Albers

1. Permeabilitätsbarriere - Verhindert leakage und fungiert als Tor für den Transport von Nährstoffen in und aus der Zelle.

2. Protein Anchor - Proteinanker - Ort vieler Proteine, die am Transport, an der Bioenergetik und der Chemotaxis beteiligt sind.

3. Energiekonservierung - Ort der Erzeugung und Nutzung der Protonenmotorischen-kraft

- Kein Peptidoglycan aber meistens S-layer (Proteinschicht)

- Kein Murein, manchmal Pseudomurein (modifiziertes Peptidoglycan) NAT statt NAM

NAG -> N-Acetylglucosamin

NAT -> N-Acetyltalosaminuronsäure

NAM -> N-Acetylmuraminsäure

• Monotopische Proteine durchqueren die Zellmembran nur einmal.

• Polytopische Proteine durchqueren die Membran mehrmals

Äußere Membran - Hydrophob -> ß-Faltblatt Bsp: Porine

Innere Membran - a-Helix Bsp: LacY (2nd Transporter 12 TM-Domänen)

Methode zur Untersuchung der hydrophoben und hydrophilen Regionen eines Proteinsequenzabschnitts.

-> Vorhersage der sekundären Struktur eines Proteins basiert auf der Periodizität von hydrophoben und hydrophilen Aminosäureseitenketten in der Proteinsequenz.

- Hydrophile Schleifen weisen ähnliche AS-zusammensetzung auf wie zytoplasmatische, wasserlösliche Proteine.

- Intrazelluläre (zytoplasmatische) Schleifen sind angereichert mit positiv geladenen Aminosäuren ("positive-inside" Regel von van Heijne).

- Transmembran-Segmente (TMS) enthalten hauptsächlich hydrophobe Aminosäuren.

- Tyrosin und Tryptophan werden häufig an der hydrophoben/hydrophilen Grenzfläche der Membran gefunden.

Proteine in äußerer Membran:

Periodizität der hydrophoben und hydrophilen Seitenketten der Aminosäuren

Proteine, die ausgeschieden werden müssen, werden als Preprotein produziert:

- n-Region: N-terminale Region: positiv geladen

- h-Region: hydrophobe Region zur Einbettung in die Membran

- c-region: C-terminale Region: enthält spezifische Spaltsequenz; für bakterielle Sekretionsproteine ist die Konsenssequenz AXA

AXA-Motiv konserviert in Archaeen ähnlich wie bei Gram-positiven Bakterien (nur hydrophober)

Signalsequenz signalisiert dem Ausscheidungssystem der Zelle, dass ein bestimmtes Protein hinaustransportiert werden soll, und trägt dazu bei, dass sich das Protei nicht vollständig faltet.

• Insertion in die Membran

• Unlooping

• Spaltung durch Signal/Leader Peptidase in der Membran verankert

• Faltung

• Serine protease

  -> verwendet Serin-Lysin-Dyad-Mechanismus

• während Spaltung taucht aktive Stelle (vom Enzym?) in die Membran ein

• Spaltung an der extrazellulären Seite der cytoplasmatischen Membran

• Bsp: LepB

• Lipoprotein signal peptid

• Proteine mit Lipobox werden durch Diacylglyceryltransferase Lgt lipidmodifiziert, bevor die SPII das Signalpeptid spaltet

• SPII = Asparaginsäure-Protease mit 2 katalytischen Asp, die sich innerhalb der Grenze der Membran befinden.

• Spaltung erfolgt an der extrazellulären Seite der cytoplasmatischen Membran.

• Asparaginsäure Peptidase

• Spaltung auf zytoplasmatischen Seite

• PilD - Bakterien

• Archaeen: FlaK spezifisch für Archaellin-Untereinheiten

  PibD mit breiter Substratspezifität

-> Prepilin Signal peptid: zwischem G & F

Phenylalanin konserviert +1 -> Methyliert bei Spaltung

Sec pathway -> Translokation von ungefalteten Proteinen

Tat pathway -> Translokation von gefalteten Proteinen

• Route des Preproteins je nach Hydrophobizität der Signalsequenz

• SRP pathway -> hydrophob - Co-translational, Membranproteine

• SecB pathway -> weniger hydrophobe Signalsequenz, Post-translational, Sekretierte Proteine

Die Signalaequenz wird entweder von SecA oder von den Signalerkennungspartikeln erkannt, die das Protein zum Membranausscheidungssystem transportieren. Der Signalerkennungspartikel bindet Proteine, die in die Membran eingefügt werden. SecA bindet Proteine, die durch die Cytoplasmamembran ausgeschieden werden.

SecB - Chaperone, gram negative Bakterien, Dimere von Dimeren

SecA- ATPase, in allen Bakterien, Aktiv: Monomer

SecYEG- bestehend aus SecE, SecY & SecG

SRP- Ribonucleoprotein bindet Signalpeptid, RNA interagiert mit SRP54

• doughnutförmige Pore durch Membran, Heterotrimer: C-, N-terminale Hälfte & Plug

• Plug verhindert Transport - entstehende Polypeptid chain (mit hydrophober Signalsequenz) an TMS2/7 ->Plug verschiebt sich & Hinge region öffnet eingang für Peptid

  = Putative exit pathway

• SRP & Sec61p binden Ribosom am Protein exit Tunnel

Post-translationaler Transportweg

• Proteine im gefaltetem Zustand transportiert, Substrate oft Proteine mit Cofaktoren

• zu exportierende Proteine besitzen Tat-Signalpeptid mit Doppelarginin-Sequenzmotiv („twin arginine translocation“)

• Translokation über Protonenmotive Kraftwerk (pmf) angetrieben

Bestandteile:

TatA,TatB ,TatC membrangebunden

1) Erkennung Substrat mit Tat-Signalpeptid durch TatB & C

2) Komplex lagert sich erst nach Erkennung Signalsequenz über pmf zu Pore zusammen

3 ) Transport Substrat durch TatA Pore

4) Signalpeptid durch Signalpeptidase abgespalten

-> Tat = Twin arginine translocation

Tat sekretierte Proteine in:

- E.coli

- Streptomyces coelicolor

- Lactococcus lactis

- Halobacterium salinarum

- Sulfolobus solfataricus

• Braun’s Lipoproteine (E.coli): häufigstes E.coli Protein, Stabilisiert Zellmembranen, Mutanten hypersensibel gegenüber Toxinen, bilden Bläschen und setzen periplasmatische Proteine ins Medium frei.

  • N-Terminus mit Fettsäure und Diacylglycerol verbunden

  • C-Terminus mit DAP des Peptidoglykans verbunden

Lol = Localization of Lipoproteins

-> Sortierung Lipoproteine von innerer zur äußeren Membran.

-> LolC, LolD & LolE = ABC-Transporter

-> Lipoproteine, die für die äußere Membran bestimmt sind, werden ATP-unabhängig von LolCDE gebunden

-> ATP-Hydrolyse durch LolD wird Lipoprotein an periplasmatisches Chaperon LolA übertragen

-> LolA-Lipoprotein-Komplex überquert Periplasma & interagiert mit OM-Rezeptor LolB -> Lipoprotein an LolB übertragen & in äußere Membran eingefügt.

-> Asp an +2 Position verhindert Lol Transport = Lol avoidance

Bam = barrel assembly machine

-> Insertion von ß-Faltblättern in die äußere membran

-> BAM bis zu 5 polypeptide transport-associated (POTRA) Domänen die OMPs binden -> Insertion via BamB

-> Substrate im Cytoplasma synthetisiert & über Sec-Translokon ins Periplasma transportiert

-> Protein über SurA Chaperone im ungefalteten Zustand gehalten

-> DegP = Protease für misgefaltete OMPs (outer membrane proteins)

Aufgrund ihrer Hydrophobizität -> kommen nicht aus der inneren membran

Porine: in OM (outer membrane) von gram- negativen Bakterien, anti-parallele ß-Faltblätter -> formen beta barrel Fass Struktur, Unselektive & Selektive Kanäle, Bilden Trimere

• ß-Signal: hoch konserviertes C-terminales motiv beinhaltet Essentiellen terminalen aromatischen Rest (oft Phenylalanin)

• BamA kann sich seitlich öffnen (Zipper-like) & neue ß-Stränge einfügen

• Entstehendes Substrat-OMP wird durch BamA Barrel vom C-Terminus eingefügt

assymmetrische äußere Membran

-> Die Sequenz der großen Komponenten ist uniform (lipid A-KDO-core-O specific)

-> O-spezifisches repetitives Polysaccharid varriiert je nach Spezies

-> Core polysaccharid konserviert

-> Lipid A verantwortlich für Immunreaktion - Endotoxin

1. Lipid A Biosynthese (Lpx proteine)

2. Core OS hinzugefügt (Waa Proteine)

3. Flip an die inner Membran

4. O-PS Biosynthese & Ligation ans Lipid A

5. LPS Export (Lpt Proteine: LptBFGC complex -> LptA -> LptDE complex, Kanal Bildung)

6. Lipid A Modifikation

7. Transport an äußere membran

• Proteine falten sich im Periplasma

• Disulfidbrücken werden im Periplasma gebildet

• keine Energiequellen (ATP, Protonenmotive Kraft) an äußerer Membran

• Peptidoglykanschicht bildet Netz mit Poren -> Durchgang Proteine ca. 50-100 kDa

Problem: Organelle an Zelloberfläche aus sich wiederholenden Untereinheiten, die (1) selbstständig an der Zelloberfläche zusammengebaut werden müssen und (2) sich nicht vorzeitig zusammensetzen dürfen.

Lösungen:

1. Untereinheiten intrinsische Fähigkeit zur Selbstmontage, periplasmischer Chaperon verhindert, zusammensetzen im Periplasma (Typ I Pili)

2. Zusammenbau von Pili beginnt an der äußeren Seite der inneren Membran und erstreckt sich durch eine Pore in der äußeren Membran (Typ 4 Pili) und umfasst Proteine, die Peptidoglykan abbauen.

-> Typ I - VI Sekretion

• zwei unterschiedliche Pili Strukturen

• Zusammenbau der Pili

  • Typ I Pili (chaperone-usher pathway)

  • Typ IV Pili (ähnelt der Typ II Sekretion)

• Uropathogenic E.coli

• Triggert Signalwege der Wirtszelle, die zur Internalisierung von Bakterien führen

• adhesive Oberflächenorganellen mit proteobakteriellen Pathogen (E-coli, Salmonella, Pseudomonas usw.) Virulenzfaktoren

• Fibrillae-poly-adhäsiv

• Fimbriae-mono-adhäsiv

• Usher: Große Pore, durch die die Fimbrie aufgebaut & ausgeschleust wird

• Fimbriae

• UE transportiert via Sec Pathway - über FimC Chaperone im ungefalteten Zustand gehalten -> Kein assembly im Periplasma

• Donor Strand Exchange am FimD (Usher) ß-Fass, FimC mit Tail lagert sich an -> Übertragung Donorstrang auf enstehenden Pilus -> Verlängerung & Chaperon dissoziiert

• Keine Energie benötigt, Faltenergie ausreichend

Donor Strand exchange:

• HlyB: ABC Transporter gelangt in Kontakt mit TolC: Kanal an OM (ß-Barrel OM & a-Helices Periplasma -hydrophil)

• ATP Hydrolyse an IM -> Sekretion durch OM Kanal

• OM Kanal kann mit anderen ABC-Transportern geteilt werden

2-Schritte Translokation:

1. Sec-vermittelte translokation (über Sec-Peptide) über IM ins Periplasma

2. Faltung im Periplasma über Chaperone

3. Translokation über OM via Pseudopilus & Secretin - angetrieben über ATP Hydrolyse im Cytoplasma

Komponenten: IM Plattform - angetrieben über ATPase

Pseudopilus - mit OM Gate (Sekretin, großer Gated Kanal, auch in Type III secretion)

-> Bsp: Pseudomonas aeruginosa (Lipasen, Proteasen)

-> Vibrio Cholera (Cholera Toxin)

-> E.coli (Chitinase)

• outer membrane pore = Sekretin

• gesteuerter Kanal

• gefaltete Proteine und Multiprotein-Komplexe werden transportiert

• Secretin sekretiert via Sec-System - im Periplasma gefaltet & in OM über Lol pathway

• IM Proteine via Sec apparatoren in innere Membran sekretiert -> Interaktion mit cytoplasmatischer ATPase

• Pseudopilins mit positiv geladenem N-Terminus assembliert -> drückt Substrat richtung OM & durch das Sekretin

• Sekretion Effektor Proteine (kein spezif. Signalpeptid, Erkennung via Aminogruppen) aus bakteriellem Cytoplasma direkt über IM & OM, Via Needle Komplex durch Translokon (Sekretion durch das Typ III System) in Eukaryotische Wirtszelle

  -> Transport Über 3 Membranen

• Nur in gramnegativen Bakterien , Kodiert auf Pathogenitätsinseln (PAIs) im Chromosom oder Virulenzplasmiden

• Komplexe Zeitliche & Räumliche Sekretion

• Needle Komplexe ähneln bakteriellen Flagellelen- evolutionäre Homologien

• nur in gramnegativen Bakterien zu finden

• Sehr ähnliche Typ-III-Sekretionssysteme, die in einer Vielzahl von einer Vielzahl von gram-negativen Bakterien

• Kodiert auf Pathogenitätsinseln (PAIs)

• Die Pathogenitätsinseln des Typ-III-Sekretionssystems sind kodiert auf dem Chromosom oder auf großen Virulenzplasmide

- Schrittweiser Aufbau

- Nadel ist hohl

- nur das Nadel-Protein wird sekretiert

- angetrieben über cytosolische ATPase

- Länge Nadel reguliert über Hilfsprotein (YscP - bindet & verlängert sich & streched somit die Nadel -> Fertige Nadel, Protein geht an -> Erst dann gelangen Effektrorproteine durch)

- Tip Komplex der Nadel enthält LcrV - bildet Translocation Pore, Immunreaktionen gegen Tip Proteine

• Proteine, die durch TTSS (Type Three secretion system) sekretiert werden, formen eine Pore in der Wirtszellmembran, durch die die Effektorproteine in das Cytoplasma der Wirtszelle passieren

• die Spitze der Nadel beinhaltet eins (LcrV) von drei spezifischen Proteinen, die involviert sind eine Pore zu formen

• Vollständige Aktivierung erfordert Kontakt mit Wirtszelle

• Bei Kontakt -> innerhalb Sekunden Translokatoren & Effektoren ausgeschieden - vorab synthetisiert & in sekretionsfähigem Zustand gespeichert

• Chaperone halten Effektoren in teilweise entfaltetem Zustand

TTSS (type 3 secretion system) verwendet für:

• Induktion macropinocytotische Aufnahme (Salmonella & Shigella - fakultativ intrazelluläre pathogene)

• intravakuoläre Modifizierung der Umgebung (Salmonella & Chlamydia - intrazelluläre pathogene)

• Hemmung der eigenen Phagozytose (Yersinia -extrazelluläres Pathogen)

• Induktion zellulärer ‘pedestals’ (EPEC, EHEC - extrazelluläre Pathogene)

• Einführung Zytokine (Pseudomonas - extrazelluläres Pathogen)

• Einführung Virulenzproteine in Pflanzenzellen (Pseudomonas syringae extrazelluläre Pflanzenpathogene)

-> Verwendet für Konjugation, Effektor Translokation & DNA Uptake/Release

• Legionella pneumophila Dot-System: direkte Abgabe von Proteinen an das Zytoplasma von Makrophagen; diese Proteine modulieren den Transport des Bakteriums über den endosomalen Weg

• Helicobacter pylori CagA: direkte Freisetzung von CagA in das Zytoplasma von Magenepithelzellen; löst eine Entzündungsreaktion aus

• Bordetella pertussis Pertussis-Toxin: wird wahrscheinlich im Periplasma gebildet; wird wahrscheinlich in den extrazellulären Raum exportiert, von wo aus es an eukaryotische Zelloberflächenrezeptoren bindet und internalisiert wird

• das sekretierte Substrat ist immer ein Protein

• im Fall von DNA Transport, bindet erst ein Protein (Relaxase) kovalent an die DNA

• das Protein wird sekrtiert und die gebundene DNA folgt

• das Agrobacterium tumefaciens System transportiert Protein gebundene DNA und Effectormoleküle

• Autotransporter Proteine - Sekretionssystem in eigener Sequenz

• in gram negativen Bakterien

• große Proteine (90-200 kD)

• Meist involviert in Pathogenese: Proteasen, Toxine, Adhäsine, Invasine (z.B. Neisseria IgA Protease)

• In outer membrane lokalisiert, N-terminus (Signalpeptid) muss abgeschnitten werden

• 2-Step Translokation: Transport durch innere membran -> periplasmatisches intermediat -> Transport durch äußere Membran

• Virulenz (Proinflammatorische antiphagocytische Aktivität), Antivirulenz (anti-inflammatorische Aktivität), Kompetition (antibakterielle Aktivität)

• Aufbau: Extended state, Kontraktion ‘firing’, Disassemblierung

• Struktur homolog zu Phagen die DNA injezieren

• Twitching Motilität

• DNA-Transformation

• Anhaftung an das Wirtsepithel

• Bildung von Biofilmen

• Essentiell für die Pathogenität

Pilus Bewegung: Pilus UE an Tip -> Oberflächenhaftung wird erkannt -> Retraktion -> Erneute Pili-Assemblierung

- Messung Dynamiken: Beads an Pilus koppeln - Retraktionskraft gemessen

• Membranplattform mit Hilfsproteinen (Verankerung), Assembly & Deassambly ATPase, Secretin, Peptidase

• Pilus Struktur: Signalpeptid mit + N-terminus, H-Region (Hydrophobes Alpha-Helix-Segment -> bilden innere Struktur), C-terminus, nur positiv geladener N-terminus abgeschnitten

  -> Lollipop Struktur

-> Homolog

- Membranplattform mit Hilfsproteinen

- ATPase(n)

- Sekretin/Pore

Typ II Pseudopilus, Typ IV Pilus

Unterschiede:

Pseudopilus reassembliert ? Typ IV - Deassembly ATPase

-> T2SS hat sich aus einer alten T4P-Maschine entwickelt (evolutionär verwandt)

- nicht homolog (Typ IV Pili ist nicht gleich Typ IV Sekretion)

- Typ IV prepilin Signal peptide - Typ IV Sekretion - kein Signalpeptid

- Gram (+) keine äußere Membran

- ähnlicher Aufbau aber kein Sekretin benötigt -> guidance struktur

Archaea:

- Kein Retraktionsmechanismus gefunden

-> Schrittweiser Aufbau zeitlich und räumlich reguliert (TFs), ähnelt Typ III Sekretion

Filament: besteht aus Untereinheiten des Flagellin-Proteins

Haken: breiterer Bereich an der Basis der Geißel. Verbindet das Filament mit dem Motor.

Basalkörper (C-,MS-,P-,L-Ring): Stab und eine Reihe von Ringen, die die Geißel an der Zellwand und der Zytoplasmamembran verankern. Molekularer Motor, der es dem Flagellum ermöglicht, sich zu drehen und das Bakterium durch die umgebende Flüssigkeit voranzutreiben.

Mot-Proteine: treiben den Motor an, indem sie ein Drehmoment erzeugen, das das Filament rotieren lässt. Protonen-Motivkraft als Energiequelle.

Fli-Proteine: Motorschalter (kann die Rotation der Geißel umkehren)

• Mot-Proteine (MotA/B Proton/ Na Kanal) benutzen die protonenmotorische Kraft um die Struktur zu rotieren (Konzentration Protonen höher außerhalb der Zelle)

Bakterien: Flagellum - Type III Sekretion, Protonenmotorische Kraft

Archaea: Archaellum - Typ IV Pilus, ATP

-> evolutionär nicht verwandt

-> Teilung durch Verlängerung & anschließende Einschnürung in der Mitte der Zelle, alle Schichten schnüren sich zur gleichen Zeit ein

-> großer Protein-Komplex: zusammengebaut aus Zellteilungsproteinen

• FtsZ ist ein Tubulin Homolog, das sich zu einer polymeren Struktur, dem Z-Ring, zusammenfügt, der die Grundlage des bakteriellen Zellteilungsapparats bildet

= filamentation temperature-sensitive

- ohne funktionierendes FtsZ können Zellen sich nicht teilen und in lange Filamente verlängern

- hoch konserviert in Bakterien (Ausnahme: Chlamydien, Planctomycetes)

- Tubulin-Homolog: ähnliche Struktur trotz minimaler Sequenzähnlichkeit

• Teilung und Elongation zu Filamenten

• Polimerisation von FtsZ benötigt GTP

• wenn es an GTP bindet -> polymerische fadenförmige Strukturen

• GTP Hydrolyse begünstigt Zerlegung der Filamente

• diese Filamente interagieren miteinander, um einen FtsZ-Ring zu formen

• GTP zw. Nukleotid-Bindestelle des einen Monomers (N-terminal) & C-Terminus Domäne des anderen

• FtsZ setzt kontinuierlich dynamische Filamente im Zellinneren zusammen -> Filamente nur in der Mitte der Zelle stabil -> Bildung FtsZ-Ring

• Zuschnüren FtsZ-Rings bewegt IM & Zellteilungsapparat nach innen -> Einschnürung gesamter Zellhülle

Next: Was bestimmt die Position des FtsZ Rings innerhalb der Zelle?

• Teilung nahe der Zellpole kann Zellen ohne Zellkern generieren und so Zellwachstum verschlechtern

-> Die Position der Teilungsstelle und somit des FtsZ Rings muss streng kontrolliert werden

- Min CDE Proteine -> Min System regulieren Positionierung von FtsZ in vielen gram positiven und negativen Bakterien

- Das Min System verhindert die Bildung des FtsZ Rings in der Nähe der Zellpole

- Oszillieren -> dynamische Lokalisation

MinD: ATPase

MinC: Inhibitor FtsZ Ring Formation

MinE: Topologischer Spezifitätsfaktor

• MinD & MinC formen einen membrangebundenen Komplex, umgibt Polregionen der Zelle

• Hemmenden Aktivität MinC -> FtsZ-Ring Zusammenbau passiert nur im Zellzentrum

• MinE formt eine ringförmige Struktur, interagiert mit MinCD-Komplex -> entfernt MinCD Komplex von der Membran-> neue Anordung

• MinE aktiviert ATPase Aktivität von MinD

• Nach ATP Hydrolyse dissoziiert MinD von Membran

• MinD tauscht ADP gegen ATP und interagiert wieder mit der Membran

• während MinE den MinCD Komplex von einem Pol entfernt, starten MinCD Einheiten am gegenüberliegenden Pol zu polymerisieren -> neuer Zyklus beginnt

• binden an Nukleoid

• hemmen FtsZ-Polymerisation

• Nukleoid-Okklusion stellt sicher, dass FtsZ nicht über unreplizierte chromosomale DNA zusammengebaut wird

-> verhindert Zerteilung der Nukleoiden aufgrund vorzeitiger Zellteilung

• Min System: verhindert Zellteilung in den polaren Regionen der Zelle -> Positionierung

• Nucleoid occlusion: Verhindert FtsZ bildung im Zentrum sofern DNA-Replikation nocht nicht beendet ist -> Timing

• —> Beide Schützen Nucleoid vor Zerlegung

Negative Regulation:

EIn Inhibitor der FtsZ-Polymerisation blockiert die Bildung des Z-Rings in bestimmten Bereichen der Zelle & begrenzt Zellteilung auf die Bereiche, die nicht vom Inhibitor besetzt sind (z. B. Min, SlmA, MipZ)

Positive Regulation:

Ein Aktivator der FtsZ-Polymerisation stimuliert die Bildung des Z-Rings am zukünftigen Teilungsort

z.B Ssg System in Streptomyces coelicolor (SsgA & SsgB - lokalisieren an Stellen der Zellteilung vor FtsZ -> Bestimmt Stelle des Z-Rings)

• beinhaltet die beiden Proteine SsgA und SsgB

• sie lokalisieren die zukünftigen Stellen der Zellteilung vor FtsZ

• ihre Position bestimmt die Localisation des Z-Rings

• Crenarchaeota - Bsp: Sulfolobus acidocaldarius

  -> CdvA,B,C (homolog zu eukaryotischen ESCRT system (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport))

• Euryarcheota - Bsp: Haloferax volcanii -> FtsZ

Thaumarchaeota haben Cdv Proteine & FtsZ

• FtsZ1 & FtsZ2 Co-lokalisieren als Ring in der Mitte der Zelle

  -> Zellteilung gestoppt bei Abbau von einem der beiden - Interdependent

  -> FtsZ1 lokalisiert ohne Ftsz2 aber nicht andersrum

• Ftsz an Membran verankert durch ZAPA, ZIPA & SepF (essentiell in H.volcanii - direkte Interaktion mit FtsZ2)