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6. Frage - Radziwill, Optogenetik
a) Definition von Optogenetik.
b) Beschreibe den Aufbau eines Blaulichtschalters und dessen Funktion
c) Anwendungsbeispiel benennen
a) -> Verwendung genetisch kodierter Elemente zur Kontrolle biologischer Prozesse durch Licht, Nutzung lichtempfindlicher Proteine (Photorezeptoren)
-> Aktivierung von Signalwegen durch Lichtabhängige Multimerisierung von Signalproteinen, Rekrutierung von Signalproteinen in spezifische subzelluläre Kompartimente, Rekonstitution von split Proteinen
b)
Beispiel Opto-C-RAF, normalerweise erfogt die Dimerisierung von C-Raf durch die Aktivierung von RAS, das Blaulicht-sensitive Protein CRY2 kann an C-RAF gekoppelt werden und bei Blaulicht induzierter Dimerisierung hat das den selben Effekt auf C-RAF wie die Aktivierung durch RAS, nämlich die Phosphorylierung von MEK und dadurch ERK welches Einfluss auf die Gene-Expression hat.
Extra:
Licht induziert Hetero- oder Homodimerisierung oder Clustering, auch Befreiung von vorher gebundenen Einheiten oder Liganden möglich (uncaging)
Mehrere Lichtschalter für verschiedene Gene (Rot [PhyB und PIF6], Blau [CRY2] oder UV [UVR8] möglich aber kurze Wellenlänge regt auch teilweise die langwellen Sensoren an
c)
Wichtig für die Erforschung von Signalwegen, um den Effekt einzelner Protein im Signalweg unabhängig von upstream Regulatoren zu betrachen, deren Inhibitoren und andere Charakteristica.
Erforschung von Neuronenfunktionen.
Direkter Einsatz als Genschalter.
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Aufgabe 2 (Optogenetik):
a) Was ist Optogenetik?
b) Nennen Sie ein Beispiel für Optogenetik
c) Nennen Sie drei verschiedene Proteinregulationsmechanismen basierend auf Optogenetik
a) Verwendung genetisch kodierter Elemente zur Kontrolle biologischer Prozesse durch Licht, Nutzung lichtempfindlicher Proteine (Photorezeptoren)
OptoCRAF, OptoBRAF (Cry2), OptoCNK1, Cry2-EGFP
c) Aktivierung von Signalwegen durch Lichtabhängige:
Multimerisierung von Signalproteinen
Rekrutierung von Signalproteinen in spezifische subzelluläre Kompartimente
Rekonstitution von split Proteinen
AB - 2018
Signaltransduktion
c) Definition Optogenetics.
d) 2 Beispiele optogenetischer Signalleitung erklären
c) Verwendung genetisch kodierter Elemente zur Kontrolle biologischer Prozesse durch Licht, Nutzung lichtempfindlicher Proteine (Photorezeptoren)
d) Licht-regulierte Proteinkinase: optoCRAF -> MAPK pathway
OptoCRAF (CRY2-blaulicht Photorezeptor) stimuliert MEK -> ERK phosphorylierung
optoAKT (CIBN/CRY2) ->
OptoSOS (PhyB/PIF) —> Son of sevenless MAPK Signalweg Guanin-Exchange factor aktiviert Ras -> MAP Kaskade
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Genetik:
a. Welche „biofuels“ können in Cyanobakterien hergestellt werden? Nennen sie mind. 4 Beispiele?
b. Durch welche genetischen Modifikationen kann man diese Ausbeute verbessern?
c. Welche Online Datenbanken/Programme würden Sie benutzen um eine Funktion / evolutionäre Entwicklung eines Proteins zu untersuchen?
d. An welchen Teil des Ziel-mRNA bindet eine regulatorische sRNA und was folgt daraus?
a)
Alkane (Propan, Butan)
Alkene (Ethylen)
Alkohole (Ethanol, Propanol, Isobutanol)
Methan
Wasserstoff
Überexprimierung der Enzyme die an den jeweiligen Stoffwechselwegen beteiligt sind und der RubisCO, um die Kohlenstoff-Fixierung zu steigern. Außerdem das Einbringen von neuen Enzymen aus anderen Organismen um spezifische Zwischen/Endprodukte herzustellen. Das ganze möglich durch homologe Rekombination oder CRISPR/CAS, Elektroporation, Konjugation und viele andere Methoden.
Proteinfunktionen und allgemeine Informationen über UniProt (gut gepflegte erste Anlaufstelle), wenn nicht genug noch NCBI und für evolutionäre Entwicklung zusätzlich auf Uniprot über Links zu GeneTree weiterleiten lassen oder natürlich die Sequenz blasten oder Proteinfamilien Database Pfam usw.
d)
Die sRNA bindet häufig im nicht tranlatierten Bereich (3´oder 5´UTR), aber auch im codierenden Bereich komplementäre Bereich möglich. Durch die Bindung können z.B. Hairpin oder andere torsierte Stukturen die Translation inhibieren oder sogar zur Degradation führen. Außerdem kann die srRNA an der Ribosomalen Bindestelle binden und somit die Translationsinitiation verhindern.
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9. Genetik (5 Punkte)
A) Was sind sogenannte „3rd generation biofuels“ und welche Vor- und ggf. Nachteile sehen Sie in deren Nutzung? (3 Punkte)
B) Was versteht man unter dem Begriff „Transcriptomics“ und welche zwei Methoden kann man ganz grob unterscheiden? (2 Punkte)
a) "Advanced biofuels," auch als "3rd generation biofuels" bezeichnet, sind eine fortschrittlichere Generation von Biokraftstoffen, die aus einer breiteren Palette von Biomassequellen hergestellt werden können und dazu beitragen, die Nachhaltigkeit und Effizienz von Biokraftstoffen zu verbessern.
-> über Mikroalgen & Cyanobakterien produziert
Vorteile wenn Versorgung & Effizienz gewährleistet:
Energiebereitstellung aus unerschöpflicher Quelle (Sonnenlicht)
Upcycling also entfernen und wieder Nutzung von Abfall
CO2 Bindung aus der Luft am Besten direkt Abgase einer Industrie nutzen und sehr viele mehr
Nachteile:
schwere Umsetzung & gigantische Bedarf an Energie der nach derzeitigem Stand durch diese Biofuels nicht gedeckt werden könnte.
Die Produktionssysteme sind nicht robust genug und die Anpassungen die durch synthetische Biologie gemacht werden können binnen einiger Jahre [bisher] nicht Millionen Jahre Evolution ausgleichen die sich nach anderen Kreisläufen und Verbindungen gerichtet hat.
Transkriptomik: Analyse aller RNA-Moleküle in einer Zelle, einem Gewebemuster oder einem Organismus
(Meta-Transkriptomics wäre für eine ganze mikrobielle Population.)Unterscheidet sich von Proteomics da nicht alle RNA Moleküle für ein Protein codieren (ncRNA) und eine variable Regulation stattfindet vor der Translation.
Microarrays und RNA-seq.
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7. Transcriptomics
a) Was versteht man unter Meta-, Pan-, und core-Genom
b) Nennen Sie 4 Treib-/Brennstoffe, die in Cyanobakterien oder synthetisiert werden können.
c) Nennen Sie 4 Enzyme die zur Synthese von Brennstoffen in Cyanobakterien nötig sind.
Meta-Genom ist die Gesamtheit aller Gene einer (mikrobiellen) Population in einer bestimmten Umgebung
Pan-Genom ist Core Genom aber auch Variationsgenom aller Individuen einer Population oder Spezies
Core-Genom besteht aus den Genen, die in allen Mitgliedern einer Population oder Spezies konserviert sind.
Ethanol, Propanol
Ethylene
Propan, Butan
Isobutanol
Über allem ist RubisCO wichtig um Kohlenstoff zur Synthese aller Verbindungen zu fixieren
Pyruvat Carboxylase (PDC)
Alcohol Dehydrogenase (ADH)
2-Ketosäure decarboxylase (KDC) [Isobutanol]
Ethylene Forming Enzyme (EFE) + (ACP))
9. Frage - Hess
a) Nenne 4 Methoden für die genetische Manipulation von photosynthetischen Mikrooalgen.
b) Definition von Riboswitches
c) Für 2 Kraftstoffe, die für Transportzwecke genutzt werden können, erklären, wie die Produktion in Cyanobakterien erfolgen könnte und welche Enzyme dafür benötigt werden.
Mikroalgen wie z.B. Cyanobakteria, Chlamydomonas, Diatoms werden können durch folgende Methoden manipuliert werden:
Natürliche Transformation, Elektroporation, Konjugation, Partikelkanone - Biolistik, Transformation mit Glasperlen
Gen Integration (homologe Rekombination oder CRISPR/CAS)
Induzierbare Promotoren (Kontrolle von Produktions und Regulationsmaschinerie der Mikroalge) oder Riboswitches
Riboswitches: mRNA die durch kleine Moleküle reguliert werden kann, Zugänglichkeit der (Ribosome binding site) RBS für das Ribosom verhindert oder gewährt Translation eines Proteins
Ethanol Produktion aus Pyruvat durch Pyruvat Decarboxylase (PDC) und Alkohol Dehydrogenase (ADH). Nur 2 Enzyme notwendig um aus dem zentralen Metabolit Pyruvat den Treibstoff herzustellen. Optimierung durch “Metabolic Engineering” um Bereitstellung von Pyruvat zu erhöhen und den Kohlenstofffluss und Redoxäquivalente auszugleichen.
Isobutanol and isobutaraldehyde Produktion auch direkt aus Pyruvat möglich aber 4 Enzyme aus verschiedenen Organismen notwendig (AlsS, IlvC, IlvD, Kdc - 2-Ketosäure-Decarboxylase ) RubisCO überexprimieren um mehr Kohlenstoff im Calvin Zyklus zu fixieren.
Ethylensynthese über Methionin (aus Citrat-Zyklus), Enzyme: ACP (Aminocyclopropan-1-carboxysäure synthase) & EFE (Ethylene-forming enzyme)
Nachteile: Weit vom Kernmetabolismus, Verlust C-Atom pro Ethylenmolekül, tox. Beiprodukt Blausäure
22/23 B
Genetik
a) Wie kann die Ethanolbiosynthese in den Cyanobakteriellen Stoffwechsel integriert werden ? Nennen sie die im Metabolismus natürlicherweise vorkommenden Ausgangsverbindung und den Namen mindestens eines der speziell benötigten Enzyme
b) Was für funktionelle Genkategorien erwarten Sie für das Core-Genom einer Bakteriengruppe ?
c) Welche frei über das Internet erhältlichen Werkzeuge (Programme, Datenbanken) würden sie benutzen, um Hinweise herauszufinden, welche Funktion ein bisher experimentell nicht untersuchtes Genprodukt (Protein) hat und wie seine evolutionäre Verbreitung ist ? Nennen sie mind. 2 Beispiele für solche Werkzeuge !
Das Ausgangsprodukt zur Ethanolbiosythese ist gleichzeitig die Zentrale Verbindung des Hauptstoffwechselweges in Cyanobakterien, das Pyruvat. Es wird in der Glykolyse gebildet um dann eig in Acetyl-CoA umgewandelt zu werden und vollständig oxidiert zu werden im TCA. Stattdessen kann das Pyruvat durch die Pyruvat Decarboxylase (PDC) zu Acetaldehyd und dann durch die Alkohol dehydrogenase (ADH) zu Ethanol umgewandelt werden.
Alle essentiellen Gene der Spezies
—> Stoffwechsel, Regulation, Reparatur und Replikation, Zellteilung, Transkiption und Translation (auch alle tRNAs zur Proteinbiosythese daher auch RNA-Moleküle), Zellwand und Membranproteine
-> Keine Gene zur Anpassung an Umweltbedingungen
UniProt, NCBI (Blast, Pfam)
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a) 3 Beispiele von Biokraftstoffen aus Cyanobakterien
b) Was versteht man unter den folgenden Begriffen: core-, pan-, und meta-Genom?
c) Nennen Sie drei Wirkprinzipien bakterieller regulatorischer sRNA
Ethanol
Propanol
Core= Alle Gene die in allen Individuen einer Population oder Spezies indentisch vorhanden sind, hochkonservierte Gene die zur Lebenserhaltung unabdingbar sind.
Pan= Alle Core-Gene aber auch alle Variablen Gene einzelner Individuen in der Gesamten Population bzw. Spezies (einer Art)
Meta-Genom ist die Gesamtheit aller genetischer Informationen eines Mikrobioms.
Repression der Genexpression:
Inhibitorische Wirkung für Translation durch Binden an Ribosomale Bindestelle an der mRNA wodurch die Translationsinitiation verhindert wird
Förderung des RNA Abbaus durch Ribonukleasen
Aktivierung von Genexpression:
Aktivierung durch konfomationsänderung in der mRNA Struktur (Befreiung der RBS) oder Inhibierung durch umgekehrten Effekt
Stabilisierung der mRNA
Weitere:
Interaktion mit regulatorischen Proteinen, die die Genexpression beeinflussen , Modulation durch bindung an Ribosomen
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Aufgabe 9, Hess
a. In welchen Organismen stellen natürlicherweise Alkane her? Wie lautet das Schlüsselenzym?
b. Wieso sind Gene aus dem Core-Genom weitgehend bekannt, solche aus dem flexiblen Genom jedoch noch weitgehend unbekannt?
(Cyanobacteria) Prochlorococcus marinus MIT9313
aldehyde decarbonylase
Da flexible Gene schwerer zu analysieren sind da flexible Gene häufig neu sind, dadurch weniger erforscht, keine Basis um zu vergleichen, weniger konserviert, schwer zu finden. Aus der Forschungshistorie ist das auch begründbar, da die essentiellen Gene in der Analyse natürlich vorrangig sind auch weil diese ubiquitär vorkommen! Erst die Basis dann die spezifizierungen.
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Frage 9: Genetik
a) Welche Vorteile (min 4) besitzen Cyonbakterien und Mikroalgen in der biotechnologischen Herstellung von Brenn- und Treibstoffen gegenüber der Herstellung aus Pflanzen oder nicht photosynthetischen Mikroorganismen? (2 P)
b) Nennen sie mindestens zwei Beispiele für solche durch Cyanos und Mikroalgen herstellbaren Brenn- und Treibstoffe. (2 P)
c) Was verstehen wir unter den Begriffen Core-, Pan und Metagenom? (1 P)
Direkte Umwandlung von Sonnenenergie in verschiedene Brennstoffe möglich: unerschöpfliche Energiequelle
Kann leicht auf anorganischen Medien (und sogar Meerwasser!) kultiviert werden
Kein Wettbewerb um Ackerland
Einfache genetische Manipulation (Cyanobakterien sind Prokaryoten).
Viele N2-fixierende Stämme
b) Ethanol
10. Biofuels/transcriptomics
a. In welchem Organismus findet Alkanbiosynthese natürlicherweise statt? Welches istdas Schlüsselenzym?
b. Nennen Sie zwei Biokraftstoffe, ihre Ausgangsstoffe und die Enzyme, die für ihre Synthese benötigt werden.
c. Was ist eine miRNA? In welchen Organismen kommen sie vor?
a) (Cyanobacteria) Prochlorococcus marinus MIT9313
Ethanol aus Pyruvat, Enzyme: Pyruvat Decarboxylase (PDC), Alkohol Dehydrogenase (ADH)
Ethylen aus Methionin, Enzyme: ACP (Aminocyclopropan-1-carboxysäure synthase) & EFE (Ethylene-forming enzyme)
mikroRNA kurze nicht-kodierende RNA binden an 3’ untranslatierte Region (UTR) von Ziel-mRNAs und beeinflussen dadurch Stabilität & Translation-> regulieren die Genexpression hochspezifisch auf der post-transkriptionalen Ebene
Eukaryoten, Bakterien, Cyanobakterien, Pflanzen
Aufgabe 8 (Transcriptomics):
a) Was bedeutet Transcriptomics? Unterschieden Sie grob zwischen zwei Methoden
b) Was ist die Rolle von ncRNA? Erläutern Sie ein Beispiel.
c) Weshalb lässt sich von der absoluten mRNA Menge kein direkter Rückschluss auf die hieraus resultierende Proteinmenge schließen?
a) Transkriptomik: Analyse aller RNA-Moleküle in einer Zelle, einem Gewebemuster oder einem Organismus
Methoden:
RNAseq: RNA-Moleküle in cDNA übersetzt -> DNA sequenzierung und analysse
Microarrays: Plattformen auf denen spezifische RNA-Sonden immobilisiert sind -> Hybridisierung RNA-Proben mit sonden
Merkmal
Microarray
RNA-Seq
Genomsequenz
Muss bekannt sein
Muss nicht bekannt sein
Genomgröße
Besser geeignet für kleinere Genome
Besser geeignet für größere Genome
Identifikation der Transkripte
Nur Transkripte mit vorhandenen Sonden
Alle Transkripte werden identifiziert
Nachteil
Nur Transkripte mit Sonden werden erkannt
cDNA, Amplifikation & sequencing bias
b) non-coding RNAs - versch. regulatorische Funktionen z.B Regulation an Genexpression
Bsp: Reguation genexpression als Reaktionn auf Eisenmangel
Eisenmangel -> IsaR1 bindet 5’ UTR der Ziel mRNA und blockiert dessen Translation -> Downregulation Regulation der Eisenproteinbiosynthese -> Anpassung an Verfügbare Ressourcen
Anwesenheit von mRNA allein ist kein zuverlässiger Indikator für die tatsächliche Proteinproduktion, Postranskriptionelle Regulation beeinflusst Stabilität, Translationseffizienz, RNA-abbau usw.
RNA und Proteinhalbwertszeiten variieren stark
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9. Transcriptomics
a. Was bedeutet Transcriptomics? Nennen sie 2 Methoden mit denen dies grundsätzlich bewerkstelligt werden kann. (2 P)
b. Erläutern sie das Prinzip des dRNA-Seq. (2 P)
c. Welche Information liefert dRNA-Seq. (1P)
a. Transkriptomik: Analyse aller RNA-Moleküle in einer Zelle, einem Gewebemuster oder einem Organismus
RNAseq: RNA-Moleküle in cDNA übersetzt -> DNA sequenzierung und analyse
b.
RNA-Moleküle in cDNA übersetzt - Erkennung via Poly-A Schwanz, wenn kein Poly-A korrekte Identifikation der RNA am 5’ cap schwierig - Terminator-Endonuclease bauen monophosphorylierte RNA ab
Reverse Transkriptase zu cDNA -> Fragemntierung (erleichtert Sequenzierung) -> Größenfraktionierung (Sortieren nach Größe) -> Illumina-Adapter mit 4nt-Tags (für Sequenzierung kennzeichnen) -> Illumina sequencing
c. liefert spezifische Informationen über die differentielle Genexpression zwischen den untersuchten Proben. Es ermöglicht die Identifizierung von Genen, die in Reaktion auf bestimmte Behandlungen oder Bedingungen differentiell exprimiert werden
Proteomics:
a. Peptidsequenz gegeben, Schnittstellen mit Trypsin einzeichnen
b. MS-Analyze gegeben, Ladung des Peptids angeben und die Masse des neutralen peptids berechnen
c. Bruchstücke eines Peptids durch „colission induced fragmentation“ benennen und in ein Peptid einzeichnen?
Trypsin schneidet nach basischen AS C-Terminal (Lysin und Arginin)
Ladung je nach Abstand der Peaks: 0,5 wäre Ladung 2 und 0,33 wäre Ladung 3 usw. dann muss man ersten Peak (masse/ladungs verhältnis m/z-Wert) mit Ladung multiplizieren und die Masse H+ (1) mal Ladung noch abziehen dann hat man Masse neutrales Peptid
CID = collision induced dissociation
b-Ionen (N-Terminale Seite der Peptidbindung) und y-Ionen (C-Terminale)
Proteomik und Proteasen (5 Punkte)
A) Markieren Sie in der folgenden Aminosäuresequenz Schnittstellen für eine Spaltung mit der Protease Trypsin. Wie viele Peptide werden generiert? YIFRPSCVPLMRCAGCCGDEGLNCVPVDVYNVTMEIARIKPHQSQHIAHMSFLQHSKCDCHPG
B) An welcher Stelle der Sequenz befindet sich eine mögliche Glykosylierungsstelle? Unterstreichen Sie das dazugehörige Sequenzmotiv.
C) Im Massenspektrum eines protonierten Peptids haben Sie Peaks bei den folgenden m/z-Werten gemessen: 700; 700,5; 701; 701,5. Welche Ladung trägt das Peptid Ion?
D) Geben Sie den monoisotopischen m/z-Wert an.
E) Berechnen Sie die monoisotopische Masse des neutralen Peptids an (in Dalton).
C-Terminal Arginin (R) and Lysin (K)
YIFR//PSCVPLMR//CAGCCGDEGLNCVPVDVYNVTMEIAR//IK//PHQSQHIAHMSFLQHSK//CDCHPG
—> 6 Peptide
N-Glykosylierung = Asn (N) - X - S/T (X nicht Prolin oder S/T)
O-Glykosylierung weisen kein Sequenzmotiv auf als an Serin oder Threonin möglich
Ladung = +2
700
e)
700x2 - 2x1 = 1398 Da
6. Proteomics
a) Sequenz gegeben. Trypsin-Schnittstellen einzeichnen und Anzahl der zu erhaltenen Peptide nennen.
b) N-Glykosylierungsstelle in der Sequenz markieren. Motif nennen.
c) Massenänderung nach PNGaseF-Verdau nennen.
d) m/z Werte gegeben, daraus die Ladung des Peptids bestimmen.
e) Masse des Peptids bestimmen.
Nach Lys (K) und Arg (N)
N-X-S/T (X nicht P oder S/T)
Peptid-N-Glycosidase F spaltet N-Glykane ab (zwischen Asn und GlcNAc)
Masse - Masse aller N-Glycane
Abstand 0,5 —> Ladung = 2
m/z x z - z x 1
7. Frage - Drepper, Proteomics
a) Es war einen AS-Sequenz gegeben, es sollten mögliche Schnittstellen bei Behandlung mit Trypsin eingezeichnet werden.
b) In einem Massenspektrum eines protonierten Peptids wurden folgende peaks bei folgenden m/z Werten gemessen: 301, 301.5, 302, 302.5. Welche Ladung trägt das Peptidion?
c) Berechne die monoisotopische Masse des neutralen Peptids (in Da).
d) Wie können posttranslationale Modifikationen mittels Massenspektrometrie nachgewiesen werden? Was ist dafür nötig?
Spaltung Trypsin Peptidbindung C-terminal von Lysin oder Arginin
m/z = Masse zu Ladungsverhältnis deswegen wird die Intensität es Peaks erst noch mit der Ladung multipliziert um die Masse des Peptids zu erhalten, in einem Spektrum wo die Peaks 0,5 Abstand haben kann man davon ausgehen das die Ladung +2 beträgt, weil man die Masse ja verdoppeln muss und ein Abstand von 1 der nächsten Isotopenform entsprechen würde diese sich dann aber durch z teilt.
Wenn Abstand bei Peaks ca. 0,33 beträgt wäre Ladung +3.
“Der Abstand dieser Peaks zueinander beträgt annähernd ein Dalton, wenn die gemessenen Ionen einfach positiv oder negativ geladen sind. Sind die Ionen mehrfach geladen verringert sich der Abstand um 1/z u. Diese Eigenschaft ist vor allem für hochmolekulare Stoffe mit sehr hohen Massen von Vorteil, da sie, wenn sie mehrere Ladungen besitzen, bei geringeren Massen detektiert werden. Das Massenspektrum wird um den Faktor komprimiert”
relative Molekühlmasse Mr = (m/z) * z – z * m(H+ )
301 x 2 - 2 x 1 = 600 Da
Man muss Ionen-Massen im Fragmentspektrum seines Peptids kennen (Aminosäuremassen) und die Masse der verschiedenen Modifikationen nach denen man suchen will (z.B. Phosphorylierung) dann vergleicht man die Massen der b- und y-ionen und ab der AS die schwerer wird sollten alle folgenden Fragmente auch schwerer sein um das Gewicht der entsprechenden Modifikation.
Proteomics
a) Es war eine Aminosäuresequenz gegeben und man sollte die Schnittstellen von Trypsin einzeichnen.
b) MS-Analyse gegeben. Anhand dessen soll die Ladung des Peptids, sowie die Masse des Ions, des neutralen Peptids und der monoisotopischen m/z-Werts, berechnet werden.
Nach Lys (K) und Arg (R) oder modifiziertem Cys (Cmod)
easy
Proteomik & Proteasen
a) Markieren sie in der folgenden AS-Sequenz Schnittstellen für eine Spaltung mit der Protease Trypsin
b) Sie messen folgendes Massenspektrum eines Protonierten Peptids: Welche Ladung trägt das Peptid-Ion
c) Berechnen sie aus dem in Aufgabe b gezeigten Spektrum die monoisotopische Masse des neutralen Peptids (gerundet auf ganze Zahlen in Dalton)
d) Ordnen sie den Schritten einer Proteomik-Analyse der linken Spalte jeweils eine der Aussagen rechts zu, indem sie mit strichen verbinden
Mit Jodacetamid…
Bei der Elektrospray-Ionisation…
Aus dem MS-Spektrum…
Mit Hilfe des MS/MS Spektrums…
Die Art & Anzahl einer posttranslationalen Modifikation…
Die genaue Position einer posttranslationalen Modifikation…
… wird die exakte Masse eines Peptids bestimmt.
…wird die Sequenz eines peptids identifiziert.
…wird aus dem MS/MS-Spektrums abgeleitet.
…werden Cysteinreste stabil modifiziert.
… wird aus dem MS-Spektrum abgeleitet.
…Werden Analyten protoniert und in die Gasphase überführt.
nach K und R
Ladung +4
751 x 4 - 4 x 1 = 3000 Da
Mit Jodacetamid……werden Cysteinreste stabil modifiziert.
Bei der Elektrospray-Ionisation……Werden Analyten protoniert und in die Gasphase überführt.
Aus dem MS-Spektrum…… wird die exakte Masse eines Peptids bestimmt.
Mit Hilfe des MS/MS Spektrums……wird die Sequenz eines peptids identifiziert.
Die Art & Anzahl einer posttranslationalen Modifikation……wird aus dem MS-Spektrum abgeleitet.
Die genaue Position einer posttranslationalen Modifikation…… wird aus dem MS/MS-Spektrum abgeleitet.
Aufgabe 7, Drepper, Proteomics
a. AS-Sequenz, Schnittstellen bei Verdau mit Trypsin
LC-MS Spektrum, Peaks bei 550.5, 550.75, 551.0, 551,25
b. Welche Ladung trägt das ionisierte Peptid?
c. Monoisotopischer m/z Wert
*Beispiel Polypeptid gegeben (ohne AS Reste)*
d. Bei kollisionsinduzierter Fragmentierung (CID), welche Bindung könnte brechen? Zeichnen sie den möglichen Bruch mit einem X ein und kreisen sie die resultierenden Fragmente ein
e. Wie werden die resultierenden Fragmente bezeichnet?
nach Lysin und Arginin (und modifiziertem Cys)
+4
550.5
—> Peptidbindungen
auch Esterbindungen in Lipiden, Glykosidische Bindungen und Disulfidbrücken
b- und y-Ionen
Extra
ETD (electron transfer dissociation) radical anion injected to ion beam, results in c-ions and z-ions (works well for z>2, helpful for long peptides and intact proteins) —> Hier bricht die N—C(mit R) Bindung
Proteomik
Gegeben ist ein Alignment von Aminosäuresequenzen von zwei VEGF Isoformen einschließlich Signalpeptide. Es wird davon ausgegangen, dass Trypsin an allen theoretisch möglichen Stellen schneidet, und nur Peptide mit 5 AS und länger im MS nachgewiesen werden können.
a) Wie viele Peptide erwarten sie für die jeweiligen Isoformen nach Verdau mit Trypsin? Schnittstellen einzeichnen.
b) Welche Peptide sind spezifisch für die Isoform?
c) Geben sie das Peptid und das Sequenzmotif an, in dem die vorhergesagte N-Glykosylierungstelle enthalten ist.
d) Welche Massenänderung (gerundet) erwarten sie an der deglykosylierten Aminosäure im Vergleich zur unmodifizierten Form nach Behandlung mit dem Enzym PNGase F?
e) Alternativ zu Trypsin könnten Sie auch die Protease Glu-C benutzen, die C-terminal von Glutamat schneidet. Wäre diese Protease geeignet, nachzuweisen welche Isoform in ihrer Probe glykosyliert vorlag? Markieren sie die Schnittstellen (in zweitem Alignment).
a) Schneidet nach Lysin und Arginin
c) N-X-S/T (X nicht P oder S/T)
5. Proteomics (1-Buchstaben-Code!)
a. Zeichnen Sie die Trypsin-Schnittstellen in den gegebenen AS-Sequenzen der drei
VEGF-Isoformen ein. Wie viele Fragmente erhalten Sie pro Sequenz?
b. Durch welche der Fragmente kann man die Isoformen voneinander unterscheiden?
c. Schneiden Sie nun mit Glu-C (nach E) oder Lys-C (nach K). Für welches der beiden
Enzyme würden Sie sich entscheiden, um die drei Isoformen sicher voneinander
unterscheiden zu können?
Aufgabe 7 (Proteasen):
Es war die Peptidsequenz von VEGF121_Human gegeben:
APMAEGGGQN HHEVVKFMDV YQRSYCHPIE TLVDIFQEYP DEIEYIFKPS CVPLMRCGGC CNDEGLECVP TEESNITMQI MRIKPHQGQH IGEMSFLQHN KCECRPKKDR ARQEKCDKPR R
a) Wo würde bei einem Verdau mit Trypsin gespalten werden? Wieviel Fragmente würden entstehen?
b) Um über ein Alignment Rückschlüsse auf die Peptidsequenz ziehen zu können, müssen Sie einen weiteren Verdau mit einer anderen Endopeptidase durchführen. Wenn Sie nun die Wahl zwischen Lys-C und Glu-C hätten, für welches würden Sie sich entscheiden? Warum würden Sie sich hierfür entscheiden?
c) Zeigen Sie exemplarisch anhand eines von Ihnen gewählten Peptids, wie die Untersuchung der Peptidsequenz mittels Massenspektrometrie theoretisch stattfinden würde?
APMAEGGGQNHHEVVK//FMDVYQR//SYCHPIETLVDIFQEYP DEIEYIFK//PSCVPLMR//CGGCCNDEGLECVPTEESNITMQI MR//IK//PHQGQHIGEMSFLQHNK//CECR//PK//K//DR//AR//QEK//CDK//PR//R
-> 16
??
Pflanzen Biotechnologie:
a. Welche Zucker kommen häufig in tierischen Zellen vor, jedoch nicht in Pflanzen?
b. Warum können pflanzliche Glykosilierungsmuster ein Problem für Medikamente darstellen?
c. Wie können Sie die Glykosilierungsmuster verändern?
d. Viele pflanzliche Medikamente sind Proteine. Welche anderen Makromolekül-Klasse kann noch als biologisches Medikament genutzt werden (so ähnlich formuliert)?
Sialinsäure (Sialylation nicht in Pflanzen vorhanden)
Abweichende Glykosylierungsmuster -> Immunogenität pflanzenspezifischer Zuckermolekülstrukturen
-> lösen Immunantwort im menschlichen Körper aus
-> Glyco-Engineering, Gene durch KO-Mutanten ausfindig machen die für immunogene Zucker zuständig sind und diese deletieren sodass nur noch Grundglykosylierung vorhanden ist
-> Gezielte Genmanipulation pflanzentypischer Glykosyltransferasen
Grundstruktur kann mit anderen Glykosylierungsmustern erweitert werden
-> Insertion von humanem Glykosyltransferasen, Bsp: Galaktosylierung und Sialylierung - Halbwertszeit verändernd
Monoklonale AK gegen Krebs / virale Infektionen (ZMapp gegen Ebola) -> Verbesserte ADCC- antibody-dependent cellular cytotoxicity
Pflanzenbiotechnologie (5 Punkte)
A) Pflanzliche Systeme können für die Produktion rekombinanter Biopharmazeutika eingesetzt werden. Bitte nennen Sie einen generellen Vorteil gegenüber der Produktion in Bakterien. Bitte nennen Sie auch einen generellen Nachteil gegenüber der Produktion in Säugertierzellen und begründen Sie ihre Antwort (2 Punkte).
B) Die Protein-N-Glykosylierung von pflanzlichen und Säugerzell-Produktionssystemen unterscheidet sich in verschiedenen Punkten. Welche Zucker besitzen Pflanzen, die in Säugern nicht vorkommen, welche fehlen in Pflanzen? Aus welchen Gründen können die verschiedenen Unterschiede problematisch sein? (3 Punkte)
Vorteile gegenüber Bakterien:
komplexe posttranslationale Modifikationen wie z.B. Glykosylierungen machbar
Geringes Kontaminationsrisiko mit bakteriellen Toxinen Viren
Niedrige Produktionskosten
Nachteile gegenüber Säugerzellen:
Pflanzen & nicht in Säugern: Xylose und Fucose
Säugern aber nicht in Pflanzen: Sialinsäure
-> Immunogenität der pflanzenspezifischen Zuckermolekülstrukturen -> lösen Immunantwort aus
-> biologische Aktivität (ohne Sialysierung könnte Produkt evtl keine Wirkung im Mensche haben)
-> Abbau, Stabilität (des Glykoproteins) —> Bioverfügbarkeit
5. Glykobiologie (5 Punkte)
A) Zeichnen Sie schematisch die Core-Struktur von N-glykosidischen Glykoproteinen auf und benennen Sie die Kohlenhydrat-Bausteine (1 Punkt).
B) An welchen Aminosäureresten kann ein Protein mit der dargestellten Peptidsequenz N-glykosyliert werden? Markieren Sie alle möglichen N-Glykosylierungsstellen in der Sequenz (1 Punkt)
ASENRASQNISDMYKFVNSPDNDNGMQNKTEPADSIPTL
D) Nennen Sie ein therapeutisches Glykoprotein und seine Funktion (1 Punkt).
Asparagin mit 2 N-Acetylglucosamin (GlcNAc), Mannose mit Verzweigung und 2 weitere GlcNAc
Das N-Glykosylierungssequon besteht aus der Aminosäure Asparagin (N), gefolgt von jedem anderen Aminosäurerest X, dann gefolgt von Serin (S) oder Threonin (T) und schließlich einer beliebigen Aminosäure außer Prolin X. Laut Wikipedia bei beiden X kein P, S oder T.
Erythropoietin (EPO) -> fördert die Reifung roter Blutkörperchen (Erythropoese)
rekombinantes EPO als Biopharmazeutika
-> asialo-EPO: keine erythropoetische Wirkung, antiapoptotisch, gewebeschützend
5. Glykosylierungen
a) N-Glykosylierungsstellen in einem Peptid markieren.
b) Eine Aminosäure nennen, die O-glykosyliert werden kann. Welche funktionelle Gruppe wird benötigt?
c) Welche Glykane enthalten eine Core-Struktur? Diese skizzieren und Elemente benennen.
An folgendem Muster: Asn (N) - X - Ser/Thr - X
Serin, Threonin und Tyrosin können O-Glykosyliert werden benötigt wird eine Hydroxy-Gruppe (-OH)
N/O-Glykane -> Core-Struktur bindet an Aminosäure und besteht aus 2 GlcNAc (N-Acetylglucosamin) und 3 Mannosen (die als Verzweigung vorliegen)
8. Pflanzenbiotechnologie
a) Nennen und erläutern Sie die 5 Ebenen, um die Produktion von Biopharmazeutika zu verbessern.
b) Erläutern Sie wie zwei dieser Ebenen in Physcomitrella patens optimiert wurden.
Kultivierungsbedingungen - standardisierter & Anpassung an Zielprotein
Genexpression - Anpassung Promotoren mit versch. Induzierbarkeit, Genomeditierung
Intrazellulärer Transport - Signalsequenzen für versch. Kompartimente anpassen
Posttranslationale Modifikation - z.B Glykosylierung
Sekretion und Downstream Processing (Aufreinigen etc)
Kultivierungsbedingungen - Zellkultur gewährt genetische Stabilität , Upscaling in wave bags, Temperatur und pH wert passend eingestellt -> Gewebekultur anstelle von Zelllinien -> genetische Stabilität
Genexpression - optimierte Gene Expression wird durch den Einbau verschiedener Promotoren zu Anpassung der benötigten Expressionsstärke erreicht -> Transformation von haploidem Material -> genetische Modifikationen sofort wirksam und stabil vererbt
Postranslationale Modifikationen - Glykosylierungsmuster anpassen z.B durch ß1,3 galt KO
8. Frage - Decker
Nenne 3 Aspekte, in den pflanzebasierte Systeme für die Produktion von Biopharmazeutika vorteilhaft sein können und erläutere diese.
Posttranslationale Modifikationen höherer Eukaryoten -> Bsp: Protein-Glykosylierung
Geringes Kontaminationsrisiko mit bakteriellen Toxinen & Viren
Niedrige Produktionskosten -> Skalierbarkeit & Effizienz
Aufgabe 6, Warscheid, Glykosylierung
a. Welche Rolle spielt Dolichol bei der N-Glykosylierung von Proteinen?
b. Welches Molekül stellt die Grundlage für Dolichol dar? Benennen sie es und zeichnen sie seine Strukturformel
c. Kompartiment der O-Glykosylierung, welche AS kann glykosyliert werden und welche funktionelle Gruppe?
d. Zeichnen Sie die Core-struktur von N-Glykosiden. Benennen Sie die Zuckerbestandteile.
e. Nennen sie ein Beispiel für ein therapeutisches Glykoproteine sowie seinen Nutzen.
Dolichol dient als Akzeptor für die Kohlenhydratkette, die an das Protein gebunden wird. Es handelt sich um eine langkettige, hydrophobe Verbindung, die als Gerüst für die Kohlenhydratkette dient, während diese synthetisiert wird. Nachdem die Kohlenhydratkette vollständig an den Dolichol gebunden ist, wird sie auf das Protein übertragen, das im ER synthetisiert wird.
Isopentenylpyrophosphat (IPP)
Ser und Thr es wird die Hydroxylgruppe Glykosyliert und es findet im GolgiApperat statt.
Asn-GlcNAc-GlcNAc-Mannose-2 Mannose (gabel)
Erythropoietin (EPO) —> Behandlung von Blutarmut, regt die Bildung roter Blutkörperchen an
22/23 auch 20/21
Pflanzentechnologie
b) Säugerzellen sind der Standard bei der Produktion von Biopharmazeutika. Auch die Produktion in Pflanzenzellen wird immer attraktiver, allerdings entsprechen die Glykosylierungsmuster nicht den von Säugerzellen. Nennen Sie mindestens zwei Fälle, in denen dieser scheinbare Nachteil zu einem Vorteil genutzt werden kann (Nischen).
c) Die Protein-N-Glykosylierung von pflanzlichen und Säugerzellen-Produktionssystemen unterscheiden sich in verschiedenen Punkten. Welche Zucker besitzen Pflanzen, die in Säugern nicht vorkommen, welche fehlen in Pflanzen? Zeichnen!
Hohe Homogenität der Pflanzenglykanmuster: Effiziente Aufnahme durch Zelloberflächenrezeptoren
Monoklonale Antikörper (mAb) gegen Krebs und virale Infektionen: erhöhte Aktivität lytischer Effektorzellen (ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity) aufgrund modifizierter Glykosylierung
Asialo-Erythropoietin (EPO) weist spezif. Veränderung in Glykosylierung auf -> Veränderung führt zu neuroprotektiver Aktivität
c) Nur in Pflanzenzellen: ß-1,2-xylose, a-1,3-fucose
Fehlen in Pflanzenzellen: a-Galactose, Sialinsäure (N-Acetylneuraminsäure)
22/23 B auch 15
Pflanzenbiotechnologie
Bitte beschreiben sie 5 Aspekte die ggf optimiert werden müssen, damit ein System zur Biopharmazeutika-Produktion geeignet ist
Produktions/Kultivierungsbedingungen
Standardisiert, anpassbare Bedingungen, Upscaling, Sicherheit (GMP-compliance)
Genexpression
Überexprimieren was benötigt, Deletieren was nicht um möglichst hohe Effizienz, richtige Promotoren, CRISPR/CAS
Translation, intrazellulärer Transport
optimierung von Sekretorischen Wegen für effiziente Aufreinigung, optimierung Signalsequenzen
posttranslationale Modifikation
Protein Faltung und PTMs sehr wichtig für biologische Funktion eines Proteins, Optimierung der Gylkosylierungsmuster, einbringen bzw. delitieren bestimmter Enzyme um Core-Glyko zu erhalten und an diese Humane Zucker anzubringen
Downstream Processing
Optimierte Aufreinigungsmethoden möglichst Kostengünstig, daher große Maßstäbe, Sicherheit!
Frage 8: Pflanzenbiotechnologie
a) Nennen sie Kulturbedingungen für ein pflanzliches System, das in der Bioproduktion verwendet wird. Welche Unterschiede gibt es zu Säugerzellen? (2 P)
b) Was bedeutet „Glyco-Engineering“ bei biopharmazeutischen Proteinen? Was muss man beachten, wenn das Produktionssystem eine Pflanze ist? Warum ist Glyco-Engineering bei Physcomitrella patens vergleichsweise leicht zu verwirklichen (2 Gründe)? (3 P)
N- und O-glykosidische Bindung im Vergleich
a. Welche AS, welches Motiv?
b. Core-Struktur, Zeichnung, Komponenten benennen
c. Enzym
d. Zellkompartiment
a. Nennen sie fünf Optimierungsmöglichkeiten der Glykoproteinproduktion in Pflanzen.
Beschreiben Sie für zwei der Möglichkeiten, wie sie in P. patens umgesetzt wurden.
Aufgabe 6 (Pflanzenbiotechnologie):
a) Was ist cGMP?
b) Erklären Sie Orphan Diseases und deren Bedeutung für die Pharmaindustrie
c) Wo liegt der Unterschied bei der Glykosylierung in Pflanzen und Säugern?
d) Wie können die genannten Unterschiede für pharmazeutische Zwecke angepasst werden?
Bionik und Architektur:
a. Welches biologische Vorbild wurde für den Bau des alten Zoologiehörsaals genutzt?
b. Nennen Sie 2 Teilbereiche der Bionik?
“Knochendecke” Biologisches Vorbild: Knochenbälkchen im Oberschenkel von Säugern
—> optimale Lastverteilung, Resourcenschonend
Architektur & Design
Leichtbau & Materialien
Oberflächen & Grenzflächen
Kommunikation & Sensorik
Biomechatronik & Robotik
Fluiddynamik, Schwimmen & Fliegen
Sensor- & Energie-Bionik
Beispiele:
Biomorphes Bauen:
Antoni Gaudi - Sagrada Familia
Geomorphes Bauen:
César Manrique
Naturphilosophisches Bauen
Friedensreich Hundertwasser
Bio-inspiriertes Bauen:
Frei Otto
10. Frage - Masselter, Bionik
a) Welchen biologischen Zweck dient die Sitzstange bei der Blüte der Paradiesvogelblume? (2 Punkte)
b) Welches Produkt, das diese Funktion biomimetisch nachahmt, wurde in der Vorlesung besprochen (Name oder Funktion beschreiben). (3! Punkte)
Paradiesvogelblume (Strelitzia reginae) -> Deformierung der Sitzstange unter der Last des Bestäubers, Öffnungsmechanismus
Die Sitzstange dient als Plattform, auf der Vögel landen können, während sie den Nektar aus der Blüte trinken. Durch das Gewicht des Vogels biegt sich die Stange und öffnet sich dadurch und gibt den Pollen frei (aus Staubblättern im inneren der Kronblätter) der an dem Nektar trinkenden Vogel haften bleibt. Bei der nächsten Blume befruchtet er dann den Stempel (Bestehend aus Griffel und Narbe) in der Mitte der Blüte. Die Blüte armt einen Paradiesvogel nach durch seine hellleuchtenden Kelchblätter.
Flectofin / Flectofold, ist ein System durch Biegung des Rückgrates eine Fläche zu öffnen oder zu schließen, dies kann zur Beschattung von Gebäuden an der Fassade genutzt werden.
Funktionsprinzip: Biegedrillknicken und
seitliches Kippversagen
10. Bionik (5 Punkte)
A) Welchen biologischen Zweck hat die Sitzstange bei der Blüte der Paradiesvogelblume? (2 Punkte)
B) Aus welchen Blütenteilen besteht diese Sitzstange? (3 Punkte)
Bietet Landemöglichkeit für kleine Vögel, durch den Biegemoment öffnet sich die Sitzstange und gibt den pollen frei der an dem Nektar trinkenden Vogel hängen bleibt und somit bei der nächsten Pflanze befruchten kann.
-> Deformierung der Sitzstange unter der Last des Bestäubers, Öffnungsmechanismus
seitlicher Auswuchs, Flügel, Staubblätter (Pollenproduktion), Lamina, seitliche Rippe und zusammengesetzte Rippe
Bei der Blüte kommen noch die orangenen Kelchblätter hinzu (anlocken von Vögeln)
17/18 auch 15/16
9. Bionik
a) Formel des axialen Flächenträgheitmoments I mit Einheit
b) Formel des Biegemoments BM mit Einheit
I = pi/4 * r^4 [m^4], r= d/2
BM = α * F(crit.) [Nm]
σ = BM * (r/I)
Einheit: Nm^-2 (N/m^2)
Bionik Bruchexperimente
a) Nennen sie die Formel zur Berechnung des axialen Flächenträgheitsmoments Iax bei einem runden Querschnitt und geben sie an in welcher Einheit Iax ausgedrückt wird
b) Nennen sie die Formel zur Berechnung des kritischen Biegemoments BM bei Astbiegung und geben sie an in welcher Einheit BM ausgedrückt wird
—> Bruchspannung
Aufgabe 10, Bionik
a. Welches biologische Vorbild wurde beim Entwurf der Deckenkonstruktion des Alten Zoologiehörsal (Rundbau/Mathe-Hörsaal) herangezogen?
b. Nennen sie zwei Teilbereiche der Bionik
Knochenbälkchen im Oberschenkel von Säugern
22/23 auch 16/17 auch 15/16
Bionik
a) Welchen biologischen Zweck hat die Sitzstange bei der Blüte der Paradiesvogelblume?
b) Aus welchen Blütenteilen besteht die Sitzstange der Paradiesvogelblume?
Landebereich für Vögel die durch ihr Gewicht die Stange biegen, sodass diese sich öffnet und der Pollen an den Nektar trinkenden Vögeln hängen bleibt, an der nächsten Blüte befruchtet er dadurch die nächste Pflanze
7. Bionik
a. Welchen Zweck hat die Sitzstange bei der Paradiesvogelblume (1 P)
b. Aus welchen Blütenteilen besteht diese? (1,5 P)
c. Wie heißt die Verformung die sich ergibt, wenn ein Vogel sich daraufsetzt? (1,5 P)
d. Im Praktikum wurden 2 Modelle vorgestellt mit denen man diesen Mechanismus darstellen kann. Warum ist der Doppelflügel besser für die Demonstration geeignet? (1 P)
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