Genetics (Hess)

Mikroalgen sind mikroskopisch kleine einzellige Algen -> Quelle für Biokraftstoffe

• Cyanobacteria - einzige Prokaryoten gruppe

• Clamydomonas reinhardtii - einzellige Grünalge, produziert H2 gas

• Nannochloropsis sp. - eustigmatophyte alge, akkumuliert ungesättigte Fettsäuren

• Diatoms - Kieselalgen

• Photosynthetische Mikroorganismen nutzen Wasser, Sonnenlicht um CO2 in versch. Chemikalien umzuwandeln

• Produktion von Lebensmitteln, Pharmazeutika, Kosmetika, Kohlenwasserstoffe für Bioenergie

• Über Synthetische Biologie Austattung der Mikroalgen mit neuen biosynthetischen Wegen - photosynthetisches Wachstum, Speicherung der Biochemikalien usw.

• Reduktion Treibhausgase

• Natürliche spontane Transformation

• Elektroporation

• Konjugation

• Biolistische Transformation mit Partikelkanone

• Transformation mit Glasperlen

Homologe Rekombination (HR) - gezielte Insertion/Inaktivierung von DNA-Sequenzen im Genom

Induzierbare Promotoren - strenge Kontrolle der Produktionswege & regulatorischen Schaltkreise in gentechnisch veränderten Zellen

• Riboswitches - mRNA-Elemente binden kleine Moleküle zur Aktivierung/Deaktivierung der Expression von Proteinen Bsp: Off- RNA-Struktur schirmt RBS ab -> Ribosomenbindung & Translation eingeschränkt

• Bizestronische Design (BCD) - löst Probleme bei monozystronischer Translationsaktivierung

• CRISPR/Cas - präzises Genom-Engineering

• CRISPRi - dCas-Mutanten zur Genexpression-Modifizierung

"Advanced biofuels," auch als "3rd generation biofuels" bezeichnet, sind eine fortschrittlichere Generation von Biokraftstoffen, die aus einer breiteren Palette von Biomassequellen hergestellt werden können und dazu beitragen, die Nachhaltigkeit und Effizienz von Biokraftstoffen zu verbessern.

-> über Mikroalgen & Cyanobakterien produziert

Beispiele:

- Alkane (propan, butan)

- Alkene (ethylen)

- Alcohole (ethanol, propanol)

- Biodiesel

- Isobutanol

- Methan

- Wasserstoff

• Pyruvat Decarboxylase (PDC) & Alkoholdehydrogenase (ADH) hinzugefügt

• Pyruvat -> Acetaldehyd (über PDC) -> Ethanol (über ADH)

• Optimierung Kohlenstofffluss & Redoxkraft

Alternative Alkohole & Aldehyde: Isobutanol, Isobutaraldehyde

• Expression 4 gene AlsS (Bacilus subtilis), IlvC, IlvD (E.coli), Kdc - 2-Ketosäure-Decarboxylase ( Lactococcus lactis)

• Überexprimierung RubisCO -> Verstärkt primäre Kohlenstofffixierung durch photosynthetischen Calvin-Zyklus (2. Operon Kopie in Neutral site, Starker Terminator -> verdoppelte Expression)

• Einfachstes Alken (C2H4), Pflanzenhormon

• Über Methionine (aus Citrat-Zyklus), Enzyme: ACP (Aminocyclopropan-1-carboxysäure synthase) & EFE (Ethylene-forming enzyme)

• Nachteile: Weit vom Kernmetabolismus, Verlust C-Atom pro Ethylenmolekül, tox. Beiprodukt Blausäure

• Metabolische und regulatorische Modelle relevanter Organismen.

• Neue metabolische Funktionen von Genen im großen und größtenteils unerforschten bakteriellen Pangenom.

• Synthetische Biologie zur Generierung effizienter Produzentenstämme.

• Genetische Stabilität relevanter Stämme.

• Regulation eingeführter Wege und Expressionskassetten.

• Identifizierung geeigneter natürlicher Organismen mit hoher Stressresistenz: Salz-, Hitze-, UV- und Phagenresistenz, Stickstofffixierung.

• Verarbeitungstechnologien, Kosten im Allgemeinen

• Landnutzung

• Ethik

• Wer ist dort vorhanden?

• Wie viele gibt es davon?

• Was könnten sie möglicherweise tun, basierend auf genomischer Rekonstruktion?

• Was könnten die Konsequenzen für die jeweilige Umgebung sein

- Entdeckung Alkan Biosynthese in cyanobakterien

- Marine hydrocarbon Zyklus

• Das Kerngenom umfasst die essentiellen Gene einer Spezies

• Das Pangenom beinhaltet das Kerngenom und zusätzliche variable Gene innerhalb einer Artengruppe

• Das Metagenom beschreibt die Gesamtheit der Gene in einer bestimmten Umgebung, die aus einer Vielzahl von Mikroorganismen stammen.

• core-Genom einer Bakteriengruppe besteht aus überwiegend bekannten Genen, die für grundlegende zelluläre Funktionen essentiell sind, während das flexible Genom aus variableren Genen besteht, die für Anpassungen an spezifische Umweltbedingungen verantwortlich sind.

• Zelltyp in Cyanobakterien, spezilisiert auf N2-Fixierung

• Regelmäßiges Auftreten innerhalb eines Zellfilaments mit definierten Abstand voneinander

• evolutionär ältester spezialisierter Zelltyp

• sauerstoffempfindliche Nitrogenase (= räumliche Trennung von Photosynthese und N2-Fixierung)

Trennung von Photosynthese und N2-Fixierung

• räumliche Trennung (Heterozysten)

• Zeitliche Trennung (Tagsüber: Co2 speicherung in form von Glykogen, Nachts umwandlung über Nitrogenase -> Stickstoff und Wasserstoff)

FatB1 from Cinnamomum camphorum, FatB1 from Umbellularia californica, FatB2 from Cuphea hookeriana

TesA E. coli acyl acyl carrier protein

(ACP) thioesterase

• 2 Typen von NiFe-Hydrogenasen

• H2 kann als Nebenprodukt der N2-Fixierung oder durch die enzymatische Aktivität von Hydrogenasen hergestellt werden.

• Transkriptomik: Analyse aller RNA-Moleküle in einer Zelle, einem Gewebemuster oder einem Organismus

• RNA-Seq: Sequenzierungstechnik zur Analyse des Transkriptoms

• Metatranskriptomik: Analyse aller Transkripte einer gesamten mikrobiellen Population

• Transkriptom: Gesamtheit aller RNA-Moleküle in einer Zelle oder einem Organismus

• Unterschied zum Proteom: Viele RNA-Moleküle werden nicht in Proteine übersetzt; differentielle Regulation zwischen RNA- und Proteinebene

• Vergleich von Transkriptomen: bietet Informationen über aktive Gene in verschiedenen Wachstumsbedingungen oder Zelltypen

• Transkriptomik: Analyse aller RNA-Moleküle in einer Zelle, einem Gewebemuster oder einem Organismus

• Poly-A Schwanz wichtig zur Erkennung

• Problem: nicht alle Transkripte haben Poly-A-Schwanz (rRNAs, tRNA), 5’ -Cap - Korrekte Identifikation der RNA schwierig, verhindert Mapping primärer 5’ - Enden

  Lösung: - 1) Terminator Endonuclease baut mono-phosphorylierte RNA ab -> Primärtranskripte

• 2) + RNA 5’ Polyphosphatase oder Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP) spalten Phosphate ab

Lösung: Differential RNA-seq

1. Terminator Endonuclease baut mono-phosphorylierte RNA ab -> Primärtranskripte

2. RNA 5’ Polyphosphatase oder Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP) spalten Phosphate ab

3. Reverse Transkription (RNA -> cDNA 5’-Cap umgangen) -> Fragmentierung (erleichtert Sequenzierung) -> Größenfraktionierung (Sortieren nach Größe) -> Illumina-Adapter mit 4nt-Tags (für Sequenzierung kennzeichnen) -> Illumina sequencing

-> liefert spezifische Informationen über die differentielle Genexpression zwischen den untersuchten Proben. Es ermöglicht die Identifizierung von Genen, die in Reaktion auf bestimmte Behandlungen oder Bedingungen differentiell exprimiert werden

• Ja, wichtige Rolle in Anpassungen an Umwelteinflüsse, Stress response, Promotor / Regulation, Metabolit / Eisen Erkennung, genetische Variabilität, Defensive Mechanismen (e.g. CRISPR)

• IsaR1 and the response to iron starvation in photosynthetic cyanobacteria

• sRNA von S. aureus als Regulator aber auch als Human Pathogen

• sRNA wird wiederum reguliert durch ncRNA

• Wie findet man regulatorische RNA

  • Databases: Look in appropriate databases (RFAM http://rfam.xfam.org/ and mirbase http://www.mirbase.org/)

  • Experimental: Isolation and sequence analysis of all small RNAs („RNA-Seq“, Illumina, …) or Microarrays

• NCBI Blast —> Sequenz analysieren / vergleichen um Ähnlichkeiten zu finden zu bekannten

• Uniprot —> potentielle Funktion herausfinden, Aufbau und Evolution

• Pfam —> Proteinfamilie über konservierte Domänen finden

• viele weitere Tool für Interaktionsanalyse, Expressions Datenbank oder Phylogenetische Analyse (Stammbaum rekonstruieren)

• Cyanobakterien (Prochlorococcus)

• Acyl-ACP Reduktase & Aldehyd Decarbonylase

• Biodiesel: FatB1 from Cinnamomum camphorum, FatB1 from Umbellularia californica, FatB2 from Cuphea hookeriana

  TesA, E. coli acyl acyl carrier protein (ACP) thioesterase

• Wasserstoff: Hydrogenasen ?

• …??