V2 Proteintrennung

• Zusammenhang Proteineigenschaften zu Prinzip der Trennmethode

• Zusammenhang der zellulären Umgebung des Proteins zu Reinigungsverfahren

• Einfluß der Proteintrennung auf Aktivität des Proteins

• Wichtigkeit der Erhalt der Proteinaktivität und der Proteinstruktur

• Grundlegendes Prinzip der behandelten Trennmethoden

• Verständnis der Unterschiede in der Trennkapazität der Methoden

• Menge

• Säure/Basen Eigenschaften

• Hydrophobizität

• Biologische Aktivität

• Stabilität

Funktion des Proteins ist gegeben durch drei-dimensionale Struktur. Diese kann während der Reinigung gestört werden, wodurch die biologische Aktivität reduziert oder zerstört wird. Das Protein wird denaturiert. Kleinere Proteine können oft renaturiert werden

Abbau durch freigesetzte Proteasen nach Extraktion von Proteinen oder Bildung von unlöslichen Aggregaten kann biologische Aktivität aufheben.

• Therapeutisches Protein?

• Kristallographie?

• Biochemischer Assay?

• Identifikation?

• Eigenschaften erhalten

• Hohe Reinheit

• Homogenisierung und Aufschluß

• Anreicherung

• Reinigungsschritte

• Anforderung an Homogenisierungsmedium

• Schutz der Zelle vor osmotischem Platzen (Gewebe)

• Schutz vor Proteasen

• Schutz der biologischen Aktivität

• Verhinderung von Aggregation

• möglichst wenig Zerstörung von Organellen

• Osmolytisch

• Enzymatisch

• Mechanisch

  • Scherkräfte beim Pipettieren

  • Wiederholtes Einfrieren und Auftauen

  • Zerreiben im Mörser

  • Messerhomogenisator

  • Vibrationszellmühlen

  • Ultraschall

  • Frenchpresse

Protease Inhibitoren

z.B Apropitin Leupeptin

• Membran-gebundene Proteine sind an hydrophobe Lipidschichten gebunden.

• Um diese in Lösung zu bringen und in Lösung zu halten sind oft Detergenzien erforderlich

• Detergenzien sind amphiphile Moleküle, die sowohl einen polaren als auch unpolaren Molekülteil enthalten

• Detergenzien bilden Micellen, bei denen hydrophile Gruppen nach außen und hydrophobe nach innen gerichtet sind.

• Die niedrigste Konzentration bei ein Detergenz Micellen bildet, ist die kritische micellare Konzentration (CMC)

• Hohe UV-Absorption kann bei chromatographischen Analysen stören.

• konkurrieren um Bindungsstellen in der Ionenaustauschchromatographie

• stark an reversed-phase Säulen und beeinflussen die Trennleistung.

• Die Entfernung eines Detergens vom Protein kann schwierig sein.

• können Peroxide enthalten.