BC 10. Genexpression

• Helix-turn-Helix Proteine: 2 alpha-Helices, C-terminale (Erkennungshelix) interagiert mit Strukturmotiven in großer Furche, Binden Zielsequenz als Dimer (Erkennung palindromischer Sequenzen)

• Homeodomain Proteine: stark konservierte Struktur, 3 Helices, Helices 2 & 3 bilden Helix-Turn-Helix Motiv aus

• Zink-Finger Proteine: Zink als strukturelles Element, Triplet spezifisch

• Leucin-Zipper proteine: 2 alpha Helices über direkte Interaktion (coiled-coil Domäne) zusammengehalten (Hydrophobe WW über Leucine), Erkennen palindromische & nicht palindromische Sequenzmotive

• Helix-Loop-Helix Proteine: kurze alpha-Helix über Loop mit längerer verbunden, bindet DNA & 2. Helix-Loop-Helix Protein (-> Homo- oder Heterodimere)

EMSA - Electromobility Shift Assay:

• Gelelektrophorese bekanntes DNA Fragment in Gegenwart von DNA Bindeprotein, Bindung Protein - DNA stärkere DNA Retention (Fluoreszenz, Radioaktiv Markierung), Bestimmung Bindekonstante

DNA Footprinting:

• Exakte Bestimmung Bindesequenz auf DNA, Vom Protein gebundene DNA vor Nuklease Verdau geschützt

DNA-Affinitätschromatographie:

• Aufreinigung DNA Probe -> Beladung von Affinitätsmatrix mit verschiedenen DNA Sequenzen-> Proteine binden spezifisch an DNA Sequences auf matrix, Ungebundene Proteine Abgewaschen -> Elution gebundener Proteine -> Säule mit spezif. Sequenz -> Abwaschen nicht spezif. proteine -> Aufreinigung Sequenzspezifischer Proteine

Repressorproteine:

• blockieren die Bindung der RNA Polymerase an den Promotor

• Bsp. Tryptophan-Operon: (+) Tryptophan -> Repressor TrpR bindet Operatorsequenz & inhibiert Tryptophan Transkription

• Lac Repressor LacI: LacI bindet als Tetramer an DNA & inhibiert Transkription durch DNA looping entfernt liegender Operatorsequenzen, Allolactose vorhanden -> Dissoziation LacI -> Transkription

Aktivatorproteine:

• erleichtern die Bindung der RNA Polymerase an den Promotor

• Bsp. Catabolite Activator Protein (CAP): Sinkende Glukose-Konzentrationen -> Erhöhte cAMP Konzentration -> cAMP induziert Bindung CAP an Zielsequenz & erleichtert Bindung RNA Polymerase -> Transkriptionsaktivierung

Promotor & DNA Sequenz an die regulatorische Proteine binden, Aktivatoren, Repressoren, Kontakt über Mediator Protein

• Aktivierung: Aktivatorproteine mit Aktivationsdomäne vermitteln Aktivierung von Zielpromotoren. Histonemodfikationen -> Transkriptionsaktivierung

• Repression: Repressorproteine unterdrücken die Expression über verschiedene Mechanismen Bsp. competitive DNA binding, masking activation surface, direct interaction with TF, Chromatin remodeling complex recruitment, recruitment histone deacetylases, recruitment histone methyltransferases

-> resultierende Aktivität des Promoters ergibt sich aus der Summe der auf ihn einwirkenden aktivierenden und reprimierenden Stimuli

Genetische Schalter: Kontrolle der Aktivität des Regulatorproteins über induzierbare Dimerisierung der DNA Bindedomäne mit Aktivationsdomäne

• Licht-induzierte Genexpression: Bsp: Licht induzierte Interaktion von Phytochrom B mit dem Phytochrom interagierenden Faktor PIF6,

• Rotlicht induzierte Neubildung von Blutgefäßen: Licht induzierte Expression des Vasculären Endothelialen Wachstumsfaktors VEGF in Hühnerembryos

• Große Furche exponiert sequenzspezifische Strukturen, DNA-Binde-Protein erkennt hochspezifisch Sequenzabfolgen (Bspw. palindromische Sequenzen, Triplet Erkennung usw.)

ChIP - Chromatin Immunopräzipitation:

• Cross-linking Proteine mit DNA -> Zellen Lysieren -> Fragementieren der DNA -> Präzipitation der DNA mit Antikörpern gegen bekanntes Protein -> Reverse Cross-Links -> Amplifikation DNA via PCR

Phylogenetic Footprinting:

• Alignment von Sequenzen aus unterschiedlichen Species -> Bindestellen für regulierende Proteine sind häufig konserviert

• Tryptophan-Operon: (+) Tryptophan -> Repressor TrpR bindet Operatorsequenz & inhibiert Tryptophan Transkription

• Lac Repressor LacI: LacI bindet als Tetramer an DNA & inhibiert Transkription durch DNA looping entfernt liegender Operatorsequenzen, Allolactose vorhanden -> Dissoziation LacI -> Transkription

• Acetylierung - an Lysin Resten (Neutralisierung Ladung) -> Lockert Chromatinstruktur -> Erleichtert zugang für TF & RNA Polymerase

• Phosphorylierung - Ser,Thr,Tyr-Reste -> Veränderung Chromatinstruktur & Rekrutierung anderer Genexpression regulierenden Proteine

• Methylierung - Lysin/ Arginin-Resten (-> + Ladung)

• Weitere: Ubiquitinierung, Sumoylierung an Lysin-Resten

• Competitive DNA Binding

• Maskierung Aktivierungsstelle

• Direkte Interaktion mit Transkriptionsfaktoren

• Rekrutierung Chromatin-Remodeling Complexes

• Repressor bindet Initiationskomplex

• Rekrutierung Histon Deacytelasen

• Rekrutierung histone methyltransferasen

• Protein Synthese

• Ligandbindung

• Covalente Modifikatonen

• Untereinheitbindung

• Unmasking

• Stimulation Nuclear entry

• Membran Release

Kontrolle der Aktivität des Regulatorproteins über induzierbare Dimerisierung der DNA Bindedomäne mit Aktivationsdomäne

• PhyB gekoppelt an VP16-Aktivierungsdomäne

• Licht induzierte Interaktion von Phytochrom B mit dem Phytochrom interagierenden Faktor PIF6

• Reaktion Lichtdosis abhängig