Chromatographie

• physikalisches Trennverfahren

• mobile und stationäre Phase, zwischen denen sich die zu trennende Substanz verteilt

• werden durch stationäre Phase s retardiert

• sind Teilchen in der mobilen Phase m, bewegen sie sich mit ihrer Geschwindigkeit mit

—> unterschiedliche Wechselwirkung: unterschiedliche mittlere Verweilzeit in stat Phas, unterschiedliche Netto-Migrationsgeschw

Probe wird am Ende der Säule (Säulenkopf) aufgebracht und die Komponenten mit der mobilen Phase als Zonen eluiert

Gemische einer Anzahl an Analyten (komponenten)

solll durch Chromatographie getrennt werden (chromatographiert)

Stahlrohr (LC) oder Fused-silica Kapillare (GC) in welcher sich die stationäre Phase befindet

Abschnitt im chromatographischen Bett, in dem sich eine/ mehrere Substanzen befinden

spezifische Kombination aus stationärer und mobiler Phase

• feste Phase (Adsorptionsmittel, Adsorbens)

• flüssige Phase (Trennflüssigkeit, in GC), auf Festkörper/ an Kapillarwand als Film aufgezogen/ chem gebunden

• andere Bezeichnungen: Packung der Säule, Sorbens, chromatographisches Bett

durchstörmt Bett der stat phase in eine definierte Richtung mit fließgeschw v

• LC: flüssig

• GC: gasförmig

• SFC: überkritisches Fluid

andere Bezeichnungen: Trägergas (GC), Eluent/ Elutionsmittel (LC)

• Analytisch: Informationsgewinn

• 
  

• Präparativ: Reinprodukt-Gewinnung

1. Zonenelutionschrom: stat Phase im GGW zur mobilen, diese strömt kontinuierlich durch Bett, Probe wird als definierte Zone am Säulenanfang ufgebracht und mit mob Phase eluiert, es entstehen Zonen reiner Phase

   —> Isokratisch: mob Phasenzusammensetzung konst

   —> Gradientenelution: mob Phasenzsms ändert sich mit der Zeit, Elutionskraft wird kontinuierl erhöht

2. Verdrängungschrom: mobiler Phase wird nach Probenauftragung kontinuierl eine Komponente zusgesetzt, die wesentlich stärker als alle adsorbiert wird, verdrängt analyten aus stat Phase, Komponenten folgen unmittelbar aufeinander

3. Frontanalyse: probe wird kontinuierl auf Bett aufgegeben, festgehaltnene Komponenten werden solange in stat Phase angereichert bis Kapazität nicht mehr ausreicht

• Adsorption: Anreicherung eines Stoffes an Oberfläche eines anderen Stoffes

• Ursache: nicht kovalente WW, polare Oberfläche (Sorbens) und polaren Gruppen des adsorbierdenden Stoffes (Adsorbat)

• Kapazität des Sorbens: menge an adsorbat die von 1 g Sorbens aufgenommen werden kann, abh von Oberfläche & Temperatur

• Trennung: widerholte Absortions- und Desorptionsvorgänge

• WW ionischer Analyte mit ionischen Gruppen, die auf stat Phase verankert sind

• Autrennung aufgrund us Ladung

• Elution: Veränderung durch Gegenionen/ ph-Änderung

• Kräfe: elektrostatische WW (stark)

tR

= Zeit von Probenaufgabe bis Peakmaximum

—> qualitative Aussage über Komponente, da charakteristisch unter konst Bedingungen, vgl mit Referenzen

t0

= Zeit die nichtretardierte Komponente von Probenaufgabe bis Detektor braucht

—> mindestaufenthaltszeit einer Komponente in chr Anlage, ohne WW

tR’

=Differenz Bruttoretentionszeit - Totzeit

—> Aufenthaltszeit der Komponente ausschließlich innerhalb stat Phase

• Verbreiterung der anfänglich injizierten Probezone bei Wanderung der Analyte

• injizierte Zone isz unendlich schmal

• Dispersion nimmt mit Migrationsdistanz zu

—> Beschreibung der Konzentrationsverteilung in chrom Zone (Peakform) durch Gaußfunkt

Plate model

—> Bodenhöhe = Quotient aus Längenvarianz des Peaks (Verbreiterung Substanzzone) und Länge der Trennsäule

—> Trennstufe/ theoretische Bodenhöhe = Strecke eines chrom Systems innerhalb derer sich das Gleichgewich einmal einstellt

Hdiff Längsdiffusion

Probenzone bildet einen Konzentrationsgradienten in z RIchtung

Ursache für Massentransport aufgrund von Diffusionsprozessen in longitudinale Richtung

1.Fick’sches Gesetz

HEddy / Streudiffusion

• unterschiedl Dimensionen und Richtungen der Flusskanäle zw den Partikeln in gepacktem Bett

• Strom der mobilen Phase wird an Partikeln gesplittet

• größe & Richtung der lokalen Flussvektoren ist inhomogen

—> unterschiedlicher Weg & Zeit der Moleküle bis Säulenende

abhängig von Partikeldurchmesser, Güte der Säulenpackung

Zeit für Stoffaustausch zwischen mobiler und stat Phase

alpha

RS (Resolution)

• SUbstanzen in gasförmigem Zustand mit Trägergas als mobile Phase

• flüssige oder feste stationäre Phase

• inert: keine Reaktivität ggü Analyt/ stat Phase

• hohe Reinheit: Wasser/ Sauerstoff/ Öle können stat Phase zerstören, REinigungsfilter

• effektive Detektion (Kompatibilität mit Detektor)

• nicht zu teuer (N2 am günstigsten)

• nicht giftig

Verwendet werden: H2, N2, He

aus gaszylinder/ gasgenerator

Häufigste:

• CH3: niedrigste Polarität, Trennung durch us. Dampfdrücke

• Phenylreste ändern Polarität: Trennung moderat polarer Analyte

• Cyanopropyl-Subst: hohe Polarität

• Polyethylenglycol: intermolekulare H-Brücken, Trennung von Verbindungen mit H-Donor Gruppen (Alkohole)

Problem: Abhängigkeit von tR vom experimentellen Aufbau

Lösung: Bezug auf Standardsubstanz: n-Alkane

—> Anzahl C-Atome linear zum log der Nettoretentionszeit und des Retentionsfaktors

—> Unabhängig von Fließgeschw, Phasenverhältnis, Säulenlänge

—> Anhängig von Art stat Phase

gut geeignet um Retentionsverhalten einer Verbindung auf einer bestimmten stat Phase zu charakterisieren

—> ermöglicht Rückschlüsse auf Polarität der Verbindung bei Vermessen auf unterschiedlichen stat Phasen

= Ausdruck der zwischenmolekularen Anziehungskräfte

abhänig von Struktur der stat Phase/ des Analyten

Dispersionskräfte: WW aufgrund fluktuierdender Dipole

Induktionsww: Induzieren eines Dipols durch permanenten Dipol der polarisierbares Molekül zu Ladungsasymmetrie bringt

H-Brücken: anhängig von Atomvolumen des H-Donors und EN des H-Akzeptors

1. Longitudinal-Diffusion Hdiff

2. konvektive Durchmischung Hconv

3. Beitrag der Massenaustausschverzögerung der mob Phase Hex,m

4. Beitrag der Massenaustausschverzögerung der stat Phase Hex,s

—> beschreibt theoretische Trennstufenhöhe H aus Summe der insividuellen Beiträge zur Prakverbreiterung in Abhängigkeit der Fleißgeschw der mob Phase

• Trennsäule: Typ stat Phase, Innendurchmesser, Filmdicke

• trägergas: Typ, Geschw

• Säulentemperatur: isokratisch, Gradientenelution

Temperaturerhöhung um 25°C reduziert die Retention um die Hälfte

—> Dampfdruck steigt mit Temperatur stark an

Verteilungskoeff ist Temperaturabhängig

• Anfangstemperatur: so dass flüchtigsten Verbindungen adäquat getrennt werden

• Endtemperatur: gute Trennung für die am höchsten siedenden Komponenten

• Heizrate: linear, multi-linear, konvex oder konkav

Schwierigkeiten:

• quantitative Dosierung

• Flüchtigkeit (diskriminierende Effekte)

• Reproduzierbarkeit

Versionen der Dosierung:

1. Verdampfungsinjektion (Injektion in geheiztes Verdampferrohr im Einspritzblock)

2. on-column Injektion (direkt in die Säule, bei gepackten)

GC

Flammenionisationsdetektor

—> Messung el. Ladungen (Leitfähigkeit), generiert durch Wasserstoffflamme

niedriger Hintergrundstrom, da ohne org Moleküle gerine Menge an Ionen vorhanden

daher gute Verstärkung möglich

Reaktionen:

• organische Moleküle bilden Radikale und angeregte O2 und OH Radikale

• Rekt der Radikale mit angeregten Mol. führt zur Bildung von pos Ionen und Elektronen

• pos Ionen erhöhen Strom, können detektiert werden —> el. Verstärkung

—> je mehr CH-Gruppenn desto stärker das Signal

—> Heteroatome reduzieren Signalsärke

Robust und slebstreinigend

Elektroneneinfangsetektor

• hoch spezifisch für Verbindungen mit Atomen hoher e-Affinität

• Halogene, O/N -haltige Verbindungen

Reaktionen:

Ionisierung Trägergas

—> Generierung Elektronen von radioakt Quelle (beta Strahler)

—> zu hohe Energie: reagieren erst mit Trägergas da im Überschuss vorhanden, sekundäre Elektronen entstehen

—> Elektronenstrom wird gemessen (Hintergrudstrom)

—> sind e-Affine Gruppen vorhanden wird dieser Hintergrundstrom verringert

Rekombination: negativ geladene Probenpartikel sind langsamer, erreichen Kollektorelektrode nicht, rekombinieren mit pos Teilchen zu neutralen Molekülen

Elektroneneinfang

!Ch Verbindungen werden nicht detektiert

Umwandlung der Analyte in chemische Derivate

• zu geringe Flüchtigkeit

• Zersetzung beim Verdampfen

• hohe Polarität

• Substanzverlust durch Adsorption an Oberflächen

• empfindlich/ spezifisch detektierbare Strukturelemente

• Umwandlung ENantiomere in Diastereomere, Trennung auf achiralen Phasen

Silylierung, Acylierung, Methylierung

Anwendungen:

• Reaktionsmonitoring org. synthese

• phytochemie: Trennung Pflanzenextrakte

• klinische Analytik

• Arzneimittelanalytik

VT:

• kostengünstig

• geringer apparativer Aufwand

• schnell

• parallele Bestimmungen

NT:

geringe Trennleistung (kleinere Bodenzahlen)

geringe Beladbarkeit

• aufsteigende (klassische)

• horizontale

• zwei-dimensionale

optisch/ visuell

• farbige Subsatnzen

• uv aktive: SUbstanzen löschen Fluoreszenz

• fluoreszierende Substanzen: Eigenfluoreszenz

Absorptionsmessung/ Fluoreszenz Messung

• Photometer sendet monochromatisches Licht auf DC Platte (bestimmmter Winkel)

• wird von Platte reflektiert und vom Empfänger gemessen

• Substanzen mit Chromophor absorbieren Licht

benötigt Kalibrierung zur quantitativen Auswertung

High-performance thin layer chromatography

—> kleine Partikel, hohe Trennleistung

—> horizontale Entwicklung

(Ultra)High-Performace Liquid Chromatography

• trennleistung stark abhängig von Partikelgrößenverteilung

• bessere Leistung durch kleine und gleichmäßog geformte Partikel

• hohe Packungsdichte

• hochdruckpumpen

• stahlsäule

• Mobile Phase Cm: Massentranfer zwischen mobiler und stagnierender mobiler Phase durch Diffusion

• Stationäre Phase Cs+CAds

  • Porendiffusion

  • Oberflächendiffusion: Migration adsorbierter Moleküle

  • Kinetik Adsorption-Desorption

• für Substasnzen die nicht für GC geeignet sind

• alle löslichen organischen und anorganischen Arzneistoffe (polar und apolar)

• Trennmechanismen:

  • Normalphasenchr

  • umkehrphasenchr

  • hydrophile interaktionschr

  • Ionenaustauschchr

  • Größenaustauschchr

• Pumpe mischt einzelne LMkomponenten

• Zusammensetzung vom Trennprinzip

• rein, partikelfrei

• entgasen

• uv-durchlässig

• LM der Probe soll geringere Elutionskraft haben als mob Phase (sonst: Verlust an trennleistung, Peakdeformation)

• druckstabiles Stahl/ Plastikrohr

• teuer, empfindlich

• Fritten am Säuleneingang um Partikel zurückzuhalten

• Glas, Stainless Steel

Anforderungen:

• Nachweisgrenze

• lin messbereich

• Kompatibilität mit mob Phase

• Selektivität

• Flexibilität, Robustheit, Preis

Arten:

• Brechungsindex

• Uv/Vis-Absorption-Detektor

• Lichtstreudetekor

• Fluoreszenzdetektor

• el. leitfaähigkeit

• MS

• IR, NMR

• am häufigsten

• selektiv (nur Verb mit Chromophoren Gruppen)

• gute empfindlichkeit

unselektiv, universell

unempfindlich

empfindlich ggü Temperaturschwankungen

keine gradientenelution

für hydrophile ionische Verbindungen, bei denen die Dissoziation aufgrund der Säure/ Basenstärke im pH-bereich 2-8 nicht unterdrückt werden kann

HILIC

• polare stat Phase

• apolarer eluent

• wasserschicht auf Oberfläche der stat Phase

• WW polare analyte mit stat Phase durch Verteilung in Wasserschicht/ Adsorption an polaren Gruppen

• Elution durch Erhöhung des wässrigen Anteils

—> Hydrophile Verb, Zucker

• hochmolekulare Analyte

• Trennung nach Größe

• Molekülgröße vs Porengröße

• keine Interaktion mit stat Phase

superkritisches Fluid als mobile Phase

• superkrit Fl sind geringer viskos, beschleungte Diffusion, verbesserter Massentransfer, schnell