RNA WELT

Cross-Linking and Immunoprecipitation —> Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen RNA-Molekülen und Proteinen

—> ermöglicht die Identifizierung von RNA-Sequenzen, die spezifisch an bestimmte Proteine binden

1. Cross-Linking (Vernetzung): lebende Zellenmit ultraviolettem (UV) Licht bestrahlt, um chemische Bindungen zwischen RNA-Molekülen und den Proteinen, mit denen sie interagieren, herzustellen

2. Zell-Fragmentierung: Zellen werden zerkleinert, um die RNA-Protein-Komplexe freizusetzen

3. Immunopräzipitation: freigesetzte RNA-Protein-Komplexe werden mit spezifischen Antikörpern immunopräzipitiert. Diese Antikörper sind gegen das Protein gerichtet, von dem vermutet wird, dass es an die RNA bindet. Die Immunopräzipitation erfolgt in der Regel unter Verwendung von speziellen Beads, die an die Antikörper gebunden sind.

4. RNA-Isolierung: RNA von den Protein-Komplexen getrennt und gereinigt

5. Sequenzierung: isolierte RNA wird sequenziert, um die Sequenzen zu identifizieren, die an das Protein gebunden sind —> Identifizierung von RNA-Molekülen

Varianten:

HITS-CLIP (High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking Immunoprecipitation)

PAR-CLIP (Photoactivatable Ribonucleoside-Enhanced Cross-Linking and Immunoprecipitation)

1. Zugabe von photoaktivierbaren Ribonukleosiden (RNAs) zur Zelle: Zellen mit Ribonukleosiden behandelt, die photoaktivierbare Gruppen enthalten. Diese RNAs werden in die neu synthetisierten RNA eingebaut.

2. Zellen mit UV-Licht bestrahlt, um die photoaktivierbaren Gruppen zu aktivieren -> aktivierte photoaktivierbare Gruppen reagieren mit den Aminosäuren der Proteine in unmittelbarer Nähe -> Bildung der chemischen Querverbindungen zw. RNA und benachbarten Proteinen

3. RNA-Isolierung: RNA-Protein-Komplexe isoliert

4. Immunopräzipitation: isolierte RNA-Protein-Komplexe werden mit Antikörpern behandelt, die spezifisch für das interessierende Protein sind Isolierung der RNA mit ihren gebundenen Proteinen

5. Sequenzierung isolierter RNA sequenziert, die mit den spezifischen Proteinen verbunden ist

= direkte Technik zur Bestimmung der genauen mRNA-Region, die vom Ribosom gelesen wird, und zur direkten Untersuchung der mit der Translationsmaschinerie verbundenen Transkripte —> liefert eine „Momentaufnahme“ aller Ribosomen = Translatom, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle aktiv translatieren —> damit weiß man welche Proteine in einer Zelle aktiv translatiert werden —> systematische Überwachung zellulärer Translationsprozesse

—> Untersuchen die Translationskontrolle und messen die Genexpression

—> Identifizieren die Startseiten für Translationen

—> Bestimmen die Geschwindigkeit der Proteinsynthese

—> Vorhersage der Proteinshäufigkeit

Die translatierte message kann genau erhalten werden, indem die geschützten 30 Nukleotide während der Übersetzung mithilfe eines Nukleaseverdaus ausgewertet werden, um Nuklease-resistente Ribosomen zu isolieren:

1. Isolieren die an Ribosomen gebundenen mRNA-Moleküle durch Lyse der Zellen oder des Gewebes

2. Machen Komplexe unbeweglich (meist mit Cycloheximid)

3. Verdauen die RNA, die nicht durch Ribosomen geschützt ist, mit Ribonukleasen

4. Verwenden Saccharose-Gradienten-Dichtezentrifugation oder spezielle Chromatographiesäulen, um die mRNA-Ribosomen-Komplexe zu isolieren

5. Reinigung der Mischung mit Phenol/Chloroform zur Eliminierung von Proteinen

6. Wählen die Größe für mRNA-Fragmente aus, die zuvor geschützt wurden

7. Ligieren den 3′-Fragmentadapter

8. Subtrahieren identifizierte rRNA-Kontaminanten (optional).

9. Reverse Transkription: RNA in cDNA

10. Amplifikation Strang für Strang

11. Liest aus einer Sequenz

12. Bestimmen das Translationsprofil und richten die Sequenzergebnisse an der Genomsequenz aus

-DNA-Template mit dem “Core-Promotor”

-Allgemeine Transkriptionsfaktoren (GTFs)

-Pol II-Enzym

—> Prä-Initiationskomplex (PIC) = der Multiprotein-Komplex aus GTFs und RNA-Polymerase am Promotor-DNA

1. Promotorerkennung: Erkennung und Bindung eines spezifischen DNA-Abschnitts (= Promotor) durch RNA-Polymerase. Promotor enthält bestimmte DNA-Sequenzen, die die Position und die Richtung der Transkription festlegen

2. Bildung des Transkriptionskomplexes: RNA-Polymerase bindet an den Promotor und bildet einen geschlossenen Transkriptionskomplex —> DNA-Doppelstrang in der Region noch geschlossen

3. Öffnung der DNA-Doppelhelix durch Promotor-Melting -> offener Promotor-Komplex -> ermöglicht den Zugang der RNA-Polymerase zum DNA-Strang = Matrize für RNA-Synthese

4. Initial-transkribierender Komplex: aktives Zentrum der RNA-Polymerase liegt in der günstigen Position zum DNA-Matrizenstrang -> Initiation der RNA-Synthese: kurze RNA-Moleküle werden synthetisiert.

Abortive Transkription = RNA-Polymerase stellt mehrfach kurze RNA-Fragmente her, Transkription wird nach wenigen Nukleotiden abgebrochen -> kurze RNAs werden entlassen

1. Basenpaarung komplementär zu Matrize

2. nukleophiler Angriff des 3´-OH-Sauerstoff-Atoms auf das a-Phosphoratom

3. Abspaltung von PPi —> weiter zu Phosphat abgebaut, dass es nicht wieder zurück zu ATP reagiert

—> Am 3´-OH-Ende wird das nächste Nukleotid des wachsenden RNA-Stranges angebaut —> Verknüpfung in eine Phosphodiesterbindung

Das aktive Zentrum besitzt zwei Mg2+-Ionen — Funktionen:

1. aktiviert die 3‘ OH-Gruppe der Ribose

2. stabilisiert die PPi-Abgangsgruppe

1. Prä-Initiation: Die Polymerase bindet DNA, erkennt Template-Strang und schmilzt Promotor

2. Initiation: Vorbereitung der Matrize für die Polymerisation: Öffnen des Promotors zurTranskriptionsblase, Absenken des Template-Strangs in die katalytische Furche

3. Initiale Transkription: Auffinden der Transkriptionsstartstelle

4. Elongation: Prozessive Synthese der RNA

5. Termination: Beendigung der Polymerasereaktion und Ablösen des RNA-Moleküls vom Template

Pol II:

-DNA -Aufwindung

-RNA-Polymerisation

-Korrekturlesen

GTFs: Promotorerkennung

- rekrutieren die RNA-Polymerase an den Promotor zu binden

- ermöglichen die Bildung des “Open Complex” (Trennung der DNA-Stränge) = “Promotor-Melting”

- helfen beim “Promotor Clearance” (Übergang in Elongationsphase)

Bindungsfolge: TFIIDABFEH, RNA-Pol II

TFIIA - Stabilisierung von TBP

TFIIB - Rekrutierung von Pol(II) / Festlegung des Transkriptionsstarts

TFIID - TBP-Promotererkennung —> besteht aus: TBP (bindet an TATA-Box) und TBP-assoziierten Faktoren (TAF‘s)

TFIIE - Rekrutierung von TFIIH

TFIIF - Stabilisierung des DNA-TBP-TFIIB Komplexes

TFIIH - Helikase- und Kinase-Aktivität —> Promoteröffnung (Promotor melting) und CTD-Phosphorylierung => Übergang zur Elongation

1. Bindung von TFIID an TATA-Box

- durch Erkennung der TATA-Box durch TBP (Untereinheit von TFIID) -> große Konformationsänderungen in der DNA am Promotor und zur Verfügung gestellte Interaktionsoberfläche erlauben Bindung anderer TFs -> TBP dient als Andockstelle

- Assoziation von weiteren Transkriptionsfaktoren: TFIIA, TFIIB, TFIIF, RNA-Pol II, TFIIE, TFIIH

-> basaler Transkriptionsapparat

-> während Komplexentstehung: CTD der RNA-Pol II nicht phosphoryliert

2. nach Zusammenbau -> Öffnen der DNA-Doppelhelix durch TFIIH (Helikaseaktivität)

3. Phosphorylierung der CTD durch die Proteinkinaseaktivität des TFIIH —> markiert den Übergang von PIC zur Initiation

-> Auslöser des Enzyms von GTFs (allgemeine TF) und/oder DNA des Promotors entkoppelt -> Initiation

Speziellen Transkriptionsfaktoren

• besitzt DNA-Bindedomäne und Aktivierungsdomäne

• Aktivierungsdomäne interagiert mit TBP-assoziierten Faktoren (TAFs) und stimuliert/stabilisiert Bildung des PIC am TATA-Box

• Ausbildung des Initiationskomplexes am Core-Promotor wird erleichtert/erschwert

• Übergang in die Elongation (“Promotor Clearance”) wird erleichtert/erschwert

• Prozessivität der Polymerase II wird reguliert

—> Die spezifischen TFs interagieren häufig nicht direkt mit PolII, sondern überallgemeine TFs und/oder Adaptoren

Mediator-Komplex

—> organisiert die Struktur des PIC: vermittelt die Wechselwirkung von Aktivatoren mit dem PIC, dadurch wird die Initiation effizienter

• vermittelt zwischen Pol II und allgemeinen TFs (v.a. TFIIH)

• interagiert mit Pol II über CTD (= C-terminale Domäne)

• Für den Übergang zur Elongationsphase ist ein Signal transaktivierender Elemente nötig, dieses wird vom Mediatorkomplex umgesetzt und auf den PIC übertragen

-> Pol II in PIC: CTD unphosphoryliert -> Mediator-Bindung -> zuständig für die Stabilisierung des PICs (kurz vor der Elongation)

• interagiert mit außerdem mit genspezifischen Repressoren und Koaktivatoren

CTD der Pol II: 52x Heptapeptidsequenz YS2PTS5PS

- Phosphorylierungsstatus der CTD --> De-/Phosphorylierung

+ Pol II bei Initiation - PIC: unposphoryliertes CTD kann die Transkriptioninitiieren (Promoter clearance) -> Mediator-Bindung

+ Promotor clearence (escape): phosphoryliert Serin 5 durch TFHII —> Übergang in die Elongation

+ Elongation: Serin5 phosphoryliert —> Capping-Enzym-Komplex an CTD rekrutiert —> Dephosphorylierung von S5 -> Ablösen des Capping-Enzyms => Cotranskriptional

+ Elongation: Serin2 phosphoryliert (Ctdk1), Serin 5 wird nach und nach dephosphoryliert —> Rekrutierung von Poly-Adenylierung-Faktoren (CPSF, CstF) an CTD —> Spleißen und Polyadenylierung => Cotranskriptional

-wichtig für Translationsinitiation (Erkennung durch den Initiationsfaktor eIF 4E) —> Bindestelle für Translationsfaktoren

-Verbessert die Effizienz des Spleißens (primär für das Spleißen des ersten Introns notwendig)

- Reguliert die Stabilität der mRNA (verhindert unkontrollierten Abbau der mRNA vom 5‘-Ende) —> Schutz des 5´-Endes

- Export ins Zytoplasma -> dient als Zeichen, dass die mRNA diese 5´-Enden hat und ins Zytoplasma exportiert werden kann

1. Größenordnung 105 bis 107

2. rRNA bildet Peptidyltransferasezentrum aus -> katalytische Bildung der Peptidbindung während der Proteinsynthese

-> Ribosomen besitzen enzymatische Aktivitäten, die von RNA abgeleitet sind. Ribozym = RNA-Molekül

3. —> die Peptidbindung bei der Proteinbiosynthese (Aminosäuren zu einem Polypeptid verknüpft) ist eine thermodynamisch ungünstige Reaktion —> Daher Aktivierung der AS durch Adenylierung (Säureanhydrid) -> Übertragung auf ein tRNA (aktivierter Ester von 2/3' OH)

—> Bildung eines Aminoacyl-Adenlyats —> Aminoacyl-tRNA

4. eEF2 hydrolysiert GTP und bewirkt damit die Translokation des Ribosoms.

5. rRNA bindet CCA-Arm der tRNAs

1. Global (alle mRNAs): Modifikation der Initiationsfaktoren

—> durch Dephosphorylierung von eIF4E. Wer phosphoryliert 4E? MNK über MAPK-Kaskade, p38…

-> Phosphorylierung von 4E-BP durch mTORC1 -> bindet 4E -> Cap abhängige Ribosomen-Assemblierung nicht möglich

2. Durch spezifische Proteine, die die 5`-UTR bzw. 3`-UTR von mRNAs binden (z.B. IRP/IRE in der Regulation von Transferrin und Ferritin)

1. eLF2 3-fach-Komplex, welche an GTP und fMet bindet

- eLF2-GTP-Hydrolyse zurück zu eLF2-GDP nach der Intiation-

- Um einen neuen Initiationskomplex zu bilden, muss dieses eLF2-GDP in eLF2-GTP umgewandelt werden —> reguliert durch eIF2B = Nukleotid-Umtauschfaktor von eIF2

- Wenn eIF2 phosphoryliert wird, hemmt es eIF2B -> kein Austasusch

=> Phorphorylierung durch 4 Kinasen: PKR, PERK, GCN2, HRI

2. 4E-BP hemmt die cap-abhängige Translation durch Bindung an den Translationsinitiationsfaktor eIF4E

- Rekrutierung des 43S-Komplexes zu mRNA fordert die Bindung des Intiationkomplexes eIF4F ans 5´-Ende der mRNA

- beginnt mit der Erkennung der Cap-Struktur am 5’-Ende der mRNA -> Erkennung durch den Protein-Komplex eIF4F (eIF4A, eIF4E, eIF4G) -> eIF4E bindet direkt an das Cap

=> diese Bindung kann inhibiert werden durch das 4E-BP im unphosphorylierten Zustand, das eLF4E bindet und absondert

—> 4E-BP im phosphorylierten Zustand -> Bindungsaffinität an eIF4E nimmt ab -> Initiation kann wie gewohnt erfolgen

=> Phorphorylierung durch mTOR-Kinase-Komlex

1. 5´TOP motif der TOP response in der 5’UTR

-> mTORC1 phosphoryliert nicht nur 4E-BP, auch LaRP1 —> fördert die TOP-mRNA-Translation

-> Aktivierung von mTORC1 durch Verfügbarkeit von Nährstoffen, Aminosäuren, Energie und Sauerstoff

-> mTORC1 nicht aktiviert -> LaRP1 im unphosphorylierten Zustand bindet an 5´TOP motif und blockiert die Bindung von eIF4E an Cap somit die Translationsinitiation

=> TOP Response = Ergebnis der Inhibition von mTORC1, bzw. der Unfähigkeit die TOP mRNAs zu translatieren -> herunterregulierten Translation von Proteinen

2. mRNA-Poly(A)-tails stimulieren die Translation

-> Poly(A)-Bindungsprotein (PABPC) vermittelt die Wirkung von Poly(A)-tails

-> eIF4F (aus E,G,A) erkennt und eIF4E bindet direkt an 5´-Cap

-> eIF4E interagiert mit eIF4G, der PABPC des Poly(A)-tails bindet -> diese Bidund stabilisiert die eIF4E-Cap-Interaktion

-> PABPC bindet und stimuliert auch eIF4A, indem es seine ATPase- und Helicase-Aktivität erhöht

=> stimuliert die Rekrutierung der 40S-ribosomalen UE

3. Iron response regulation - RNA-Komplex

-> IRP1 und IRP2 binden an IREs, die entweder in den 5‘-UTR oder 3‘-UTR von mRNAs vorhanden sind

● Fe-Spiegel in Zellen niedrig -> IPR1 und 2 sind aktiv

-> IRPs binden an IREs in der 3'-UTR -> stabilisiert die mRNAs

→ IRPs binden an IREs in der 5'-UTR -> Translation wird blockiert (blockiert den 43S-PIC vor Rekrutierung)

● Fe-Spiegel hoch -> IRP1 wechselt von seiner IRE-bindenden Form zu einem Fe-S-Cluster, der Aconitase enthält, IRP2 wird abgebaut -> Fehlen der IRP-Bindung an IREs

→ IRE in der 5'-UTR -> Translation aktiv

-> IREs in der 3'-UTR -> Abbau von mRNAs

4. RNA secondary structures

-> Cap-abhängig: RNA G-quadruplex, stem-loop-RBP-Komplex, stark strukturiertes 5´UTR —> ihibitorischer Effekt

-> Cap-unabhängig: Viral IRES, zelluläre IRES, eIF3-binding stem-loop —> Rekrutierung von internen Ribosomen (40S/43S)4. 5. upstream open reading frame

6. Kozak-Sequenz -> hilft dem Ribosom, die richtige AUG zu identifizieren, um mit der Translation zu beginnen

7. Regulierungselemente in der 3’UTR -> z.B. Bruno/Cup, Bcd/4E-HP -> blockiert die Translation