Pflanzenbiotechnologie (Decker)

• Makromoleküle für medizinische Zwecke wie Proteine oder RNA (z. B. Covid-Impfstoff)

• Produktion rekombinanter Proteine in lebenden Zellen oder Organismen im großen Maßstab, keine Beschränkung bei der Wahl des Organismus

• Traditionell: Isolierung von Geweben, Flüssigkeiten

• Heute: Produktion rekombinanter Proteine in gentechnisch veränderten Organismen (Impfstoffe, Antikörper (Fragments), Hormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine, Enzyme)

  • Natürlich: Gentechnik als Ersatz für die traditionelle Produktion, um ausreichende Mengen zu garantieren

  • Künstlich: Chimären, humanisierte Proteine

• Pflanzenbasierte Systeme als Alternative zu Säugerzelllinien

  • PTMs höherer Eukaryoten - Herausforderung: pflanzenspezifische Protein-Glykosylierung

  • Geringes Kontaminationsrisiko mit bakteriellen Toxinen, Viren

  • Niedrige Produktionskosten

• Produktion in geschlossenen Systemen: Sicherheitsgewächshäuser, In-vitro-Kultivierung, Bioreaktoren

Erstes: Elelyso (Glucocerebrosidae) - Karottenzellkultur heterotroph

Gegen Morbus Gaucher - autosomal-rezessive lysosomale Speicherkrankheit

• Gewebekultur anstelle von Zelllinien -> genetische Stabilität (keine somaklonale Variation)

• Transformation von haploidem Material -> genetische Modifikationen sofort wirksam und stabil vererbt

• Hohe Regenerationsfähigkeit, vegetative Vermehrung

• Keine Antibiotika, Fungizide notwendig, keine moospathogenen Viren bekannt

1. Kultivierungsbedingungen

2. Genexpression

3. Intrazellulärer Transport (Speicherung, Sekretion)

4. Posttranslationale Modifikationen (Glykosylierung)

5. Downstream-Verarbeitung (Hauptkosten)

• Standardisierte Bedingungen

• Flexible Bedingungen, individuell an das Zielprotein angepasst

• Aufskalierung des Anbaus auf Produktionsebene (Beutelsysteme, Bryotechnologie), Vorteil: Einwegsysteme, GMP-konform, skalierbar

• Angemessene Promotoren:

  • Genomsequenz & -annotation

  • Analyse von Promotoren (& Terminatoren) - Quantifizierung der Aktivität des Reportergens

• Promotoren mit unterschiedlicher Stärke und Induzierbarkeit als Werkzeugkasten für mehrere Transformationen

• Hoch effiziente Genomeditierung (gezieltes Knockout) über homologe Rekombination oder CRISPR/Cas9

• Kompartimentierung zur Stabilisierung rekombinanter Produkte

• Charakterisierung von Signalsequenzen für die Proteinspeicherung in verschiedenen Kompartimenten (GFP-Reporterfusionen)

• Schwerpunkt: Sekretorischer Weg -> Proteinsekretion ins Medium -> einfache Aufreinigung

• Wichtige posttranslationale Modifikationen (Glykosylierung) finden im ER und Golgi-Apparat

• Asparagin (N)-gebundene Glykosylierung -> Proteinfaltung, Löslichkeit, Stabilität, blood clearance, biologische Aktivität (Protein-Protein-Interaktionen, Zell-Zell-Adhäsion)

• Pflanzen produzieren homogene N-Glykosylierungsstrukturen

Complex-type glycans:

Immunogenität pflanzenspezifischer Zuckermolekülstrukturen - Strategien zur Vermeidung von Immunreaktionen:

ER retention (unreife Glykosylierung), orale Anwendung, Genom-Engineering

• Gezielte Genmanipulation pflanzentypischer Glykosyltransferasen (XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT)

• insertion von humanem ß1,4-GalT, Einführung des Sialylierungswegs zur Verlängerung der Halbwertszeit der Produkte

• Gezielte disruption der Gensequenz durch Einfügung von fremd-DNA(enthält Antibiotika Selektion/ alternative Expressionskonstrukte)

• Molekulare Charakterisierung von Knockout/-in-Pflanzen

• Analyse der Glykosylierung durch MS

• Targeting proximal N-glycan residues - deltaxylt/deltafuct

  -> Keine Beeinträchtigung von Entwicklung & Differenzierung, Proliferation, Produktivität, Sekretionskapazität

• Targeting distal N-glycan residues - (stark angereichert bei Darmkrebs), seltene Modifikation in Moos-Glykoproteinen

• Lewis A Bildung durch die Wirkung von

  ß1,3-Galactosyltransferase & α1,4-Fucosyltransferase

  -> Entfernung von Lewis-A durch ß1,3galt-KO

• Galaktosylierung und Sialylierung = Humanisierung von Proteinen

  Sialylierung in Pflanzen nicht vorhanden - Voraussetzung: human-typische Galaktosylierung (über hGalT4 oder ChimFT4), Sialylierung (hST6)

• CTS (zytosolischer-transmembran-Stamm)-Domäne entscheidet über die Lokalisierung innerhalb des Golgi-Apparats

• Idee von chimären Enzymen

• N-Acetylglucosaminyltransferase-Knockout

  -> Blockierung weiterer Glykosylierung im Golgi-Apparat

  -> N-Glykane mit terminalen Mannosen

• Ansammlung von oligomannosidischen N-Glykanen

• Hohe Homogenität der Pflanzenglykanmuster: Effiziente Aufnahme durch Zelloberflächenrezeptoren

• Monoklonale Antikörper (mAb) gegen Krebs und virale Infektionen (ZMapp, Ebola) (erhöhte Aktivität lytischer Effektorzellen (ADCC-antibody-dependent cellular cytotoxicity) aufgrund modifizierter Glykosylierung

• Asialo-Erythropoietin (EPO) weist spezif. Veränderung in Glykosylierung auf -> Veränderung führt zu neuroprotektiver Aktivität

ADCC- antibody-dependent cellular cytotoxicity

• Anti-Krebs AK binden Krebzellantigene

• Natürliche Killerzellen (NK) binden an Fc-Regionen von zelloberflächengebundenen Antikörpern

• Aktivierung des FcγIII-Rezeptors (CD16), Freisetzung toxischer Enzyme -> Lyse/Apoptose Zielzelle

• Effizienz ADCC abhängig von Glykosylierung von AK (Fc-Domäne der IgG), Fehlen von Core Fucosylation erhöht ADCC

• Glyco-engineered igG1 aus Moos -> verbesserte ADCC -> verstärkte Tumorzelllysis (keine Kernfucose -> Bessere Bindung & Aktivierung FcγIII-Rezeptors auf NK-Zellen

• Kombination 3 AK gegen versch. Virenepitope

• Bessere Behandlung im vergleich zu in Säugern produzierte AK

• Grund: Verbesserte ADCC

• Produktion via tumefaciens transfektion von Tabak pflanzen

• Erythropoietin (EPO) fördert die Reifung roter Blutkörperchen (Erythropoese)

• rekombinantes EPO als biopharmazeutika

• Asialo-EPO: keine erythropoetische Wirkung, antiapoptotisch, gewebeschützend

• Vascular Endothelial Growth Factor - Blutgefäßwachstumsfaktor -> Re-Vaskularisierung

• VEGF121 - rekombinant produziert in Moos, effiziente sekretion & Stimulation der Endothelzellproliferation