V8 DNA Sequenzierung

1. Isolierung und Reinigung der Nucleinsäure

2. Klonierung oder PCR Amplifikation

3. DNA Aufreinigung für die Sequenzierungsreaktion

4. DNA Sequenzierung und Elektrophorese

5. Rekonstitution der ursprünglichen Sequenz-information

6. Fehlerkorrektur und Sequenzdatenanalyse

• Erzeugung einer Mischung von Oligonucleotiden mit 3`dideoxy-Nucleotid

• Analyse der Mischung aus Abbruchprodukten mittels Gelelektrophorese

Fluoreszenzfarbstoff verändert elektrophoretische Mobilität und führt zur

Verschiebung der Banden: Ausgleich durch Software.

• Vorteile:

  • Verunreinigungen (elf-priming) nicht sichtbar

  • unmarkierte Primer verwendet

  • unmarkierte Abbruchprdukte sichtbar

• Nachteile:

  • Höhrere Primerkosten

  • Vermeidung von Mehrfachinkoperation

  • Von Polymerasen schlechter eingebaut

Sequenzierreaktion wird mit vier Didesoxynucleotiden durchgeführt, von denen jedes eine Fluoreszenz-Markierung trägt, die bei einer anderen Wellenlänge fluoresziert

• Freisetzung von Pyrophosphat und Proton bei Kopplungsreaktion

• Zugabe von Pyrophosphatase zur Vermeidung der Rückreaktion

• schrittweiswr Abbau

• Ladder Sequencing

• Struktur von Desoxynucleotidanaloga in Dideoxysequenzierungsreaktionen

• Verwendung zur Vermeidung stark GC-haltiger Abschnitte durch Verhinderung der Bildung von Wasserstoffbrücken

• Erzeugung einer Serie von Teil- Oligonucleotiden

• Durch Synthese:Sanger

• Durch Spaltung: Maxam-Gilbert

• Freisetzung von Pyrophosphat und Proton bei Kopplungsreaktion

  Detektion des Pyrophosphats: Pyrosequenzierung

1. ATP Herstellung aus Adenosinphosphosulfat und Pyrophosphat

2. ATP treibt Luciferasereaktion an und bewirkt Lichtemission

   
   

Luciferase katalysierte Reaktion des Luciferins zum Oxyluciferin

Oxidation zum Oxyluciferin bewirkt Lichtemission mit λmax = 560 nm

1. Strangverlängerung durch Polymerase, Freisetzung von Pyrophosphat

2. ATP Herstellung aus Pyrophosphat durch Sulfurylase

3. Lucierfasereaktion (Emission)

4. Abbau der nicht verwendeten dNTPs

5. Wiederholung

1. Fragmentierung der DNA durch Zerstäubung unter Hochdruck und „Auffüllung“ von

überhängenden Enden. (300-800 base pairs)

2. Ligation von 2 Adaptermolekülen (je 44 bp) an Enden (B-Adapter mit Biotin)

3. Aufreinigung über Streptavidin beads, dann Bindung an capture beads. (pro bead nur

ein Einzelstrang-molekül)

4. Klonale Amplifikation in Wasser-Öl Emulsion (Emulsions PCR)

5. Aufreinigung durch Biotin-Streptavidin und Sequenzierung in Picotiter-platte (ein bead pro Well)

• hat längere leselängen

• schneller

• präziser für einzelne moleküle

• direkte RNA Sequenzierung

• Durch PCR können Fehler in der Sequenz eingeführt werden.

• PCR Fehler werden verursacht durch “Misincorporation” von Nucleotiden, durch Amplifikation von Artefakten (Abbruchprodukten) und durch differentielle Amplifikation

• Sequenzierfehler durch hohes Rauschen., durch unvollständigen Einbau von Nucleotiden oder unvollständige Entfernung von Schutzgruppen (Illumina).

• Erkennung von relativ seltenen genetischen Varianten durch DNA Sequenzierungsfehler und durch Fehler in der PCR sehr erschwert.

• In Proben von Tumorgeweben liegen Zellen mit unterschiedlichen somatischen Mutationen vor.

• Wichtige Mutationen liegen mit geringer Häufigkeit vor und werden bei der Amplifikation nicht

  ausreichend erfasst.

• Zudem können Fehler bei der Amplifikation auftreten.

1. Ligation der Mutation mit Barcodes

2. Amplifikation

3. Sequencing

4. Fehler werden ausgelesen (mismatches)

• DNA Fragment wird zunächst “zirkularisiert” durch zirkularisierende Ligase. Nicht-zirkuläre DNA wird

  durch Exonuclease entfernt. (step 1B)

• Amplifikation der zirkulären DNA (Phi29 DNA Polymerase) Fehlerrate 10-100fach niedriger.

• Amplifizierte Sequenz wird wiederholt abgelesen.

• PCR Fehler werden nach der Sequenzierung durch wiederholte Sequenzierung erkannt.

• Sequenzierungsfehler vor allem am Ende der abgelesenen Sequenz

• Bestimmte Sequenzmotive erhöhen Wahrscheinlichkeit für Fehler (z.B. GG oderwiederholte GGC Motive)

• Systematische Fehler in bestimmten genomischen Regionen

• Sequenzierfehler erschweren das Erkennen von single-nucleotide polymorphisms (SNP)

• Bioinformatics Algorithmen können (zum Teil) Fehlsequenzen erkennen

• Extraordinarily long reads:

  Depending upon starting library, half of the data are in reads >14,000 base pairs long with the longest reads over 40,000 base pairs.

• Extremely high accuracy:

  Perform de-novo assembly of genomes and detect variants with greater than 99,999% accuracy. Sequence individual molecules with 99% accuracy at greater than Sanger lengths.

• Exquisite sensitivity:

  Detect minor variants that are present at a frequency less than 0.1%.

• Leselänge eines DNA Fragments (read length)

• Durchsatz (through-put) (Sequenzierung pro h oder in einem Gerätelauf in Mega-oder Gigabasen)

• Probenbereitung / library generation

• Mit oder ohne Amplifikation

• Qualität der erhaltenen Sequenz (Fehlerrate)

• Mehrfache Sequenzabdeckung( (sequence coverage): Zahl der wiederholten Sequenzierung der gleichen Sequenz

• Kosten

Qualität (Fehlerrate) der erhaltenen Sequenz ist abhängig von Sequenziermethode

und Qualität der Daten.

Durch vergleichende Sequenzierungen von bekannten Sequenzen wurde ein Maß für

die “Qualität “ der Basenzuordnung bestimmt:

Für die Qualität der DNA Sequenzierung ist wichtig, wie oft die gleiche Sequenz

sequenziert wurde bzw. wie oft eine Base in einer sequenzierten Sequenz enthalten

war. Man spricht von “coverage” (Abdeckung).

Die durchschnittliche Coverage für ein Genom (oder einer Teilsequenz) kann berechnet

werden nach