Was sind die häufigsten Probleme mit AK?
Cross-reactivity
Variability
Wrong-Apllication
Welche Arten von Immunglobinen gibt es?
Wie sind AK aufgebaut?
Wie könenn AK gespalten werden?
DTT
Paparin
Pepsin
Wie können schwere und leichte Ketten bei IGG aufgetrennt werden?
Alylation und Adification
Reduktion mit DTT oder Mercaptoethanol
Papain (spaltet die Disulfidbrücken der Hinge Region)
Pepsin (spaltet Fc Teil)
Welche Strukturen und Eigenschaften können AK haben?
Polyklonal
erkennt alle Oberflächen
verschiedene AK die das gleiceh AG binden
Monoklonal
AS identisch
entstehen aus einem Zellklon
Wie werden monoklonale AK hergestellt?
Maus wird immunisiert
Milzzellen werden geerntet
Milzzellen werden mit Myelomazellen fusioniert
Wachstum auf Selektivnährboden
Ernten
Wo werden AK in der Bioanalytik verwendet?
Western Blot
ELISA
FACS
Immunohistochemie
Phagen-Display
Affinitäts-anreicherung / - chromatographie
Immunpräzipitation
Was für Arten von Epitopen gibt es und wie werden sie detektiert?
Sequentielle oder kontinuierliche Epitope
Elisa, WB
sind hintereinanderliegende Epitope
Diskontinuierliche Epitope
verschiedene Bereiche der AS, kein Western Blot
verborgene Epitope
WB
im inneren der Struktur
durch Proteolyse entstandene Epitope
durch Enzymspaltung,, bilden neuen Terminhs
Was ist die Voraussetzung für die Immugenität von proteinen?
Andere Art Tier
Bestimmte Größe und Träger
Diversität und Kapazität
Strukturelle Eigenschaften, ladung
Zuhänglichkeiz
Denaturierung und Aggregation können immunogene Potenz erhöhen
Epitope besitzen hohen Antigendindex
Wie funktioniert die Epitopenkartierung eines monoklonalen AK?
Testen der Ab-Bindung von synthetischen Peptiden die systematisch die Proteinsequenz abdecken
Das kleinste Peptide mit hoher Bindungsstärke
entspricht dem Epitop im Antigen
Was sind reversible Lösungen von AG-AK-Komplexen in vitro
Saure Bedingungen
Alkalische Bedingungen
Chaotrope Ionen
Epitope
Erhöhte Temperaturen
Welche Arten von Immunpräzipation gibt es?
Immunpräzipation (“Ausfällen”)
Indirekte Immunpräzipation (Co-immunoprecipation)
Wie funktioniert die Quantitative Immunpräzipation?
Menge des präzipierten Antikörpers abhängig vom
Verhältnis Antigen zu Antikörper
Unterschiedliche Verhältnisse Antigen zu Antikörper
und Einfluss auf Löslichkeit
Welche Modelle der Antigensysteme gibt es?
Präzipierende System
Nicht-präzipierende System
Kombiniertes Präzipierendes System
Wie ist das Präzipierende System aufgebaut?
Präzipierendes System aus einem Antigen mit drei antigenen
Determinanten (Epitop 1-3) und den drei passenden Antikörpern
Wie ist das Nicht-Präzipierende System aufgebaut?
Nicht-präzipierendes System aus einem Antigen und einem Antikörper
Wie ist das kombinierte präzipierende System aufgebaut?
Präzipierendes System aus einem Antigen mit drei identischen Epitopen
und monoklonalen Antikörper identischer Spezifität
Besteht aus Digomeren
Welche Immunpräzipierenden Methoden gibt es?
Ringtest
Eindimensionale Immundiffusion nach Oudin unter Verwendung eines weitmaschigen 1% Agarose gel
Eindimensionale Doppeldiffusion nach Oakley/ Fulthorpe
indirekten Immunpräzipitation
Chromatin Immunpräzipitation ChIP
Wie funktioniert der Ringtest?
Wie funktioniert die Imundiffusion?
Wie funktioniert die indirekte Immunpräzippitation?
Protein A wird auf der Oberfläche von Gelkügelchen immobilisiert. Protein A bindet an die Fc-Region der Immunglobuline. Das Antigen bindet an das immobilisierte IGG.
Wie funktioniert die Chromatin Immunpräzipitation CHIP?
Was ist die Immunbindung?
Bindungstests zwischen Antigen und Antikörper dienen als Grundlage fürverschiedene Assay-Formate
Nach Immobilisierung eines der beiden Bindungspartner erfolgt
Was ist der kritische Punkt?
Unterscheidung zwischen spezifischen und nicht-spezifischen
Bindungen.
Wie wird die Immunbidnung detektiert?
Surface-Plasmon Resonance (SPR, Biacore) mit Markierung
Fluoreszenz (z.B. Markierung mit Fluorescein-Isothiocyanat (Albert Coons,1941)
Radioaktivität
Reduktionsvorgänge
Kolloidales Gold
Enzymatische Reaktionen durch gebundenes Enzym
Welche Arten von Antikörperbindungen gibt es?
a. direkte Methode
b.indirekte Methode
c.unmarkierte Methode
d.doppelt unmarkierte Methode
e. Biotin-Avidin Brücke
f. Amplifikator-markiertes Protein
g.direkte Protein A Gold Methode
h. indirekte Proteine A Gold Methode
Wie funktioniert der Avidin-Biotin Komplex?
Wo wird der Avidin-Biotin Komplex angewendet?
bei der Immobilisierung
Affinitätschromatographie
DNA/RNA Hybridisierung
Was ist das Western Blotting?
Übertragung von Proteinen auf Membran mit anschließender Bindung einesAntikörpers an membran-gebundenes Protein. Detektion der Antikörperbindung über Enzymreaktion oder Chemilumineszenz.
Welche Schritte gibt es beim Western Blotting?
Trennung der Proteine mit SDS PAGE
Transfer auf Membranen
Blockierung freier Membranoberflächen
Bindung eines protein-spezifischen Antikörpers
Detektion des Protein-Antikörper Komplexes
Welche Schritte beifnlussen den Western Blot?
Ausreichende Menge Protein an der Membran gebunden
Gute Bindung des AK
Das Protein muss aus dem
Gel auf die Membran
übertragen werden
Das gebundene Protein muss
für den Antikörper verfügbar
sein
Das Protein muss während
dem Transfer an die
Membran absorbieren
Antikörper hat hohe Affinität für
das Targetprotein
Welche Arten von Membrantransfer gibt es?
Passiver Membrantransfer durch Kapillarblotting
2x Aktiver Membrantransfer durch Elektroblotting
Wie funktioniert der passive Membrantransfer durch Kapillarblotting?
Mit Transferpuffer getränktes Filterpapier
Gel mit getrennten Proteinen
Membran, meist Nitrocellulose
Filterpapier
Wie funktioniert der Aktive Membrantransfer durch Elektroblotting?
Semi-dry Blotting
Gel und Membran werden zwischen Filterpapiere gelegt. Transfer bei konstantem Strom, z.B.
1 mA pro cm2 Blotfläche.
Transferpuffer meist Tris-Glycin pH 8,3 mit 20 % Methanol
Wie funktioniert der aktive Membrantransfer durch Elektroblotting?
Tank Blotting
Gel und Membran werden zwischen Filterpapiere gelegt. Konstante Spannung um 50 mV.
Tris-Glycin pH 8,3 mit 20 % Methanol oder auch CAPS Puffer pH10.
Welche zwei Arten von Transfer Membranen gibt es?
Nitrocellulose
PDVF (Polyvinylidene Fluorid)
Erste verwendete Membran, wurde
in der ursprünglichen Publikation
eingeführt.
Widerstandsfähig, möglich für
wiederholtes Nachtesten
Kein „prewetting“ nötig
Lange Lagerfähigkeit
Nicht sehr widerstandsfähig und
damit nicht gut für Nachtesten
geeignet.
Hohe Bindungskapazität
Niedrige Bindungskapazität
Muss mit Methanol vorbehandelt
werden
Visualisierung von Proteinen ohne
Anfärben
Was ist der Unterschied zwischen Zugabe von Methol zum Transferpuffer und SDS?
Zugabe von Methanol zum
Transferpuffer
SDS
Verhindert Anschwellen des Gels
Erhöht Mobilität der Proteine, die
sich damit schnell durch die
Membran bewegen
Verringert Mobilität der Proteine
und damit bessere Bindung an
Membran
Entfernt SDS vom Protein und
erhöht damit die Bindung an die
Was macht die Proengröße für einen Unterschied?
0,2 μm
0,45 μm
Üblich für Proteine <20 kDa
Geringere Oberfläche vermindert
Untergrund
Größere Oberfläche erhöht
Bindungs-kapazität für Proteine
Meist verwendet für Proteine >20 kDa
Bessere Bindung von Proteinen
mit geringer Häufigkeit
Wie können freie Membranoberflächen geblockt werden?
Blockierung der freien Membranoberfläche verhindert
nicht-spezifische Bindung des Antikörpers
Welche Reagenzien werden zum blocken freier Bindungsstellen genutzt?
Protein-basiert
Nicht-protein basiert
Milch, Serum (z.B.: FCS), gereinigtes Protein (z.B. BSA), etc.
Nicht-Protein-basierte Reagenzien
Vorteile: billig, leicht verfügbar
Nachteile: Proteine nicht stabil, selbst bei 4°C, damit Effektivität und Reproduzierbarkeit beeinflusst
• Antikörper können an Milchproteine binden
Polyvinylpyrrolidone
• Stabil bei Raumtemperatur
• Schnelle Blockierung
Was kann die Blockingreagenz für Effekte haben?
Blockingreagenz kann Proteinsignal abschwächen
Was sind Voraussetzungen für Erfolg beim western Blotting?
Spezifität
Konzentration
Antikörper muss das Antigen
spezifisch erkennen und darf an
keine anderen Proteine binden
Konzentration von Primär- und
Sekundär-antikörper beeinflusst die
Qualität des Western Blots
Gute Kontrollen sind notwendig
um Spezifität sicherzustellen
Zu viel Antikörper kann zu
Untergrund führen und die Spezifität
verringern
Wie können die mebrangebundenen Proteine beim Western Blotting detektiert werden?
direkt durch an Primär-antikörper-gebundenes Enzym
indirekt durch Verwendung seines Sekundärantikröper
Was ist häufig Grund für hohe Untergrundsignale?
Konzentration des Sekundärantikörpers
Welche Enzyme werden beim Western Blotting genutzt?
Meerrettich Peroxidase (HRP)
Hohe spezifische Aktivität, oft erste Wahl
Alkaline Phosphatase (AP)
We kann beim Western Blotting detektiert werden?
Chromogen (Farbreaktion) (5-500 pg)
Chemolumineszenz (1 -10pg)
Fluoreszenz (2-20 pg)
Welche Punkte sind wichtig bei der Optimierung eines Western Blots?
Wie läuft die enzymatische Detektion mit HRP ab?
Was ist das kritische an der Luminolemission?
Luminolemission nimmt mit der Zeit ab
Welchen Einfluss hat der pH Wert auf die Chemolumineszenz?
es gibt zu wenig und zu viel pH
Am intensivsten mit 8,4
Welchen Einfluss hat die Konzentration der Chemolumineszenz?
Optimum bei 1,2 mM
Wie wird Chemoluminezenz detektiert?
Wie funktioniert das Prinzip des Radioimmunoassay?
Kompetition des „kalten“ (nicht-radioaktiven) Antigen
mit dem markierten radioaktiven Antigen.
Messung der Radioaktivität in Abhängigkeit der Menge des
kalten Antigens.
Welchen Einfluss hat das GG von kalten um heißem Antigen?
Was ist die Alternative zum RIA?
Nephelometrie/turbidimetrie
Verhältnis von AG/AK
Messung nach Streuung
Welche Arten von Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)?
Indirekt
Direkt
Sandwich
Kompetitiv
Wie werden AK immobilisiert?
Über Avidin-Biotin Komplex
Über Protein A/G Bindung zu FcR Bindungsstelle
Kovalent
Wie funktioniert der Sandwich ELISA mit HRP?
Wie ist das Grundvorgehen beim ELISA?
Welchen Einfluss haben Kreuzreaktionen bei unspezifischer Bindung?
Was sind Ursachen für Kreuzreaktivität?
Wie funktioniert der kompetitive ELISA?
Wie funktionieren der Direkte und Sandwich ELISA?
Wie funktioniert die Detektion mit Elektrochemolumineszenz?
Elektrodenreaktionen regen Ruthenium-Komplexe (Ru2+-bipyridyl) zurEmission von Photonen an.
Oxidation an der Elektrode folgt Reduktion mit zweitem Reagenz zu einem angeregten Ru2+* Zustand, der über Lichtemission in Ru2+ übergeht
werden angeregt , geben Licht ab
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