Untersuchungsmethoden

= Darstellungsmethode mit Sichtbarmachung der Anzahl oder Struktur der Chromosomen eines Individuums, dabei werden die Chromosomen isoliert und angefärbt; dann kann man das sog. Bandenmuster analysieren

Bandenmuster: Quer verlaufende Bänder unterschiedlicher Breite und Verteilung, die in Abhängigkeit von der Präparation und Färbetechnik induziert werden können

• Material

  • Für die zytogenetische Untersuchung werden meist Lymphozytenpräparate verwendet.

  • In der pränatalen Diagnostik verwendet man auch Amnionzellen.

• Präparation

  • Die zu untersuchenden Zellen werden in Kultur genommen und zur Teilung angeregt.

  • Um Metaphasenchromosomen zu erhalten, werden die Zellen dann mit dem Spindelgift Colchicin behandelt.

    • Dadurch werden die Schwesterchromatiden in der Anaphase der Mitose nicht voneinander getrennt.

• Bänderungstechniken

  • (Färbung mit Quinacrin (fluoreszierende Banden, heute allerdings nicht mehr diagnostisch eingesetzt))

  • Giemsa-Bänderung (Standardbänderungstechnik, erzeugt dunkle G-Banden mit transkriptionell inaktivem Chromatin und helle, transkriptionell aktive R-Banden)

• Analyse: Begutachtung von durchschnittlich 10 bis 15 Metaphasen-Chromosomensätzen bei 1250-facher Vergrößerung

• Ergebnis

  • Karyotyp: Auswertung des Karyogramms nach Anzahl und Struktur der Chromosomen

    • Zuerst wird die Gesamtanzahl der Chromosomen genannt, dann die Art der vorliegenden Gonosomen und zuletzt ggf. Anomalien.

      • Beispiele: (46, XX) für einen normalen, weiblichen Karyotyp, (47, XY+21) für einen Jungen mit Trisomie 21 (siehe auch: Humangenetik - Vorklinik)

Definition: Methode zur spezifischen Anfärbung von DNA-Sequenzen durch Fluoreszenz-markierte DNA-Sonden, z.B. zur Anfärbung von Chromosomen in Karyogrammen, zur Tumordiagnostik oder zur Kartierung von Genen auf Chromosomen in der Metaphase und Interphase möglich

wird genutzt, um die Bewertung eines Karyogramms zu erleichtern oder strukturelle Chromosomenaberrationen im Gewebe nachzuweisen.

1. Beispiele: Nachweis von Mikrodeletionen (2–3×106 Basenpaare) wie beim CATCH-22-Syndrom oder Nachweis der Philadelphia-Chromosomentranslokation t(9;22)

Prinzip

1. Denaturierung der DNA in den präparierten Chromosomen

2. Hybridisierung der DNA mit einzelsträngigen, Fluoreszenz-markierten DNA-Sonden, die komplementär zu DNA-Abschnitten verschiedener Chromosomen sind

3. Untersuchung des Chromosomensatzes im Fluoreszenzmikroskop

4. Wo die Sonde gebunden hat, ist ein farbliches Signal zu erkennen

   1. Fehlt das Signal, kann man davon ausgehen, dass der komplementäre Abschnitt der DNA fehlt.

1. Besonderheiten

   • Das spezifische Anfärben erhöht die Auflösung im Vergleich zu den klassischen Färbemethoden für Karyogramme

   • Dadurch können auch kleinere Veränderungen der Chromosomen, z.B. kleinere Deletionen, erkannt werden.

Zum Nachweis von Mikrodeletionen und -duplikationen durch Nachweis spezifischer Nukleotidsequenzen im Hochdurchsatzverfahren

Patienten- und Kontroll-DNA werden auf einen Trägerchip mit DNA-Sonden aufgebracht und dann mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt.

Etwa 10.000 verschiedene einzelsträngige DNA-Sonden sind auf einem Glas-Chip aufgebracht, ihre Sequenz und Position ist bekannt. Durch Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Proben kann genau detektiert werden, welche Polynukleotidsequenzen in der Probe vorhanden war. So lässt sich z.B. das Genexpressionsmuster von Tumorgewebe mit dem von gesundem Gewebe vergleichen. Außerdem kann das Genom eines Probanden auf Sequenzvarianten untersucht werden.

Bestimmung der genauen Abfolge von Basenpaaren auf einem Gen z.B. um eine unbekannte Mutation auf einem krankheitsverursachenden Gen nachzuweisen

Methode zur Amplifikation (Vervielfältigung) spezifischer DNA-Abschnitte aus sehr kleinen Mengen Ausgangs-DNA, z.B. zur nachfolgenden Sequenzierung oder zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks

1. Prinzip: Zyklische Vervielfältigung eines Abschnitts doppelsträngiger DNA zwischen zwei Oligonukleotid-Primern mit Hilfe einer thermostabilen Polymerase

2. Benötigte Materialien

   • Hitzestabile DNA-Polymerase (z.B. Taq oder Pfu)

   • Zwei sequenzspezifische Primer (einzelsträngige DNA, ca. 15-25 Desoxyribonukleotide lang, komplementär zu jeweils einem Ende des zu amplifizierenden DNA-Bereichs)DNA-Template

   • dNTPs (Desoxyribonukleotide, dATP, dGTP, dCTP und dTTP)

   • MgCl2

   • Pufferlösung

3. Amplifikationszyklen (ca. 20 bis 50 Wiederholungen)

   1. Denaturierung

      • Doppelsträngige DNA wird durch Erhöhung der Temperatur auf ca. 95°C in Einzelstränge getrennt.

   2. Annealing (Hybridisierung)

      • Primer binden an komplementäre DNA-Sequenz.

      • Temperatur ca. 50-60°C (Primer abhängig)

   3. Elongation (DNA-Synthese)

      • DNA-Polymerase (bakteriellen Ursprungs) verlängert die Primer an deren 3'OH-Ende, sodass wieder doppelsträngige DNA entsteht.

      • Temperatur ca. 70°C

Ergebnis: Vervielfältigung der DNA-Sequenz in Abhängigkeit von der Zahl der Amplifikationszyklen und der Effizienz der Reaktion ca. um den Faktor 10^6 bis 10^12

Analyse: Nachweis der amplifizierten DNA-Sequenz durch Gelelektrophorese

Nachweis von RNA (z.B. aus RNA-Viren) mittels reverser Transkriptase

• RNA wird in DNA umgeschrieben (sog. cDNA, von engl. complementary DNA = "komplementäre DNA") und dann mittels Standard-PCR amplifiziert