Liste der wichtigsten makromolekularen Maschinen
DNA/RNA Polymerase
Spleißosom
Ribosom
Chaperon
Proteasom
Fehlerrate DNA Polymerase
10^-9 pro Basenpaar
Fehlerrate RNA Polymerase
10^-4
Fehlerrate Ribosom
Wo findet reverse Transkripion statt?
In Retroviren und bei Eukoryonten bei der Telomersynthese
Prionproteine Funktionsweise
triggern Replikation von infektioösen Fibrillen
Essentielle kovalente Bindung
in Nukleinsäuren
in Proteinen
In Nukleinsäuren: Phosphodiesterbindung
In Proteinen: Peptidbindungen und Cystein-Cystein DisulfidBrücken
Wo kommen Cystein-Cystein Disulfidbrücken vor?
Meistens nicht im Zellinneren, da sie nicht dynamisch sind, man sie wenig abbauen kann, und das zelluläre reduzierende Milieu, das die Bindungen spalten kann
welches sind die wichtigsten nicht-kovalenten Kräfte? Wozu tragen die schwachen Kräfte bei?
Elektrostatische Wechselwirkungen
Wasserstoffbrücken
van der Waals Interaktionen
hydrophobe Interaktionen
→ Proteinfaltung und Oligomerisierung, Assemblierung höherer Ordnung, Molekulare Erkennung
worauf basieren elektrostatische WW, Wasserstoffbrücken, und van der Waals Interaktionen?
Alle sind elektrostatische Interaktionen.
Elektrostatisches Potential Reichwerte ~ 1/r
Kräfte zwischen Ladungen ~1/r²
Wie tragen die Ladungen der äußeren Aminosäuren zu Funktion bei?
Durch die Ladungsverteilung können nur komplementäre Moleküle an das Protein binden → Spezifität
(durch delokalisierte Ladungen ist auch Direktionalität möglich)
Wie weit reichen die repulsiven/anziehenden Kräfte von van der Waals Interaktionen?
repulsiv: ~1/r¹²
anziehend ~1/r^6
Wie funktionieren Wassersteoff-Brückenbindungen?
das Protein wird partiell zwischen dem Donor und dem elektronegativeren Akzeptor geteilt.
Wie sieht der hydrophobe Effekt aus?
Zwei hydrophobe Moleküle joinen zu einem größeren Komplex
→Entropiegetrieben, denn die hydrophoben Grupppen setzen die Wassermoleküle von der Grenzfläche frei.
Sind weit reichend
Wie beeinflusst Temperatur die Gibbs free energy bei Faltung und Assemblierung?
positiv →endergoner Prozess
negativ → exergoner Prozess
ΔG = ΔH-TΔS
ΔH (Enthalpie) ist immer negativ bei Faltung und Assembilerung
Wenn ΔH nahe null ist, muss die TΔS größer und positiv sein. ΔS (Entropie) wird von der Ordnung im Komplex vs Freisetzung von Wasser beeinflusst.
→ Temperatur treibt Ordnung
wofür stehen ASA, MSA, und BSA? Wie wird BSA berechnet?
ASA: Solvent accessible surface area
MSA: molecular surface area
BSA: buried surface area
BSA(XY) = ASA(X) + ASA(Y) - ASA(XY)
Was ist die Formel für die Dissoziationskonstante K_d?
K_d = [A][B]/[AB] = 1/Affinität
Wann ist eine Dissoziationsrate bedeutungsvoll?
Wenn sie in vivo stattfindet.
Mikomolare K_d in vitro ist grenzwertig.
Nanomolare K_d ist Indikation für stabilen Komplex.
Wie wird α (Kooperativitätswert) berechnet? Was bedeutet er?
α = Kd total / Kd effektiv
α = 1 : nicht kooperativ
< 1: positive Kooperativität
> 1: negative Kooperativität
Warum formen Proteine so häufig Komplexe?
Ein Multimer kann komposite aktive Zentren ausbilden
Evolutionären Kräfte sind in Homomultimeren stärker
Allosterie und Kooperativät werden leichter etabliert
Höhere Geschwindigkeit und Effizienz in Multienzymkomplexen
Transporter können größeres Cargo berabeiten
Mehr Stabilität durch Größe
Größere Fehlertoleranz in der Proteinsequenz
Auf welcher Zeitskala finden makromolekulare Funktionen statt?
10^-6s bis 1s
Bei kleineren Zeitskala e.g. bond vibration, side chain rotation
Wie ändern allosterische Regulatoren die Proteinfunktion?
Wie sieht die Reaktionskurve aus? Geschwindigkeit vs Substratkonzentration
Der Ligand induziert eine Konformationsänderung, die auf andere Untereinheiten übertragen wird
sigmoide Kurve
Wie hoch ist die Konzentration von Proteinen und RNA im Zytoplasma?
300-400mg/ml
Wie beeinflusst Molecular Crowding Reaktionen?
Die effektive Konzentration ist höher als die tatsächliche
Favorisierung der Bindung von Makromolekülen → Kondensierung, Aggregation
Reduzierte Diffusionsraten, insbesondere bei großen Komplexen
Was sind tRNAs?
Adaptormoleküle zwischen Genen und Proteinen
werden Beladen durch aminoacyl-tRNA Synthasen
Was sind die Untereinheiten des Ribosoms bei
Prokaryonten
Eukaryonten
30S + 50S → 70S
40S + 60S → 80S
Was blieb in der Evolution der Ribosomen gleich? Was wurde verändert?
der Kern bleibt konserviert
spezifische Addition meistens and der Peripherie
was macht die kleine UE des Ribosoms? Was macht die große? Welche Bindestellen gibt es?
Kleine UE: Dekodierungszentrum
Große UE: Peptidyltransferasezentrum
A/P/E
Was ist beim Ribosom die Hybridposition?
A/P und P/E stehen übereinander. Entsteht durch Rotation der kleinen UE.
Was macht EF-Tu? Welche Domänen hat es?
EF-Tu ist ein Elongationsfaktor, der die aa-tRNA liefert.
Ist eine GTPase mit An/Aus Funktion.
Die P-Schleife binded das G-Nukleotid.
Sw1 und Sw2 sind Switchloops, die ihre Konformation abhängig vom Nukleotid ändern.
Wann ist EF-Tu angeschaltet, wann aus?
An: GTP, an aa-tRNA gebunden
Aus: GDP, nicht an tRNA gebunden
Wie wird bei der Translation die richtige aa-tRNA gewählt?
EF-Tu:GTP:aatRNA bindet an das Ribosom an die T-Stelle. die aa-tRNA ist dabei in einer A/T-konfiguration. An der kleinen Untereinheit wird durch die Interaktion mit der mRNA dekodiert. Wenn die tRNA falsch ist, passt sie nicht an das Kodon. Die 16S rRNA erkennt die A-helix-Geometrie.
Wenn die Aminosäure passt, wird GTP in EF-Tu hydrolysiert und es dissoziiert. aa-tRNA geht in die A-Stelle.
Wie katalysiert das Ribosom die Peptidbindung?
der Peptidyltransfer ist eine spontante Reaktion. Im Peptidyltransferasezentrum der großen UE werden die tRNAs und Aminosäuren in räumliche Nähe gebracht. Nur die rRNA, nicht ribosomale Proteine, sind an der Katalyse beteiligt.
Was tut EF-G? Wie sieht die Struktur aus?
Stabilisiert die hybride Konformation des Ribosoms während sich die mRNA bewegt. Durch die GTP-Hydrolyse dreht sich die kleine UE wieder zurück.
Die Struktur ähnelt der von EF-Tu:tRNA
Was tun RF1, RF2 und RF3?
RF1, RF2 sind Releasefaktoren, die Stoppcodons erkennen. Die Übertragung eines Wassermoleküls auf die tRNA-Peptidkettenbindung wird katalysiert.
RF3 ist eine GTPase, die den Release von RF1 und RF2 vom Ribosom katalysiert
Was tut RRF?
RRF ist für die Dissoziation der Ribosomeinheiten zuständig.
Wie funktionieren viele Antibiotika?
Sie zielen auf die aktiven Zentren des Ribosoms.
Was ist ein Trigger Faktor?
Ein bakterielles Chaperon, das an das Polypeptid am Ribosom bindet.
Hält die Aminosäurekette “fest”, damit sie sich nicht falsch faltet.
Was ist DnaK/Hsp70? Wie operiert es?
Ein Chaperon, das nah am Ribosom arbeitet. Ist ATPase:
Mit ATP gebunden -> offener Zustand, bindet Peptidkette per delivery faktor DnaJ. Das ATP hydrolisiert und DnaK schließt um die Peptidkette.
GrpE tauscht das ADP aus, und so wird die Kette wieder freigegeben.
Was sind Chaperonine?
Große, multimere Faltungsmaschinen. Helfen bei der finalen Faltung von Proteinen im Intermediärzustand. ATPasen.
Was ist GroEL?
Typ I Chaperonin in Bakterien.
Monomere bilden faßförmige Struktur aus zwei heptameren Ringen.
Wie operiert GroEL mit GroES?
Das Substrat bindet an den trans-Ring. ATP wird gebunden -> Konformationsänderung zu geschlossen am trans-Ring.
GroES bindet an GroEL und verdrängt das Protein in den Faltungskäfig.
Bis die 7 ATP hydrolisiert werden, bleibt das Protein im Käfig. Substrat und GroES werden freigesetzt indem ADP durch ATP ausgetauscht wird.
Was ist das Thermosom?
Ein Typ II Chaperonin in Archaen. Homooligomer.
Tonnenförmig, schließt zur Kugel durch ATP-Bindung und Hydrolyse.
Was ist TRiC/CCT?
Ein eukaryontisches Typ II Chaperonin. Heterooligomer.
Interagiert mit komplex gefalteten Proteinen, e.g. auch mit chromatin.
Was ist Hsp90? Wie funktioniert es?
Eukaryontisches Chaperonin.
Faltet spezifische teilweise gefaltete Substrate. ATPase, Dimer (sieht aus wei eine Klammer).
Klient kommt mit Hsp70 durch ein Adaptorprotein. ATP bindet. Cochaperone stabilisieren die geschlossene Konformation, und andere triggern die ATP-Hydrolyse, welche zur Freisetzung führt.
Was sind die Funktionen von Natively Unfolded Proteins? Aus welchen Aminosäuren können sie bestehen?
Funktion: oft Regulation. Bei der Interaktion mit Partnern werden sie strukturiert. Oft Stellen für Modifikationen.
AA: G, Q, P. Ungeladene hydrophile Aminosäuren.
Wie funktionieren extrazelluläre Endoproteasen?
Bauen unspezifisch Proteine ab, indem die katalytische Triade den tetrahedralen Übergangszustand stabilisiert.
Was tut Unfoldase?
Nimmt an der regulierten Proteolyse teil.
Per Degron wird signalisiert, dass das Protein abgebaut werden soll. Es bindet an die Unfoldase, die meist ATP-abhängig ist.
Unfoldase entfaltet das Protein und füttert es an die Protease.
Ist eine AAA+ ATPase.
Nenne Beispiele von Unfoldase-gekoppelten Proteasen.
Clp-Proteasen (in E. Coli):
ClpYQ (ClpY: unfoldase/AAA+ATPase, ClpQ Protease)
ClpA
Was sind AAA+ ATPasen? Wie sehen sie aus? Was ist ihre Funktion? Nenne ein paar Beispiele.
ATPase associated with activities in the cell
Sind ringförmig, können aus mehreren gestapelten Ringen zusammengesetzt sein.
Hauptprinzip: etwas geht durch die Ringe durch.
-> Unfoldase zuzelt das Protein durch den inneren Ring
-> Helikase öffnet den Doppelstrang
sonstiges Beispiel: Dynein
Womit werden Membranproteine gefaltet?
FtsH: die ATPase-domäne ist membranverankert.
Was ist das Proteasom?
Gibt es selten in Bakterien, aber in Archaen und Eukaryonten.
Degradiert polyubiquitinierte Proteine in kurze Oligopeptide.
Eukaryontisch: 26S-Proteasom (20S Core + 19S (regulatorisch))
Wie sieht das 20S Proteasom aus?
(⍺-Ring: äußerer Ring; β-Ring: innerer Ring) (x2) mit einer zentralen Öffnung.
Die ⍺-UE hat eine Extension, die das proteolytische Kompartment schließt und zur Regulation Kontakt hat.
Wie wird das 20S-Proteasom reguliert?
In Bakterien durch 11S-Partikel. In Archen durch PAN (related to 19S in Eukaryonten)
Nenne ein Beispiel einer Unfoldase
19S regulatorischer Partikel: Hat Ubiquitinrezeptoren. Spaltet das Ubiquitin ab. Geht per ATP in den “engaged” Zustand über.
Welche Proteine braucht man zur Transkriptionsinitiation in Prokaryonten?
Den Sigmafaktor, und die RNA-Polymerase.
Wofür braucht man für die Transkriptionselongation Energie?
Zum Erstaufschmelzen. Das Öffnen und Schließen der DNA ist insgesamt energieneutral.
In welche Richtung wird RNA synthetisiert?
5’ -> 3’
Was stellen Polymerase I, II, und III her?
I: rRNA
II: mRNA (snRNA, snoRNA)
III: noncoding RNA, tRNA, 5s rRNA
Woher kommt die Energie für die Elongation der RNA?
Von den einzubauenden Nukleotiden
Wie wird in der RNA-Polymerase elongiert?
Der Trigger Loop ist für die Basenpaarung zuständig (kann nur schließen, wie die Basenpaarung richtig ist), die Bridge Helix für die Translokation entlang der DNA.
Warum ist der Knollenblätterpilz giftig?
Er enthält ⍺-amanitin, das Polymerase allosterisch inhibiert.
Wie überwindet RNA Polymerase Arretierung?
1 Backtracking
2 TFIIS spaltet RNA (Nukleolyse)
Was ist 5’ capping?
5’ capping schützt die naszierende mRNA. Die Enzyme hierzu werden durch die C-terminale Domäne der Polymerase koordiniert.
Findet nach der Synthese von 20-30 Nukleotiden statt. Es wird ein GMP angefügt und Methyliert.
Wie wird die Transkriptionstermination eingeleitet?
In Bakterien wird eine Sequenz transkribiert, die einen Hairpin formt, gefolgt von einer A/U-reichen Sequenz, die leicht von der DNA dissoziiert.
In Eukaryonten ist die Termination an den 3’-polyadenylationsmechanismus gekoppelt. RNA cleavage-Moleküle erkennen eine sehr konservierte Sequenz. Die Polymerase transkribiert fröhlich weiter, und irgendwannmal hört sie einfach auch. Die Extra-RNA hat keinen 5’ cap und wird deswegen abgebaut.
Was machen TFIID, TFIIA und TFIIB?
TFIID: Gerüst für weitere TF
TFIIA/B stabilisieren TBP/TATA Komplex
TFIIB rekrutiert Pol II
Was macht TFIIH?
Entwindet DNA und phosphoryliert die CTD der Polymerase.
Wie interagieren Transkriptionsfaktoren mit der DNA?
Nur an der major groove, denn die minor groove ist zu klein.
Was macht der Trankskriptions-Mediator?
Vermittelt TFs, Enhancer, Silencer, Insulators mit dem PIC.
Wofür steht PIC?
Präinitiationskomplex
Wie wird U2-abhängig gespleißt?
Im Intron wird der Branch Point mit dem 5’-Ende des Introns verbunden, wobei dieser gespalten wird. Das Exonende wird mit dem Exon am 3’Ende verbunden
Welche snRNPs nehmen am U2-Spleißen teil?
U1,2,4,5,6
U1 Erkennt
U2 bindet an das Intron
U4 bringt U5 und U6.
U2, U5 und U6 schneiden die RNA.
Wie spleißt ein Intron selbst?
Durch die RNA-faltung -> Ribozym
Welchen Teil der prä-mRNA erkennt U1?
Das 5’ ss-Ende des Introns.
woraus bestehen snRNPs?
snRNA und 7 Sm Proteine
Welche Funktion hat das Exosom?
RNA Abbau. Es ist tonnenförmig.
In welche Richtung degradiert das Exosom RNA?
3’ -> 5’
Mit welchem Teil der RNA interagiert das Exosom?
nur das Rückgrad -> Unspezifischer Schredder.
Es gibt dabei Phosphorolytische und hydrolitische Exosomen, die unterschiedliche Reaktionsmechanismen benutzen. Das humane Exosom hat keine phosphorolytische Aktivität
Was ist das allgemeine Prinzip von Signaltransduktion?
Extrazelluläre Signale werden von Transmembranrezeptoren aufgenommen
Information wird ins Zellinnere übertrage
Signaltransduktion im Cytoplasma => zeulluläre Antwort
Wofür steht GPCR? Wie funktionieren sie allgemein?
G-Protein gekoppelte Rezeptoren.
N-Terminus ist extrazellulär. C-Terminus intrazellulär
Binden extrazelluläre Liganden aktivieren GPCRs. Das Signal wird auf ein G-Protein übertragen, die Effektoren aktivieren. Dieses hat GTPase-Aktivität und aktiviert Effektoren => Signaltransduktionskaskade
Nenne ein Beispiel für ein GPCR und seine Funktion.
Rhodopsin. In den Sehstäbchen. Besteht aus Opsin und dem Chromophor 11-cis-Retinal. Erkennt Licht.
Was ist 11-cis-Retinal?
Eine Schiffsche Base, die durch Lichtabsorption seine Konformation ändert und Opsin aktiviert. Dadurch löst es sich von Opsin.
Wie reagiert Opsin auf die Aktivierung durch Retinal?
Retinal löst sich. Opsin verändert seine Konformation und kann an seinen G-Proteinpartner(Transducin) binden.
Wie sehen heterotrimere G-Proteine aus?
⍺,β,ɣ-Untereinheiten.
⍺-UE ist die GTPase und gehört zur Ras-Familie.
An der Innenseite der Membran verankert.
Wie funktionieren heterotrimere G-Proteine?
Nicht aktiv: GDP-gebunden
G⍺ bindet an GPCR
GDP dissoziiert
GTP bindet
G⍺ dissoziiert von Gβɣ
Diese beiden Bestandteile sind aktiv und können Signale weiterleiten
GTP wird zu GDP + Pi hydrolysiert -> Dauer der Reaktion = Signaldauer
G⍺ reassoziiert mit Gβɣ, und dissasoziiert vom GPCR.
Woraus bestehen G-Proteine der Ras-Super-Familie?
P-Schleife kontaktiert βɣ-Phosphat
Schalter I und II ändern ihre Konformation um GTP und GDP zu unterscheiden.
Wie funktionieren Ras-Familie GTPasen?
langsame GTPasen
durch GTPase-aktivierende Proteine stimuliert
GDP/GTP-Austausch durch Guanin Austausch Faktoren (GEF)
stabilisieren den Übergangszustund der GTP->GDP-Reaktion
Was macht die Gβ-UE der heterotrimeren G-Proteine?
Gβ kontaktiert G⍺ und stabilisert GDP-konformation
Wofür steht GAP? Nenne ein Beispiel.
GTPase-aktivierendes Protein
RGS4 stimuliert die GTPase-Aktivität 2000-fach indem es die aktive Konformation induziert
Was sind häufige Effektoren vom aktiven G⍺?
cAMP
Phospholipase C -> IP3, DAG
Cyclic GMP Phosphodiesterase : cGMP ->GMP
Welche Motorproteine gibt es?
Dynein, Kinesin, Myosin
Welche Proteinfilamente gibt es?
Dynactin, Actin, Mikrotubuli
Was tun Motorproteine?
Mithilfe von ATP chemische Energie in mechanische umwandeln.
Woraus bestehen Muskelfasern?
Bündel vo Myofibrillen, die als Sarkomere angeordnet sind.
Woraus bestehen Sarkomere?
dicke (Myosin) und dünne (Actin, Tropomyosin, Troponinkomplex) Fibrillen
Welches Motorprotein ist für Muskelbewegungen zuständig?
Myosin II in den Myofibrillen.
Besteht aus Kopf- Hebelarm- Stieldomänen
Was passiert bei einer Muskelkontraktion?
dünne Filamente gleiten an den dicken Filamenten durch das Myosin an den dicken Filamenten entlang.
Wie lagern sich Myosinfilamente zusammen?
Bipolare Strukturen mit Myosinköpfen an den Enden.
Wie kommt es zur Kontraktion von Muskeln?
Nervenimpuls -> mehr Ca2+ -> erkannt von Troponinkomplex -> Tropomyosin wird deaktiviert -> Kraftschlag
Wie passiert Totenstarre?
ATP wird nicht mehr regeriert. Troponin wirkt nicht mehr, Myosinköpfe binden stabil an Aktin
Woraus besteht Aktin?
G-Aktin polymerisiert zu F-Aktin mit helixstruktur.
bindet ATP(->Polymerisation)/ADP(->Depolymerisation)
Was ist der Lymn-Taylor-Zyklus?
Rigorkomplex: ohne ATP bindet Myosin stabil an F-Aktin
ATP wird gebunden -> Dissoziation
ATP -> ADP + Pi => Konformationsänderung, ‘Recovery stroke’
Motor kann wider an Aktin binden -> Kraftschlag: ADP, Pi dissoziieren, Actin-Filament wird transloziert.
Wie schafft Myosin den Kraftschlag?
Struktur: P-Schleife (NTPase) und Schalter I und II.
Relayhelix kommuniziert mit Schalter I und II und reagiert auf den Nukleotid.
-> kann gestreckt oder geknickt sein.
-> Übertragung auf Konverterdomäne -> Übertragung auf Hebelarm
Welche Maschinen braucht man für Transportprozesse?
Maschinen, die die Vesikel formen
Maschinen, die Membranen abschnüren
Maschinen zur Membranfusion
Wie funktioniert Clathrin?
Fracht wird von Rezeptoren erkannt -> Adaptorprotein -> Hüllprotein (Clathrin)
Hüllprotein stülpt Membran und es ensteht eine Knospe.
Clathrin nimmt Material in die Zelle auf und assembliert einen Clathrinkäfig.
Es besteht aus drei schweren Ketten, die ein Triskelien bilden.
Warum braucht man zur Membranabschnürung GTP?
Ist kinetisch inhibiert, da aus einem Ding 2 werden.
Wie werden Membranen abgeschnürt?
Durch Dynamin (GTPase), die Membrankrümmung induzieren.
Modelle für Funktion:
Konstriktase (Verengung)
Poppase (Verlängerung)
Passives Modell (instabilisierte Membran)
Wie funktioniert Dynamin?
oligomerisiert am Vesikelhals und umspannt ihn. G-Domänen von zwei benachbarten Windungen stehen sich gegenüber -> stimuliert GTP-Bindung, Dimerisierung -> GTP-Hydrolyse -> Kraftschlag führt zur Verengung -> GDP dissoziiert, Dynaminhelix öffnet sich
-> sowohl Konstriktase als auch Poppasemodell
Wo ist Membranfusion besonders wichtig?
In Nervenzellen an der Synapse mit der Exocytose von Vesikeln gefüllt mit Neurotransmittern.
Welche Maschine wird bei der Membranfusion an Synapsen genutzt?
SNARE-Komplex
Wie operieren SNARE-Komplexe?
Donor und Zielmembran haben beide SNARES die ein paralleles 4-Helix-Bündel bilden
-> Reißverschlussmechanismus bring Membranen näher
Was disassembliert SNARE-Komplexe?
NSF, eine AAA+ ATPase
Was sind die wichtigsten Merkmale von Membranen?
fluide
elektrische Isolatoren
undurchlässig für Ionen
geringfügig durchlässig für Wasser und kleine ungeladene Moleküle
Kontrollierter Transport
Spezialisierte Membranproteine
Wie ist der Kalium Kanal aufgebaut?
4 Untereinheiten mit:
geneigte negative Porenhelix (Selektivitätsfilter)
innere Helix
äußere Helix
Wie funktioniert der Selektivitätsfilter von Ionenkanälen?
Ionen besitzen Hydrathüllen, die abgestreift werden müssen.
Dabei ersetzen Gruppen im Selektivitätsfilter polare Interaktionen.
Warum lässt ein Kaliumkanal kein Na+ durch den Kanal?
Na+ mit der Hydrathülle ist zu groß
Na+ ohne Hydrathülle ist zu klein um mit den Bindestellen an der Porenhelix zu koordinieren.
Wie reguliert ein Kaliumkanal allgemein seine Öffnung?
Die innere Transmembranhelix muss gekrümmt sein, damit der Kanal offen ist.
Wie stellt eine Zelle sicher, dass Kationen bei einer Depolarisierung nicht aus der Zelle fließen?
Die Pore wird von innen blockiert.
Allgemein ist die S4 Helix der Ladungsmesser eines voltage-gated Ionkanals.
Die Paddel verändert ihre Konformation und schließt den Kanal.
Nenne ein Beispiel eines ligandgesteuerten Ionenkanals. Wie sieht er aus?
Nikotinischer Acetylcholin Rezeptor (in neuronalen Zellen) lässt Kationen durch.
Acetylcholin bindet an den Rezeptor.
Innen sind hydrophobe gekrümmte Seitenketten, die durch Acetylcholin gerade gestellt werden
Wie lässt Aquaporin nur Wasser durch?
amphipathische Pore mit einer hydrophoben und eine hydrophilen Wand -> orientiert Wassermoleküle und durch die Abstoßung werden sie weitergeleitet.
-> Porengröße und Ladungsausgrenzung
Was ist der Hauptunterschied zwischen Kanälen und Transportern?
Kanäle lassen passiv Moleküle durch. Transporter verändern mithilfe von ATP ihre Konformation und können so aktiv Moleküle durch die Membran pumpen.
Was ist ein ABC Transporter?
ATP-binding-cassette Transporter.
Exporter (Importer nur in Prokaryonten)
ATP-Bindung und Hydrolyse -> Dimerisierung der cytoplasmischen Nukleotidbindenden Domäne -> Konformationsänderung der transmembranen Domäne -> gestattet Durchlass
Was ist eine P-Type Pump?
Wird Phosphoryliert zur Konformationsänderung.
Auf welche Arten kann man Gewebezellen erforschen?
Bulk -> Tissue average
Single cell —> variabilität im Gewebe
spatial -> organisiation des Gewebes
Was ist Systems Biology?
Zelluläre Systeme hochdimensional erforschen (‘omics)
durch high-throughput viele Daten
-> Interaktionen, dynamics
Wie kann man single cell ‘omics vergleichen?
Eine Feature (e.g. DNA) über verschiedene Zellen messen und vergleichen
In einer Zelle verschiedene features messen und vergleichen
Über verschiedene Zellen verschieden Features vergleichen (man geht davon aus, dass e.g. hohe Transkriptionsrate mit vielen Proteinen übereinstimmt)
Wie kann man hochdimensionale Daten visualisieren?
UMAP Reduziert dimensionen
Wie misst man Genome, Transkriptome, und Epigenome?
Immer durch konvertieren in DNA-lesbare Daten
Wie sieht das FASTQ-format aus?
Identifier
Sequence
+ Identifier
Quality score (ASCII-kodiert)
Was sind SAM und BAM?
Dateiformate für alignmentinformation. BAM ist die binäre Version von SAM.
Wie kommt man von Alignment zu Daten?
a) Wo sind Mutationen?
b) Wo ist coverage?
Wie findet single-cell transkriptomic statt?
Zellen werden 1:1 mit barcoded beads kombiniert, sodass alle zelluläre RNA an einen barcode ligiert wird.
Was sind Methoden zum rausfinden, wo in einer Zelle Gene exprimiert werden?
Codex für Proteine
MERFISH für RNA
Slide-Seq für Transkriptom (friere und schneide zelle in dünne scheibchen)
Was macht ein Phasenübergang in der Zelle?
Erstellt Tröpfchen mit unterschiedlicher Substratkonzentration
Wie beeinflussen Wechselwirkungen zwischen Molekülen Phasenübergänge?
Wenn die Wechselwirkung vorteilhaft ist, kommt es nicht zur Phasentrennung. Andersrum aber schon.
Mit welchen Proteinen passiert Phasentrennung vor allem?
Ungefalteten.
Warum ist Phasentrennung pathogen?
In den Tröpfchen können sich die Proteine strukturieren -> formen glassy sold oder sogar amyloid fibers, die pathologisch sind
Woran kann man erkennen, dass die Phasentrennungströpfchen flüssig sind?
Sie bewegen und fusionieren wie flüssigkeiten
Sie tauschen ihre Moleküle mit der Umgebung aus
Ist Phasentrennung von der Entropie her gut?
Nein!
Wie kann ein Osmosephänomen zur Phasentrennung führen?
Wie entstehen Phasen innerhalb von Phasen?
Durch unterschiedliche Oberflächenspannungen.
Was kann Phasentrennung beeinflussen?
Mischung verändern
Transportphänomene | Aufbau von Stoffgradienten, wenn nur an einem Ort kondensiert werden kann.
Wo wurden Phasen schon recht früh beschrieben?
RNA-Prozessierung (P-bodies)
Was sind Hauptfaktoren bei Phasentrennung?
Konzentration der einzelnen Konstituenten
Temperatur
zusätzliche Bindungspartner
Was sind Crowding Agents?
e.g. PEG: Induzieren Phasentrennung
Was bilden Histone + DNA (kleinste Untereinheit)
Nukleosomen
Was ist ein TAD?
‘domän’ aber in Chromosomen
Wie kann man TADs identifizieren?
DNA crosslinken, verdauen, wieder ligieren, und sequenzieren
Was ist Hi-C?
Ein Crosslink-Experiment zur identifizierung von DNA Strukturen
Was sind A/B compartments?
Compartments von DNA, die weniger/mehr als erwartet nebeneinander leibt
A-Compartment entspricht Euchromatin
B-Compartment entspricht Heterochromatin
Wie sind DNA-Compartments im Vergleich zu Tads organisiert?
Mehrere TADs (i.e. loops)= assoziieren zu Compartments
Was organisiert auf großen Skalen Chromatin?
Assoziierung von Heterochromatin mit Phasentrennung
in nuklei: Assoziierung mit Lamina
Was organisiert auf kleinen Skalen Chromatin?
-> TAD Ebene
SMC Komplexe (Cohesin!) und CTCF
Was ist CTCF?
CCCTC Binding Faktor
-> Zinkfinger Protein, bindet in spezifischer Orientierung
-> Transkriptionsregulator
-> Bildet Chromatinloops durch und verhindert Ausbreitung von Domänen
Durch die Orientierungsspezifität wird eine Schlaufe gebildet, bei der die DNA in die Richtung zurückgeht, aus der sie kam.
Nenne ein Beispiel eines SMC Komplexes. Womit interagiert her? Was ist seine Funktion.
Cohesin, interagiert mit CTCFs. Hält Schwesterchromatine bei der Mitose zusammen (trennung durch separase) -> homologe Rekombination u.a.
Verantwortlich für die Organisation auf TAD Ebene
Wofür kann man Cohesin nutzen?
Homologe Rekombination: Schwesterchromatide zusammenhalten
Wie sehen SMC-Komplex aus?
Dimer: Head (ATPase) und Hingedomäne (dort sind Dimere verbunden). Nicht alle sind Ringförmig.
An welche Sequenzen bindet Cohesin?
A/T Reiche Sequenzen
Warum sind Nukleosome positiv geladen?
-> Sättigt negativ geladene DNA
-> Kann abgepackt werden, sodass sie sich nicht abstoßt.
Wo binden Proteine an Histone?
Am Acidic patch (eine Argininbindestelle)
Was passiert, wenn mehrere Proteine an Histone binden?
Oftmals erkennen andere Proteine die stelle umso besser (kombinatorische Erkennung)
Abstände von Nukleosomen sind:
Regelmäßig! Das erkennt man durch Verdauung,. die zwischen Nukleosomen schneidet -> Die Stückchen sind alle gleichlang!
Wie verändern sich Nukleosomabstände entlang eines Gens?
Am Anfang ist immer ein +1 Nukleosom, entlang des Gens sind sehr regelmäßige Abstände, das nimmt aber entlang des Gens ab. Am Ende des Gens ist eine NDR: Nucleosome deprived region
Welche mechanismen benutzt nucleosome remodeling?
Sliding, Ejection, Dimer replacement
Wie beeinflusst remodeling Genpromotoren?
Wenn ein Nukleosom am Promotor ist, ist es repressiert (muss erst ejected werden)
Wie funktioniert der Swi2/Snf2 motor?
geht die DNA entlang, ohne sie zu entwinden, schaut sich jeweils die minor groove an. Zuständig für die Ejektion von Histonen -> kein Nukleosom mehr
Was macht INO80?
Chromatin remodeller: Positioniert Nukleosomen (e.g. für das +1 Nukleosom wichtig)
INO80 wird an das Nukleosom gebunden
Die DNA wird durch INO80-AAA-ATPase gepumpt.
INO80 kann das +1 Nukleosom an die richtige Position schieben, aber die Distanz zwischen Nukleosomen danahc nicht mehr wiederherstellen.
Aus welchen 2 Teilen besteht das menschliche Immunsystem??
Innate immunity (erkennung von allgemein Fremden)
adaptive immunity (Erkennung von schon bekanntem Fremden -> e.g. Impfung!)
Was sind PAMPS? Wovon werden sie erkannt?
Pathogegn associated molecular patterns
Erkannt von PRR (Pattern Recognition Receptors)
-> innate immunity
Was sind MAMPs? DAMPs?
Microbe associated molecular patterns
Danger associated molecular patterns
erkannt von PRRs -> Innate Immune Response
Auf welchem Level werden PRRs aktiv?
Single cell level (at least they can be studied there)
Was sind LPS? Was aktivieren sie?
Lipopolysaccharide: auf der Membran von Gramnegativen Bakterien. Aktivieren TLR4
Was sind TLRs?
Toll like Receptors
PRRs die fremdes erkennen, e.g. wie Flagellin, LPS.
Transmembranproteine
Was macht das Inflammosom?
Hat Caspase-1, das IL-1-cytokine produziert -> Entzündung
Caspase-1 spaltet GSDMD (eine Pore) -> Kann zu Pyropoptose führen
Was ist Pyropoptose?
Die Zelle löst sich in viele kleine Vesikel auf und stirbt.
Wie erkennt man neue Komponenten im Innate Immune System?
Knockouts durch InDel Mutationen mit designer Nukleasen
Wie kommt Cas9 mit der gRNA in die Zelle?
Direkt als Komplex (Teuer, nicht immer toleriert, aber schnell)
Per Plasmid (billig, weniger Effizienz)
genetische Information, die gRNA und Cas9 synthetisieren kann mit Lentiviren. (permanent, nicht sehr teuer) -> guideRNA kann als Barcode benutzt werden!
Was ist forward genetic screening?
Schaue bei einer Gruppe von verschiedenen Zellen nach:
Proliferation
Zelltod
FACS (wieviele von welchem Zelltyp?)
Wie entsteht Dysfunktion in Organellen?
Erbbare Krankheit
Krebs
Enzündung
Altern
Nenne einige Alterungsmechanismen
Telomerverkürzung
Epigentische Veränderungen
Stem Cell exhaustion
Mitochondrial dysfunction
Loss of proteostasis
Welchen Effekt haben MPTP und Rotenon? Warum?
Töten Nervenzellen.
MPTP wird zu MPP+ metabolisiert, welches die mitochondriale Atmungskette (Komplex I) inhibiert.
Auf welche 2 Arten kann man komplizierte Phäno und Genotypen erforschen?
Observational or Experimental
Was heißt Gain of Function? Was heißt Loss of Function
GOF: Molekül hat bessere oder andere Funktion
LOF: Ich mache das Molekül kaputt.
Warum ist LOF forward genetics in Säugetierzellen schwer? Welche workarounds gibt es?
Die meisten LOF Mutationen verändern den Phänotyp nicht. Homozygote Zellen sind in Säugetierzellen schwer herzustellen.
Workaround:
Blm-Defizienz -> 20fache LOH
Hochspezifische Bakterielle Nukleasen
RNAi
Wofür steht LOH?
Loss of heterozygosity
Was ist Bloom syndrom? Welcher Mechanismus wurde dadurch entdeckt?
Rezessive Erbkrankheit. Zellen sind Blm-deficient -> Mehr Loss of Heterozygosity
Mit Blm-defizienten Zellen kann man somit eingeführte Mutationen homozygot machen.
Was ist RNAi?
RNA Interferenz mit siRNA/shRNA -> Ausschalten von Transkripten mit RNA ohne mutagenese
Wo tritt Haploidität in Eukaryonten auf?
Unizelluläre Organismen
Inverteberates (e.g. Dronen)
Haploide vertebrate cells können durch Parthenogenesis erzeugt werden. Insbesondere Krebszellen sind haben oft Ploidy-variationen.
Was sind DPCs?
DNA protein crosslinks: Nukleotid bindet kovalent an ein Protein.
Wie entstehen enzymatische DPCs?
Enzym, das mit Nukleotid kurzzeitig kovalent interagiert, bleibt stecken
-> spantaneaous formation oder durch enzyme poisons
Wie entstehen nichtenzymatische DPCs?
Reactive agents bond to DNA without Specificity
endogenously produced reactive aldehydes like acetaldehyde, formaldehyde
Oder Exogenous agents: chemical crosslinkers, UV, oder Ionisierende Radiation
Wie werden DPCs repariert?
Replikationsgekoppelt: SPRTN(Mensch)/Wss1(Hefe) Proteasen degradieren DPCs
Was ist SPRTN Protease?
Kann DPCs reparieren. Essentiell für Viabilität und genomstabilität.
Kann die DPCs nur an einer ss/dsDNA-Kreuzung reparieren, deswegen Replikationsverbunden
Was ist Ruijs-Aalfssyndrom?
Wenn SPRTN Protease leicht kaputt ist (hypomorphic) -> Ruijs-Aalfs syndrom (hepatocellular = Leber -krebs; Premature ageing)
Wie sieht additive Geninteraktion aus?
Beim knockout von einem geht Funktion runter, beim knockout von beiden doppelt so stark
-> Independent Genes
Wie sehen ‘synthetic letal’-Geninteraktionen aus?
Nur ein Gen KO -> Kann kompensiert werden
Beide KO -> complete LOF
e.g. beide Genprodukte haben dieselbe Funktion
Wie sieht eine Suppressions’geninteraktion’ aus?
Wenn nur B und nicht A exprimiert, LOF. Wenn A exprimiert wird, ist alles gut.
e.g. Toxin/Antitoxin
Wie sieht eine Epistasis ’interaktion’ von 2 Genen aus?
Wenn nur ein oder das andere Gen KO: LOF
e.g. wenn in demselben Pathway
Wie wird Aggregation durch den hydrophoben Effekt in Proteinen vermieden?
Zur Aggregatsvermeidung werden Proteine in Interaktionspatches mit elektrostatischen Interaktionen kombiniert
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