VL 7 "Mikrobielle Diagnostik"

• Unter Taxonomie (Systematik) versteht man das Beschreiben und Ordnen der Lebewesen in einem hierarchischen System

• Dieses beginnt mit der umfassendsten Einheit und endet mit der kleinsten Einheit

• Die Taxonomie beschäftigt sich mit der Klassifizierung von Organismen.

  Basierend auf der für höhere Organismen entwickelten Systematik erfolgt auch für Mikroorganismen eine Gruppierung nach folgenden Kriterien:

  • Charakterisierung durch Ermittlung morphologischer, physiologischer, chemischer und molekularbiologischer Daten

  • Klassifizierung unter Verwendung theoretischer Verfahren

  • Zuteilung einer entsprechenden Namensbezeichnung

    durch binäre Nomenklatur.

• Bei der phylogenetischen Klassifikation handelt es sich um den Versuch, die Organismen auf der Grundlage evolutionärer Verwandtschaft zu ordnen und einen Stammbaum zu entwickeln.

• Hierzu werden vorwiegend Nukelotidsequenzdaten der

16S-rRNA (prokaryontische Ribosomen) und

18S-rRNA (eukaryontische Ribosomen) herangezogen.

• Prokaryonten 70 S (50 S und 30 S)

• Eukaryonten 80 S (60 S und 60S)

Gewisse Unterschiede in der Struktur sind Grund für selektive Wirkung mancher Bakterien, wenn diese präferntiell ein target an 70S-Ribosomen, nicht aber an 80S Ribosomen binden

Die Länge der Äste ist ein Maß für die Veränderungen der Gene der ribosomalen DNA, deren Sequenzvergleich diesem Stammbaum zugrunde liegt.

• Identifizierung von Krankheitserregern für eine optimale Therapie

• Lebensmittelanalytik

• Identifizierung von Lebensmittelverderbern /Krankheitserregern

• Wasseranalytik:

• Nachweis fäkaler Verunreinigung von Trink- und

  Badewasser

• so wenige Eigenschaften wie möglich und so viele wie notwendig zu bestimmen, um einer unbekannten Kultur ihren Platz in der Nomenklatur zuzuordnen und sie damit auch benennen zu können.

• AG Nachweis:

  • Kapsel

  • Zellwand

  • Flagellen

• Erregernachweis und Therapieempfehlung bei Vorliegen einer akuten Infektion

• Feststellung des Trägerstatus bei Personen ohne Infektion

  (z.B. betriebsärztliche Tätigkeiten, Personen mit Kontakt zu

  Infizierten, Überwachung immunsupprimierter Personen)

• Überprüfung von Immun- bzw. Impfstatus

• Retrospektive Klärung von Infektionen

  (epidemiologische Fragestellungen)

• Kenntnis des Erregers

  • Pathogenitätsfaktoren

  • Oberflächenstrukturen

  • Toxine

• obligat oder fakultativ pathogene Erreger

Merke: für Blut, Knochen, Gewebe kann auch

physiolog. Flora äthiopathogenetisch

bedeutend sein!

• Harnwegsinfektionen → Darmflora

• Peritonitis → Darmflora

• Aspirationspneumonie → Mundhöhlenflora

• Beatmungspneumonie → retrograde Besiedlung

mit Darmflora

• postoperative Wundinfektionen > Hautbesiedelung

• Translokation von Mikroorganismen aus dem Darmlumen

in die Blutbahn (bei Immunsuppression)

WANN? Zeitpunkt der Materialentnahme

WO? Entnahmestelle

WIE? Entnahmetechnik

WAS? Art und Menge

WOHIN? Transport zum Labor

Zeitnkt der Materialentnahme

- bei schweren Infektionskrankheiten immer

- vor Beginn einer Chemotherapie oder frühestens

3 Tage nach dem Absetzen

- Blutkulturen mehrfach und während des

Fieberanstieges

- Serumpaare für Titerverläufe

(Erkrankungsbeginn und 10 - 14 Tage später)

Entnahmestelle

- am Ort der Infektion bzw. der vermutlich höchsten

Erregerkonzentration

• Vermeidung sekundärer Kontaminationen

• Gewinnung mit sterilen Instrumenten und Gefäßen (Skalpelle, Pinzetten, Spritzen, Kanülen, Watteträger, Tupfer usw.)

• aseptische Punktionen primär steriler Körperregionen

  (Liquor, Blut, Blasenpunktion)

• geeignete Vorbereitung des Entnahmeweges bei Gewinnung via Regionen mit Standortflora (Mittelstrahlurin, BAL)

• Gewebe, Sekrete, Eiter und Punktate sind besser als Abstriche

• ausreichend Material zur Erhöhung der Nachweiswahrscheinlichkeit

• Einhaltung definierter Volumina (Blutkulturen: 8 – 10 ml Erw. / 1 – 3 ml Kinder)

• adäquate Probenanzahl

• Sicherung der äthiopathogenetischen Bedeutung von

  Keimen der physiolog. Flora durch Mehrfachnachweis

• bruch- und auslaufsicheres Verpackungsmaterial

• eindeutige Kennzeichnung des Materials

• sorgfältig ausgefüllter Untersuchungsauftrag

  (= juristisches Dokument !!!)

• ggf. Rücksprache mit Labor

• optimale Untersuchungsergebnisse nur bei kurzen Transport- und Lagerzeiten:

• zahlreiche Infektionserreger sterben schnell ab

  (Austrocknung, Kälte, Hitze, Milieuveränderung)

• Abbau von DNA, RNA durch Enzyme

• Bakterien der Normalflora überwuchern den infektionsverdächtigen Erreger > Infektionen werden übersehen oder fehldiagnostiziert

• Transportmedien halten eine Bakterienpopulation in gleichbleibender Zahl etwa 48 Stunden vermehrungsfähig

• Transportmedien dienen nicht der Vermehrung

1. Kulturtypische: z.B. Form und Farbe der Kolonien

2. Morphologische: z.B. Zellformen, Beweglichkeit

3. Physiologische: z.B. Vorzugstemperatur, Verhalten gegenüber O2

4. Biochemische: Nährstoffansprüche, Stoffwechselleistungen

5. Serologische: Identifizierung von Serotypen

6. Genetische z.B. PCR, Sequenzanalyse, Hybridisierung von DNA/RNA spezifischen Sonden

7. Neue/Alternative (Intact Cell) MALDI-TOF MS

z.B. Vorzugstemperatur, Verhalten gegenüber O2 , Nährstoffansprüche

> Selektive Anreicherung

• zum gezielten Nachweis pathogener Arten aus Materialien mit mikrobieller Flora

  > Selektivmedien = Spezialmedien, die das Wachstum unerwünschter Bakterien unterdrücken

• Selektivnährböden: entsprechend dem o. g. Prinzip werden bei festen Nährböden verschiedene Inhibitoren zugesetzt

• Anreicherungsmedien (Elektivmedien) durch Zugabe von Hemmstoffen, Veränderung des pH-Wertes oder der Kulturbedingungen

  > Durchsetzten ansonsten benachteiligter Arten (z.B. Selenit-Brühe (Anreicherung von Salmonellen aus Stuhlproben); Kälteanreicherung

  (Inkubation bei 4°C zur Anreicherung von Listerien); Mycoplasmen Nährlösung (enthält zur Unterdrückung anderer Bakterien Penicillin und/oder Thalliumazetat)

• Kochsalz-Mannit-Agar: hoher Kochsalzgehalt zur Anreicherung von Staphylokokken

• Columbia-CNA-Agar: Blutagar, der durch den Zusatz von Colistin und Naldixinsäure selektiv für grampositive Bakterien ist.

• Sabouraud-Agar mit Chloramphenicol: durch das saure Milieu und den Zusatz von Antibiotika wird das Wachstum von Bakterien unterdrückt und Pilze aus bakteriell stark verunreinigten Proben werden angezüchtet

• McConkey-Agar: hemmt das Schwärmen von Proteus-Stämmen; Kristallviolett unterdrückt das Wachstum von grampositiven Bakterien

• Löwenstein-Jensen und Stonebrink-Medium: Malachitgrün unterdrückt das Wachstum anderer grampositiver Bakterien zugunsten von Mykobakterien

• Martin-Lewis-Medium: enthält Wachstumsfaktoren, die das Wachstum pathogener Neisserien fördern und verschiedene Antibiotika, die das Wachstum der (Begleit-)Flora unterdrücken.

• Selektivnährbödem sind Böden mit hohem NaCL gehalt für z.B Isolierung pathogener Staphylokokken und Mikrokokken (halotolerant)

• Mannitol-Kochsalz-Phenolrot-Agar

  (Chapman-Agar)

  • Ein Mannitol-Salz-Agar, der mit Staphylococcus aureus (links) und Staphylococcus epidermidis (rechts) beimpft wurde. Beide Arten wachsen auf diesem Medium, aber das enthaltene Mannit wird nur von S. aureus zu sauren Zwischenprodukten abgebaut, was an der gelben Verfärbung des Nährbodens zu erkennen ist.

    (Differenzierungsmerkmal)

• Medium mit einem Indikator,

  normalerweise ein reaktiver

  Farbstoff, der anzeigt,

  ob eine bestimmte

  chemische Reaktion während des

  Wachstums abgelaufen ist

  Bsp. MacConkey Agar

  - Gallensalze und Kristallviolett hemmen

  weitgehend grampositive Bakterien

  - Lactose zusammen mit dem pH-Indikator

  Neutralrot - Nachweis des Lactoseabbaus

z. B. Nachweis galletoleranter gram- Bakterien (Enterobacteriacae)

in Lebensmitteln VRBD (Kristallviolett-Galle-Glucose-Agar)

(Crystal-violet neutral-red bile dextrose agar)

• Kristallviolett und Gallesalze hemmen weitgehend die Begleitflora. Der Abbau von Glucose unter Säurebildung wird durch Farbumschlag nach Rot und eventuell Ausfällung von Gallensäuren um die betreffenden Kolonien angezeigt.

• Da alle Enterobacteriaceae Glucose unter Säurebildung abbauen, sind sie komplett erfassbar.

• Der Nährboden ist jedoch nicht absolut spezifisch

  (mitwachsende Begleitkeime (z.B. Aeromonas))

• Durch Streptococcus pyogenes hervorgerufene β-Hämolyse auf Blut-Agar. Erkennbar ist die β-Hämolyse

  an dem hellen Hof um die Kolonien

  • Einteilung der Streptokokken nach ihrer Hämolyse Eigenschaft

  • B-Hämolyse ist eije komplette Hämolyse

• α-Hämolyse durch Streptococcus pneumoniae Erkennbar ist die α-Hämolyse an der Grünfärbung der auf Blut-Agar wachsen Kolonien

• γ-Hämolyse bei Enterococcus faecalis auf Blut-Agar

  Es sind keine hellen Höfe um die Kolonien vorhanden

  und auch keine sonstigen Veränderungen erkennbar.

Blutagar mit Antibiotika, Selektivnährböden für Gram+ Bakterien:

durch den Zusatz von Antibiotika werden gram- Bakterien und Hefen spezifisch

gehemmt und das Wachstum gram+ Bakterien gefördert

Columbia-CNA-Agar:

Columbia-Blutagar mit 5 % Schafblut, der durch den Zusatz von Colistin und Naldixinsäure selektiv für gram+ Bakterien ist.

1: Enterococcus faecalis, resistent gegen

Colistin und Naldixinsäure und Gram-positiv.

2: Enterobacter aerogenes, sensitiv gegen

die Antibiotika und Gram-negativ.

3: E. coli, sensitiv gegen die Antibiotika und

Gram-negativ.

4: Staphylococcus aureus, resistent gegen

Colistin und Naldixinsäure und Gram-positiv.

1. Beschriftung der Nährbouillonröhrchen

2. Material in Bouillon einimpfen

- entweder Tupfer in Bouillon ausschütteln

- oder Material mit Impföse oder Pipette in Bouillon überführen

1. Bouillon bebrüten

• wird verwendet wenn man wenig Bakterien verwendet

• obligat aerob → Kultivierung bei einem O2-Gehalt ≥ 2 %

• obligat anaerob → Kultivierung bei einem O2-Gehalt ≤ 2 %

• mikroaerophil → Kultivierung bei vermindertem O2-Gehalt

  und einem CO2-Gehalt von 5 – 10 %

• broncho-alveoläre Lavage (BAL)

• Urin

  • signifikante Bakteriurie 1 x 105 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml Urin

• Form, Farbe, Geruch, Konsistenz, Koloniegröße

• auffallend sind Pigmentierungen (z.B Pseudomonas aeruginosa)

• teilweise typische Kolonieformen (z.B. Gattung Bacillus)

• schwärmendes Wachstum auf der Agarplatte (z. B. Proteus vulgaris)

• schleimiges Aussehen der Kolonien (z.B. Gattung Klebsiella)

• Oxidase Test Nachweis der Cytochrom-c Oxidoreduktase

• Katalase Test

• Lactoseverwertung

• Oxidative/Fermentative Glucoseverwertung

• IMViC (Bunte Reihe)

• Urease

• Pigmente

• wird eingesetzt zur Differenzierung von Staphylokokken (positiv) und Streptokokken (negativ)

• Durchführung:

  auf Objektträger mit Impföse Bakterien verreiben + 1 Tropfen 3%-ige H2O2-

  Lösung darauf tropfen und beobachten (Achtung: H2O2 ist toxisch!)

• Ziehl-Neelsen-Färbung: Zellwand aller Mykobakterien (z. B. Mycobacterium tuberculosis) enthält einen hohen Anteil an Wachsen („säurefeste Bakterien“)

  > Anfärbung mit wasserlöslichen Farbstoffen (z. B. Gramfarbung) nicht möglich!

  > Erwärmung auf 100 °C > Wachsschicht kurzzeitig durchlässig für Farbstoffe, nach Erkalten auch durch Säuren nicht entfärbt

  > Differenzierung des Tuberkuloseerregers M. tuberculosis von anderen Mykobakterien gelingt nicht!

• Auraminfarbung: Mykobakterien oft in nur sehr geringer Anzahl vorhanden Ergänzend zur Ziehl-Neelsen-Färbung sensitivere Auraminfärbung

  > säurefeste Bakterien fluoreszieren (UV-Licht) Hilfe bei Auffinden von Mykobakterien im Präparat, ist jedoch nicht

  spezifisch für diese!!

• Neisser-Färbung:

  dient dem Nachweis von Corynebacterium diphtheriae

  Behandlung mit Lösung aus Methylenblau und Kristallviolett in Ethanol - Farbe wird abgegossen und das Präparat mit Chrysoidin- oder Bismarck-Braun-Lösung gefärbt Mikroskopisch: terminale,polyphosphathaltigen Polkörperchen

  schwarzbraun, die übrige Bakterienzelle gelbbraun

  Die Färbung ist nicht spezifisch für C. diphtheriae!

• Methylenblaufärbung eignet sich zur schnellen, orientierenden Beurteilung eines Präparats

• Malachitgrün bei Gegenfärbung mit Safranin (Sporenbildner)

• Immunfluoreszenzfärbung des erregerspezifischen Antigens

1. Drigalski-Conradi-Agar

2. Indol bzw. Oxidase Test

links

rechts

• zur orientierenden Differenzierung von Enterobacteriaceae durch Nachweis des Enzyms Tryptophanase:

• Durchführung:

  auf einem mit Indol-Reagenz getränkten Filterpapier wenige

  Bakterienkolonien mit der Öse verreiben und beobachten

• zur Differenzierung von Nicht-Fermentern (Pseudomonas spp. und verwandte Arten) durch Nachweis der Cytochromoxidase (Enzym der Atmungskette)

• Cytochrom-Oxidase oxidiert in Anwesenheit

  von O2 das Oxidase-Reagenz (N,N,N’,N’-

  Tetramethyl-1,4-Phenylendiamin) auf der

  Testkarte unter Bildung von Indophenol

  (blau)

• Durchführung:

  auf Testkarte mit Impföse Bakterien verreiben und beobachten

• IMViC-Test ist ein mikrobiologisches Verfahren, um Escherichia coli von

anderen Enterobacteriaceen

• I für den Indol-Test auf Indolbildung

• M für die Methylrot-Probe zum Nachweis von Säurebildung (rot zu gelb)

• V für den Voges (Butandiolgärung) -Proskauer-Test auf Acetoinbildung

• i ist ein Füllsel zum besseren Aussprechen

• C für den Test auf Citratverwertung

• Stoffwechsel-identifikation

• git es auch automatisiert

• api 10 (BUNTE REIHE) ist ein miniaturisiertes System zur Identifizierung von Enterobakterien und anderen Gram-negativen Stäbchen mit Hilfe von standardisierten biochemischen Reaktionen.

• Der api 10 Streifen besteht aus 10 Mikroröhrchen, in denen sich verschiedene Substrate in dehydratisierter Form befinden.

• Die Röhrchen werden mit der zu untersuchenden Bakteriensuspension beimpft, welche die Substrate löst.

• Die biochemischen Reaktionen können anhand von Farbumschlägen abgelesen werden, die entweder spontan während der Inkubation oder nach Zugabe von Reagenzien entstehen.

• zur Differenzierung von Staph. aureus und koagulase-negativen Staphylokokken

• Detektion über:

  • Clumping Factor gibt er ab

  • Protein A auf der Oberfläche

  • Kapselpolysaccahrid in der Kapsel

• Durchführung:

  auf einen Objektträger 1 Tropfen Latex-Reagenz geben und mit Impföse wenige Bakterienkolonien darin suspendieren und beobachten

• pder B-hämolysierenden Streptokokken, bei der die Lancefile-Gruppen-AG-C-Polysaccharig in der Zellwand

• Durchführung: 1 Tropfen Extraktionsreagenz I in Röhrchen geben, mit Öse 4 Kolonien auswählen und darin suspendieren, 1 Tropfen Extraktionsreagenz II hinzu und 10s mischen auf jedes Testfeld je 1 Tropfen Latex-Reagenz,

  daneben je 1 Tr. Probenextrakt, mit Stäbchen mischen, Testkarte routieren und beobachten

• Die Antigene in den Geißeln der gramnegativen Stäbchen

  werden zusammenfassend als H-Antigene bezeichnet

• besonders stark beweglichen Proteus-Bakterien breiten sich bei Verimpfung

  auf feste Agarplatten auf deren Oberfläche aus und rufen den Eindruck einer angehauchten Glasplatte hervor

  > sämtliche Geißelantigene heißen H-Antigene (von Hauch)

• Analog dazu leitet sich die Bezeichnung O-Antigen von dem Befund »ohne Hauch« ab.

• O-Antigene sind durch die äußeren Oligosaccharidketten

  (O-spezifische Seitenketten) des Lipopolysaccharids der

  Bakterienzellwand gramnegativer Bakterien determiniert, sie rufen die Bildung O-spezifischer Antikörper im Makroorganismus hervor

• H-Antigene in den Flagellen

• K-Antigene in der Kapsel

• Pili Antigene

  • Typ I-Pili (Fimbrien) = mannosesensitive

    Hämaglutinine (kann Erys binden), sind kürzer

    Typ III-Pili = mannoseresistente, klebsiellaartige

    Hämaglutinine