strain Relationship”

  Materialien können nach dem Young Modulus (Elastizität) eingeordnet werden, welcher sich aus dem Verhältnis von Stress und Belastung (Strain) ergibt

• E = Stress / Strain

• Umso kleiner E, desto softer

1. Bending (Biegung) des Stoffes um einen Abstand δ

2. Buckling (Knicken) des Stoffes nach der Eulerschen Gleichung

Ein Motor konvertiert Energie in Bewegung oder mechanische Arbeit.

In der Natur gibt es verschidene molekulare Motoren (Motorproteine). Die Natur unterscheidet dabei zwischen linearen Motoren und Rotationsmotoren.

• Die Hydrolyse von ATP führt zum Gewinn von 80 pN Kraft über 1 nm

• Das Coulomb-Potential zwischen zwei Ladungen in Wasser beträgt dagegen nur bis zu 3 pN über 1 nm

• Die Thermale Energie ist dagegen etwas höher anzusetzen, bei ca. 4 pN über 1 nm

Die ATP Hydrolyse führt zur kleinen Konformationsänderungen in einer Domäne des Proteins, welche als Bewegung entlang des Cytoskeletts verwendet wird

• Beispiele sind Myosin (Aktin), Kinesin (Mikrotuboli) und Dynein (Mikrotuboli)

Bei dem Transport von Vesikeln durch Polymerisation des Cytoskeletts beispielsweise von Aktin, wird ein chemisches Potential von 8 kBT erzielt, welches auf die Länge eines Monomers gerechnet eine Kraft von 10 pN (10*10^-12) ausmacht.

Um den Sinn von Motoren zu erkennen, muss man diese Kraft nur mit der Kraft vergleichen, die nötig wäre, um ein Vesikel mit konstanter Geschwindigkeit entlang eines Filaments zu bewegen. Über die Stoke ́sche Gleichung kann man diese Kraft berechnen.

-> Die Kraft die benötigt wird liegt im Nano (10^-9) Bereich

-> Die Polymerisation eines einzelnen Filaments ist nicht effektiv, man braucht Molekulare Motoren.

• Die verschiedenen Arten der Myosine weisen unterschiedliche Eigenschaften und Strukturen auf, dienen alle insgesamt aber dem Transport entlang von Aktinfilamenten durch die Hydrolyse von ATP

• Beispiele sind Myosin I (Zellbewegung), Myosin II (Muskelkontraktion), Myosin V (mRNA Transport) oder auch Myosin VI (Membrantransport)

• Hauptbestandteil der Myofibers in Skelettmuskeln und Muskelzellen Besteht aus zwei schweren und zwei leichten Ketten

• Die schweren Ketten besitzen die Motordomäne, welche die ATP-Bindestelle enthält, sowie das coiled-coil Dimer

• Die leichten Ketten bilden eine Calmodulin-ähnliche Struktur und wickeln sich um das Ende der schweren Domäne

• Myosin bindet mit dem Kopf (schwere Kette) an das Aktin Myofilament

  -> ADP und Pi sind gebunden (high-energy configuration)

• Dann erfolgt der power stroke, bei dem der Myosinkopf sich nach vorne entlang des Aktinfilaments schiebt und ADP und Pi entlässt

• ATP wird gebunden und die Bindung an das Filament wird gelöst (low-energy configuration)

• ATP wird zu ADP und Pi gespalten und der Myosinkopf richtet sich zur neuen Bindung auf

Der ganze Zyklus dauert ca 30 ms, von denen 2 ms auf den power stroke, also die eigentliche Bewegung entfallen

• Messung der FRET Efficiency E im Gleichgewichtszustand und zeitaufgelöst

• Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

• Die FRET Effizienz E ist dabei stark von der Distanz zwischen Donor und Akzeptor abhängig (= r)

• Über FRET lassen sich so die Konformationsänderung bei ATP Hydrolyse detektieren und außerdem zwei unterschiedliche Zustände vor dem Power stroke identifizieren (Aktin-Filament mit Akzeptor und Myosin mit Donor ausgestattet)

Der Motor vollzieht nur einen einzigen Schritt bevor er wieder freigesetzt wird

Der Motor vollzieht mehrere aufeinander folgende Schritte entlang des Filaments

• Berechnung des Verhältnisses der Zeit (“Duty ratio”"), in der Myosin stark gebunden vorliegt, mit der Zeit, den der gesamte Zyklus benötigt

• Wenn die beiden Köpfe unabhängig voneinander arbeiten, ist die Durchschnittsgeschwindigkeit, das Doppelte eines der Köpfe

• Bei N Motoren würde das bedeuten, dass sich der non-processive motor in einen processive Motor wandeln würde

• Im Gegensatz zu dem Aktin-Myosin-System, ist die Bewegung entlang der Mikrotuboli unabhängig von der Kinesindichte

• Dies weist ganz klar auf eine processivity hin, und zeigt eine Duty ratio r, welche bei 0,5 liegt und nicht so gering ist wie bei Myosin II

Ein Beispiel für Rotationsmotorproteine ist die F0F1-ATPase (= kleinster Rotationsmotor) -> sehr effizient (kann kein man-made Motor erreichen)

•  Die F1-Domäne wird durch einen Protonengradienten betrieben, der elektro-mechanische Energie in chemische Energie verwandelt (ATP)

Beispiele für Testung

• Verwendung eines Rotationsassays bei dem eine der ATPasen an einen Ni-NTA (His-tag Verknüpfung) umhüllten bead gebunden wird und dessen Aktinfilament sich über eine Streptavidinkopplung drehen lässt

  • Das gebundene Aktin zeigt, dass die ATPase eine Rotation vollzieht pro ATP eine Bewegung um 120° - drei ATP pro Rotation

  • erstes Experiment das gezeigt hat, dass der Motor rotiert

    
    

• Alternativ kann anstatt des Aktins auch ein magnetischer Bead verwendet werden, der dann Rotationen im Uhrzeigersinn vollzieht (ausgelöst durch ein rotierendes Magnetfeld)

  • ATP-Synthese

• Auch kann das Gleiche gegen den Uhrzeigersinn rotieren (ATP -Hydrolyse)

  • Aus der Geschwindigkeit der Rotation, kann dann die ATP-Konzentration gefolgert werden

  • Bei niedriger Konzentration kommt es eher zur ATP-Synthese (mit dem Uhrzeigersinn), während bei hoher ATP-Konzentration die ATP-Hydrolyse stattfindet (gegen den Uhrzeigersinn)

• Diffusion wird von thermischer Energie getrieben und ist immer vorhanden solange T > 0 K

• Brownsche Bewegung wird immer beobachtet, wenn kleine Moleküle auf größere Objekte treffen

• Bei einem Konzentrationsgradienten, werden die Moleküle immer von einem Bereich mit hoher Konzentration zu dem mit niedriger Konzentration diffundieren (hohe statistische Wahrscheinlichkeit)

• Diffusion führt außerdem zu einer Erhöhung der Entropie (Konzentrationsausgleich) und ist somit energetisch bevorzugt

1. Ficksches Gesetz = Die Flussrate ist proportional zum Konzentrationsgradienten

2. Ficksches Gesetz = Die Änderung der Konzentration mit der Zeit ist durch die Diffusion getrieben

• Auf jedes Partikel in Lösung wirkt eine Reibungskraft, welche nach dem Stoke ́schen Gesetz berechnet werden kann

• Zusammen mit Albert Einstein entstand daraus die Stokes-Einstein Relation, welche den Diffusionkoeffizient beschreibt

• Methode zur Bestimmung des hydrodynamischen Radius RH

• Streulicht eines Lasers an einer gelösten bzw. suspendierten Probe wird analysiert

• Das Streulicht interferiert miteinander und lässt sich in der Streuintensität feststellen

  • Zeitliche Analyse der Fluktuation der Interferenzen auf Grund der Brown ́schen Bewegung lassen sich zur Berechnung der Geschwindigkeit der Teilchen verwenden (über eine Autokorrelationsfunktion)

  • Berechnung des Diffusionskoeffizienten nach der Stokes-Einstein-Relation und damit auch den hydrodynamischen Radius

Auf ein Partikel in einer Lösung wirken neben der Gravitationskraft G, auch eine Aufstiegskraft L, sowie eine Reibungskraft F (Stoke ́sche Reibung), welche in die entgegen gesetzte Richtung der Summe der Kräfte G und L wirkt.

Das Partikel kann dabei durch die Masse mp, das Volumen Vp und die Dichte ρp beschrieben werden, während das Medium eine Dichte ρ und eine Viskosität η aufweist.

-> Anwendung der Sedimentation bei großen Unterschieden in der Dichte der Partikel und des Mediums

• Bei kleinen Partikeln wie Proteinen oder Organellen, reicht die Gravitation nicht aus um die Sedimentation durchzuführen

• Mit Hilfe der Zentrifugalkraft können dagegen auch biologische Makromoleküle sedimentiert werden

• Die Unterschiede in den Sedimenationskoeffizienten können dazu genutzt werden, diverse Komponenten von Gewebe durch Zentrifugation zu trennen (umso größer / schwerer -> höherer Sedimentationskoeffizient)

• Durch einen Dichtegradienten im Medium lassen sich meherer Fraktionen in einem Spin aufteilen

• Diffusion eines gelösten Stoffes über eine semipermeable Membran.

• Nach dem van ́t Hoff ́schen Gesetz ist der osmotische Druck definiert als der Druck der benötigt wird um den Gleichgewichtszustand zu erreichen, sodass keine Diffusion mehr stattfindet.

• Bei Red Blood cells kann die Osmose beispielsweise dazu führen, dass die Zellen platzen. Aus diesem Grund wird eine isotonische Umgebung benötigt.

• Paramecium und andere Organismen in Frischwasser sind sehr hypertonisch (höherer osmotischer Druck) im Gegensatz zu ihrer Umgebung.

• Um den “osmotic Burst” zu verhindern, wird daher eine kontraktile Vakuole eingesetzt, die Wasser aus der Zelle herauspumpen und wiederaufnehmen kann.

• Die Natur wirkt der Osmose über kontraktile Vakuolen entgegen

• Ionenkanäle bestehen aus vier bis sechs Untereinheiten

• Bis zu 108 Ionen können durch den Kanal diffundieren (105 mal mehr als durch Carrierproteine)

• Einige Ionenkanäle selektieren nur durch Größe oder Ladung (nAcH-Kanal), während andere einen Selektivitätsfilter besitzen (K+-Kanal)

• Die meisten Ionenkanäle können zwischen Offenem und geschlossenem Zustand wechseln

• Konformationsänderung durch Bindung eines Liganden, Spannungsgesteuert oder durch mechanische Stimulation

• Erleichtern die Bewältigung der Membran für diverse Moleküle durch:

  • Bindung der Moleküle an einen Carrier

  • Konformationsänderung des Carriers

  • Das Molekül diffundiert wieder ab

• Passive Carrierproteine benötigen keine Energie mit Ausnahme von thermischer Energie, während aktive Carrier ATP zur Funktion benötigen

• Bewegung der Moleküle mit dem Konzentrationsgradienten

• Die Moleküle können in beide Richtungen transportiert werden

  • Wird auch erleichterter Transport genannt

1. Zwei verschiedene Energiequellen werden für den Transport durch Carrierproteine entgegen des Konzentrationsgradienten verwendet:

   1. “Coupled transport” bei dem die freie Energie, die durch den Transport eines Moleküls entlang seines Konzentrationsgradienten zum Transport eines Moleküls entgegen seines Gradienten genutzt wird

   2. ATP-abhängiger Transport (ABC-Transporter), bei dem die ATP-Hydrolyse zum Transport entgegen des Konzentrationsgradienten genutzt wird (ABC = ATP-binding cassette)

• aktives Carrier Protein

• Die Na+/K+-ATPase ist in fast allen Zellen vertreten, wobei sie besonders in Nervenzellen eine sehr hohe Dichte aufweist.

• Bei jedem Zyklus werden dabei 3 Na+ aus der Zelle transportiert, während gleichzeitig 2 K+ in die Zelle verfrachtet werden.

• Da dabei Netto eine positive Ladung nach außen transportiert wird, erzeugt die ATPase damit ein elektrisches Potential.

•  Uniporter transportieren nur ein Molekül in einem Zyklus

• Symporter transportieren dagegen ein Molekül (mit seinem Gradienten) und gleichzeitig ein zweites Molekül (entgegen seines Gradienten) in die gleiche Richtung

• Antiporter transportieren ein Molekül in die eine Richtung (mit seinem Gradienten) und gleichzeitig ein zweites Molekül in die entgegen gesetzte Richtung (entgegen seines Gradienten)

  • Nutzung des Ionengradienten des ersten Moleküls, um das zweite zu transportieren

Vesikel und Vakuolen können mit der Zellmembran fusionieren und somit zur Freisetzung und dem Transport von Molekülen aus und in die Zelle eingesetzt werden.

• Endozytose = Ein Molekül führt zur Einstülpung der Membran nach innen, wobei dann ein Vesikel um das Molekül gebildet wird beispielsweise bei der Phagozytose.

• Exozytose = Dabei handelt es sich um den Prozess der Endozytose, nur in umgekehrter Richtung, aus der Zelle hinaus.

Die Fluidität der Lipidmembran erlaubt die Diffusion von Lipiden und Proteinen zur Interaktion untereinander.

-> Messung über Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)

• Verwendung eines Lasers (z.B. Argon-Laser) zum bleichen einer auf einem Objektträger fixierten Membran

• Bleichen an genau einer Stelle über eine Lochblende

• Das Ganze wird dabei über eine Kamera beobachtet und dokumentiert

• Die Lipide werden dabei Fluoreszenz-markiert, wobei die Fluoreszenz durch das Bleaching, an dem bestimmten Fleck zerstört wird

• Messung der Zeit, die benötigt wird um an dieser Stelle wieder vollständige Fluoreszenz zu erhalten

Die Natur “schneidert” Oberflächen, um den Kontakt zu Wasser in der Umwelt zu optimieren.

Beispiele:

Oberflächen von Insekten und Tieren, wie beispielsweise der Wasserläufer, der auf der Wasseroberfläche laufen kann oder Federn, die Wasser abstoßen.

• Abstoßung von organischen und viskosen Kontaminanten (Dirt, pathogen organismen)

• Verschiedene Pflanzen haben unterschiedliche Oberflächen, die unterschiedliche Strukturen aufweisen → rough surfaces

In Abhängigkeit des Winkels θ definiert man die Benetzung der Oberfläche.

-> π = 180°

-> Messung eines Kontaktwinkels ist durch eine Kamera möglich, mit deren Hilfe man anhand des aufgenommenen Bildes den Winkel messen kann

• Ein Gleichgewichtswinkel, wie er bei der Young Gleichung vorausgesetzt wird kommt bei realen Oberflächen nicht vor

• Stattdessen wird ein Winkel gemessen, der stark von der Probe abhängig ist (static contact angle)

• Messung der Kontaktwinkel zur Bestimmung der freien Oberflächenenergie (γsv) mit θadv (advance) und θrec (retraction)

• Jeweiliges Verhalten eines Regentropfens kann über diese Winkel beispielsweise vorausgesagt werden

Abwandlung der Darstellung zur Young Gleichung. Hier ist der Winkel θ* nicht gleich, sondern immer unterschiedlich je nach Material. Das Ganze wird unter der Annahme betrachtet, dass ein Tropfen sich auch in die “Kerben” der Oberfläche einordnet. Die Rauheit der Oberfläche wird in diesem Ansatz über einen Faktor r einbezogen.

-> Wetting contact

Problem: Wenzels Approach kann keine Kontaktwinekl nahe der 180° erklären (non-surface wetting)

Abwandlung der Darstellung der Young Gleichung, hier allerdings im Gegensatz zu Wenzels Ansatz mit einer anderen Idee bezüglich dem Kontakt von Tropfen und rauer Oberfläche. Hier setzt sich der Tropfen nicht zwischen die Vorstände

-> Composit contact

Experimentelle Ansätze zeigen, dass das Cassie Modell dem Zustand in der Natur am nächsten kommt.

• Nachweise durch raue organische Oberflächen, der Benetzung eines Blattes mit dessen Wachsoberfläche und auch die Herstellung von Oberflächen mit definierter Rauheit

• “Self-Cleaning” von Kontaminanten auf Oberflächen

• Glatte Blätter können in der Natur nicht durch Regenwasser von Kontaminanten befreit werden

• Raue Blätter hingegen können durch Regenwasser gesäubert werden

  Grund dafür ist wahrscheinlich der Ansatz des “composite” Contact nach der Theorie von Cassie (kleiner Kontakt zwischen Oberfläche und Kontaminante -> Winkel sehr hoch)

• Nanopartikel können als Spray auf Oberflächen aufgetragen werden. Die Auftragung dient dazu, die Oberfläche rau und somit abweisend gegen Kontaminanten zu machen

• “super-hydrophobic coating” -> Lotus Effekt

Natürliches Licht wird als sphärische Welle propagiert, welche sich im Vakuum mit Lichtgeschwindigkeit von c0 = 3 * 10^8 = 300.000.000 [m/s] bewegt

Jeder Punkt der Wellenfront dient als Ausgangspunkt für sekundäre Wellen, die in alle Richtungen wandern können

Die tangentiale Oberfläche, welche mit der Welle in Kontakt steht, bestimmt die neue Wellenfront

λ = 400 -750 nm.

n1, n2 = Brechungsindex der Medien (neigt sich gegen die Normale, wenn Eintritt in dichteres Medium)

• Licht nimmt immer den Weg der kürzesten Zeit

• Brechungsindex ist abhängig von Wellenlänge und T

Wenn Licht von einem Medium mit höherem Brechungsindex in eines mit niedrigerem Index übertritt, wird das Licht total reflektiert an der Oberfläche. Dazu muss es den kritischen Winkel für totale Reflektion überschreiten θc

Wenn θ2 = θc, ist der Austrittswinkel θ1 = 90°. Wandelt man Snell ́s Gesetz nun danach ab, kann man den Winkel für total Reflektion berechnen. Von hoher Dichte zu niedriger Dichte -> Ablenkung des Lichtstrahls weg von der Normalen

• Konvergenz und Divergenz durch Linsen kann als Brechung von Licht durch ein Medium gesehen werden (hier nur auf Konvexe Linsen bezogen)

• Bis zu einer gewissen Distanz f, der Brennweite von der Linse konvergieren die parallel einfallenden Lichtstrahlen (im Fokuspunkt), wohingegen Lichtstrahlen aus einer Quelle, welche sich in der Brennweite befindet, nach Durchgang durch die Linse divergieren

Ist die Dicke der Linse vernachlässigbar klein, kann die Distanz vom Objekt zu der Linse S1 (Gegenstandsweite) in Relation zur Distanz von der Linse zum Bild S2 (Bildweite) gebracht werden (gemessen wird bis zur Mitte der bikonkaven Linse)

Beugungspunkt (B) = Position an der man ein Bild durch Illumination der Proben von beiden Seiten (A und C) erhalten kann. (konjugierte Ebene zueinander - Gegenstand - Zwischenbild - Detektor)

• Verzerrung im Bild durch ein optisches System im Gegensatz zum Original (deshalb keine unendliche Hintereinanderschaltung von Linsen möglich)

• Es gibt sphärische und chromatische Aberration

• Sobald Strahlung eine Linse mit einer sphärischen Oberfläche trifft, werden die Strahlen, welche weit oberhalb der optischen Achse eintreten stärker fokussiert, als die näher an der optischen Achse

• Kein perfekter Fokuspunkt (Problem bei Teleskopen) -> Kein ideales Bild erzeugt, sondern unscharf

1. Longitudinal (nach vorne und hinten entlang der optischen Achse)

   • Eine Linse kann nicht alle Wellenlängen in derselben Ebene fokussieren (Verschiebung)

   • Kürzere Wellenlängen fokussieren vor dem Detektor, längere Wellenlängen dahinter

   • Weißes Licht hat verschiedene Komponenten als anders farbiges Licht

1. Lateral (in die Tiefe oder Höhe)

   • Die laterale Verschiebung von Farbbildern mit unterschiedlichen Farben in verschiedenen Fokusebenen

   • Ebenfalls verzerrtes Bild

• Die fokussierte Strahlung erzeugt eine helle Region in der Mitte (Airy Disk), die von konzentrischen Kreisen umringt wird. Dieses Muster wird durch Beugung des Lichts erzeugt.

• Wird die Distanz zwischen zwei Airy Disks kleiner (bei zwei Lichtquellen), kann man die beiden Objekte nicht mehr voneinander differenzieren

Das erste beugungsminimum überlappt mit dem nächsten Peak

Zeigt die kleinste Distanz zwischen zwei Lichtpunkten an, bei der diese noch voneinander unterscheidbar sind

Der minimale Objektabstand wird als Auflösungsgrenze oder Abbe-Limit bezeichnet

Die Strahlung, die durch den Doppelspalt gelangt (s = Breite, center- to-center Distanz = d) sind in Phase mit den Winkeln, die die Beziehung erfüllen.

• Licht mit einer kurzen Wellenlänge - Elektronenmikroskopie mit wenigen Nanometern

• Medium mit einem hohen Brechungsindex - Öl-Immersion mit n = 1,52

• Ein Objektiv mit einer hohen numerischen Aperatur - NA = 1,3

Maximale Auflösung von 200 nm mit Licht und den genannten beiden anderen Faktoren

• Dient dazu, die Oberfläche des Objekts homogen und parallel zu beleuchten, um gleichmäßige Informationen über die gesamte Fläche zu erhalten, die sichtbar ist

• Parallele und homogene Illumination ist notwendig

• Köhler optimierte eine anspruchsvolle Illumination, welche in kommerziellen Mikroskopen immer noch eingesetzt wird

• Lichtquelle befindet sich genau in der Brennweite, zur Divergenz der Lichtstrahlen

Eine Sammellinse fokussiert das Licht einer Lichtquelle (befindet sich außerhalb von f) in einen Fokuspunkt, welcher genau in der Brennweite f des Kondensors liegt. Der Kondensor parallelisiert das Licht anschließend und leuchtet die Probe aus.

Kontrolle der Intensität der Illumination durch das Einbringen eines Diaphragmas (= Blende). Da eine reale Lichtquelle keine Punktquelle ist, kann man so verhindern, dass Licht von weit außerhalb des Zentrums kommt. Mit dieser Blende beeinflusst man den Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops.

Die Blende wird dabei in einer konjugierten Ebene zur Lampe positioniert.

1. Abblenden des Lichts, welches weit von dem Lichtzentrum entfernt ist

2. Erlaubt den Kontrast eines Bildes zu erhöhen auf Kosten der Auflösung (Apertur open = höhere Auflösung; Apertur closed = höherer Kontrast)

Paralleles Licht wird durch eine Sammellinse im Brennpunkt zusammengeführt, welcher außerhalb der Brennweite des Kondensors liegt. Dadurch wird das Licht durch den Kondensor fokussiert und zwar in der Probe.

• Einfügen eines Diaphragmas an den Brennpunkt der Sammellinse

• Diaphragma befindet sich an der konjugierten Ebene zur Probe (im Mikroskop wäre hier das Zwischenbild)

• Kontrolle des Illuminationsbereichs ist dadurch möglich

  -> Dient der Minimierung des Beobachtungsbereich bei Fluoreszenzproben außerhalb der interessanten Region

• Field Stop = Blende an der konjugierten Ebene der Probe, welche das Illuminationsfeld in seiner Größe einschränkt. Damit beeinflusst der Field Stop den bildgebenden Strahlengang und nicht wie der Apertur Stop den Beleuchtungsstrahlengang.

Konjugiert, da sie gleichzeitig im Fokus sind und überlagert beobachtet werden können (von unten nach oben betrachten, was sind die Wellen?, wie wird Licht parallel ohne Linse)

Dargestellt sind unter anderem bildgebender Strahlengang (links) und Beleuchtungsstrahlengang (rechts).

• Offenlegen der Phaseninformationen von Licht (z.B. 1/1000 des Strahls wird durch eine Zellmembran abgelenkt/gebeugt)

• Eine Änderung der Phase erhöht den Kontrast (Lichtgeschwindigkeit wird in einem Medium durch den Brechnungsindex reduziert)

  • Keine Notwendigkeit zur Veränderung des Apertur Stops für die Anpassung des Kontrasts

• Intensität = das Quadrat der Amplitude

• Verwendet die Interferenz von kohärentem / monochromatischem Licht

• Beruht auf der Bildung von Interferenzen des Lichts

• Licht wird an der oberen und unteren Grenzfläche der Struktur refletkiert und interferiert miteinander

  • Entstehung eines Interferenzmusters, welches Aufschluss über die Dicke der Struktur liefert

  • Linear polarisiertes Licht wird durch einen Polarizer erzeugt

Das konfokale Pinhole unterdrückt Licht das nicht aus der Fokalebene kommt (außerhalb des Fokus). Es macht sowohl 3D-Auflösung, als auch einen hohen Kontrast möglich.

Die Bildebene wir nach und nach abgerastert und somit das Gesamtbild erzeugt.

• Das ganze Bild entsteht erst durch Abrasterung der Probe in einem Bildspeicher

• Es ist echte dreidimensionale Auflösung vorhanden

• Es können Bilder entlang der optischen Achse gemacht werden

• Beim Defokussieren wird das Bild nicht unscharf, es wird dunkel

• Aberrationen führen rasch zu Signalverlust

• Erreichte Auflösungen: lateral 200 nm, axial 500 nm

• Die 4Pi-Optik nutz die kohärente Überlagerung der Strahlen zweier sich gegenüber liegender Objektive und verbessert dadurch die axiale Auflösung auf bis zu 100 nm (Faktor 3-6 Verbesserung)

• Die laterale Auflösung bleibt im wesentlichen gleich

• Mit den gegeneinander laufenden Lichtwellen werden die kleinsten beugungbegrenzten Spots überhaupt erreicht

• Daher ist die 4Pi-Optik der bestmögliche Ausgangspunkt auch für andere Techniken. Vor allem, wenn es um die höchsten axialen Auflösungen geht