Vorlesung 5 "Lipidanalytik"

• Energiespeicher und Wärmeisolatoren

• Strukturbildner und Schutzfunktion

• Lipide als Signaltransduktoren

• Lipidvitamine

• Abwehrfunktion (antibakterielle Polyketide)

• Lipide sind definiert über ihre Unlöslichkeit in Wasser (Hydrophobizität) und gute Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln (Hydrophilie).

• Klassifizierung von Lipiden erfolgt aufgrund ihrer Struktur oder funktionellen Kriterien.

• Strukturbasierte Klassifizierung basiert auf chemischen Grundbausteinen von Lipiden.

1. Fettsäuren

2. Glycerolipide

3. Glycerophospholipide

4. Sphingolipide

5. Sterole

6. Prenole

7. saccharolipide

8. Polyketide

Fettsäuren sind aliphatische Monocarbonsäuren mit zumeist unverzweigter Kohlenstoffkette mit 4-28 Kohlenstoffen.

Triglyceride sind dreifache Ester des dreiwertigen Alkohols Glycerin mit drei Fettsäuren.

Glycerophospholipide sind aufgebaut aus Glycerin, das mit zwei Fettsäuren an zwei der Hydroxylgruppen verestert ist. An eine der dritten, endständigen OH-Gruppen ist eine Phosphatgruppe gebunden. Diese Phosphatgruppe ist wiederum mit unterschiedlichen Alkoholen (X) verestert.

• Phosphatidylethanolamin - R:Ethanolamin

• Phosphatisylcholin (Lecithin) - R: Cholin

• Phosphatisäure - R: Wasserstoffatom

• Phosphatidylinositol - R: Inositol

• Phosphatidylserin - R: serin

• Diphosphatidylglycerin - R: Cardiolipin

• bestehen aus Sphingosin, einer Fettsäure sowie über einen Phosphatrest durch Esterbindungen mit gebundene Gruppen wie Serin, Ethanolamin oder Cholin oder – ohne Phosphatrest - Zuckerstrukturen.

• Sphingosin ist ein langkettiger, ungesättigter C18-Aminoalkohol. Es ist Grundbaustein der Sphingolipide, wobei die Aminogruppe von Sphingosin über eine Amidbindung eine Fettsäure bindet und dadurch das sogenannte Ceramid bildet.

• Ceramide: bestehend aus Sphingosin und einer Fettsäure

• Sphingomyeline: besteht aus Ceramid mit einer Phosphorylcholingruppe

• Glycosphingolipide (unterschieden in Cerebroside und Ganglioside)

zyklische Isoprenoide

wie z.B. Cholesterol. Grundstruktur ist Sterol.

• Edukte aus dem Mevalonsäureweg

• PC5-Vorläufern Isopentenyl-diphosphate und Dimethylallyl-diphosphate

• Saccharide als Rückgrat (statt an Glycerol in Glycerolipiden)

• Typische Saccharolipide sind Lipopolysaccharide (LPS) die in Bakterien vorkommen und als Endotoxine wirken.

• Polyketidweg synthetisiert

• große heterogene Gruppe mit verschiedenen chemischen Strukturen und pharmakologischen Eigenschaften.

• gilt Acetatregel, die besagt, dass die Polyketide aus C2 Bausteinen aufgebaut sind und sie sich formal aus Acetatbausteinen zusammensetzen lassen.

• Polyketidderivate

• Isoprenderivate

• Fettsäurederivate

• Diacylglycerine (DAG)

  sekundärer Botenstoff in GPCR Signaltransduktionswegen

• Phosphatidyl-inositol-phosphate (PIPs)

  einfach, zweifach oder dreifach phosphoryliert am Inositol (z.B. PIP2 und PIP3 im Insulinsignalweg).

• Ubichinon

  Transportmolekül in der Membran in der Elektronentransportkette

• Steroidhormone

• Eicosanoide (Derivate der C20- Arachidonsäure) sind wichtig

  Zell-Zell Kommunikation als Mediatoren und wirken in sehr geringen Konzentrationen (zwischen 10-8 und 10-10 mol pro Liter) auf benachbarte Zellen (parakrin) oder auf die produzierende Zelle selbst (autokrin).

1. Präparation und Reinigung der Lipide aus biologischem Material:

   Lipidextraktion und chromatographische Verfahren

   • TLC

   • SPE

   • Flüssigphasenextraktion

2. Lipidfragmentierung und Analyse der Fragmente. Enzymatische oder chemische Fragmentierung (alkalische oder saure Hydrolyse, Verwendung von Enzymen unterschiedlicher Spezifität).

3. Analyse des präparierten, intakten Lipids durch verschiedenste Methoden Elementaranalyse, UV- und IR-Spektroskopie, Massenspektrometrie und NMR Spektroskopie.

+Direkte Analyse des Lipids nach Extraktion aus Lipidgemisch

• Oft mechanischer Aufschluß von Geweben erforderlich

• Lipidspaltende Enzyme müssen deaktiviert werden durch Zugabe polarer Lösungsmitteln oder Arbeiten im Eisbad oder Kühlung in flüssigem Stickstoff

• Zur Vermeidung von Lipidperoxidation (z.B. von ungesättigten Fettsäuren)

  Arbeiten bei tiefen Temperaturen und unter Inertgas-Atmosphäre oft notwendig

• Extraktion nach Folch oder Bligh-Dyer

1. Homogenisierung in Chloroform/Methanol 2:1 (v/v) (ca. 20 ml of 1g Gewebe)

2. Abtrennung präzipierter Proteine und Nucleinsäuren

3. Waschen der organischen Phase mit Salzlösung (z.B.: 1 M NaCl)

   • Organische Phase enthält Neutrallipide, Phospholipide, Sphingolipide nahezu quantitativ

1. Modifizierung der Folch-Methode zur schnellen Extraktion: Homogenisierung des Gewebes mit Extraktion von 1 ml Gewebehomogenat mit 3,75 ml Chloroform/Methanol 2:1 (v/v) durch Vortexen (2 min).

2. Nach Inkubation (Eisbad) führt Zugabe von 1,25 ml Chloroform und 1,25 ml Wasser zur Phasentrennung.

   • Untere organische Phase enthält Lipide.

   • Keine quantitative Extraktion, jedoch schnell und geeignet für größere Gewebemengen.

1. Konditionierung (z.B. MeOH) und Equilibrierung (z.B. Wasser) der festen Phase

2. Probenzugabe mit Binden der Probe an die feste Phase

3. Waschschritte je nach Analyt

4. Elution des Analyts

Lipide binden mit hoher Affinität an Reversed-Phase Material (z.B. C18) und können damit aus größeren Volumina biologischer

Flüssigkeiten extrahiert werden. Trennung verschieden polarer

bzw. hydrophober Lipide durch Waschen und sequentielle Elution.

Lösungsmittelgemische zur sequentiellen Elution von Lipiden mit Amino-propyl Festphase

• chemische Größe zur Charakterisierung von organisch-

  technischen Stoffen bzw. Stoffgemischen, wie Harzen, Ölen, Fettsäuren.

• Mit ihr werden alle sauren Funktionen, die durch Kalilauge neutralisierbar sind, erfasst.

• Die Säurezahl gibt die Masse Kaliumhydroxid in mg an, die zur Neutralisation von 1 g der zu untersuchenden Probe erforderlich ist (DIN 53402, neueste Version DIN EN ISO 2114).

• Je frischer ein Fett ist, desto geringer ist auch die Säurezahl, da noch kaum freie Fettsäuren durch Oxidation entstanden sind.

• wird zur Charakterisierung von Fetten verwendet wird. Sie nimmt mit zunehmendem Anteil an ungesättigten Fettsäuren zu.

• Sie ist ein Maß für den Gehalt eines Fettes an ungesättigten Verbindungen (Doppelbindungen). Sie ist die Menge in Gramm Iod, die an 100 Gramm Fett addiert werden kann.

• Demnach kann man mit ihr den ungesättigten Charakter des Fettes, sowie den Aggregatzustand, bestimmen.

• Ein Maß für die in einem Gramm Fett vorkommenden gebundenen und freien Säuren.

• Sie gibt an, wieviel mg einer Lauge notwendig sind, um die in 1 g Fett enthaltenen freien Säuren zu neutralisieren und die vorhandenen Esterbindungen zu spalten. Je kleiner die mittlere molare Masse eines Fettes ist, desto größer ist die Verseifungszahl.

• Sie wird meist zusammen mit der Säurezahl bestimmt, die ein Maß für die freien Säuren in einem Fett ist. Aus der Differenz und der mittleren molaren Masse lässt sich die mittlere Kettenlänge der vorhandenen Fettsäuren

  berechnen.

• Spezifische Phospholipases spalten bestimme Bindungen und erlauben so die Position einzelner Fettsäuren bzw. am Phosphat gebundene Alkohole zu bestimmen.

Verwendung Adsorptionschromatographie (Kieselgel (Silicagel)) für neutrale Lipide und Ionenpaarchromatographie für geladene Lipide durch Bildung eines Lipid-Ionenpaar Komplexes.

Retention abhängig von Lösungsmitteln und pH-Wert der mobilen Phase.

• Dünnschichtchromatographie (hochauflösend)

• Säulenchromatographie (Normal-Phase oder Reversed-Phase)

Für verdampfbare Lipide mit Temperaturen bis ca. 350°C

• Robuste und einfache Methode, kommerziell verfügbare TLC Platten

• Keine Memory-Effekte wie bei Säulenchromatographie

• Stationäre Phase Kieselgur, Silicagel oder Aluminiumoxid

• Partikelgrößen von 10-50 m für TLC und ca. 5 m mit enger Größenverteilung für High Performance TLC (HPTLC)

• Zusatz von AgNO3 zur Trennung von ungesättigten Fettsäure

• Zusatz von Borsäure(H3BO3) zur besseren Trennung von DAG Isomeren und von Phospholipiden (Komplexbildung mit vicinalen Hydroxylgruppen und Säuregruppen)

• Unspezifisch, nicht zerstörend: Detektion durch Farbstoffbindung

  (z.B. 2,7-Dichlorofluorescein oder Rhodamine 6G

• Unspezifisch, zerstörend: Carbonisierung mit 50% schwefliger Säure in Methanol oder Wasser

• Verwendung von Fließmitteln (mobiler Phase) unterschiedlicher Elutionskraft

• Konsekutive Trennung mit Fließmitteln mit nach und nach

  absteigender Elutionskraft

• Bessere Auflösung bestimmter Substanzen

• Zweidimensionale TLC: nach erster Trennung Drehung der Platte um 90°und nach Verdampfung des ersten Lösungsmittels Trennung mit zweitem Fließmittel orthogonal zur ersten Trennrichtung.

• Verwendung von Säulen aus modifizierten und nicht-modifizierten Kieselgelen mit funktionellen Gruppen wie cyanopropyl, diol, Silberionen (Normalphasen) sowie C18, C8, Phenyl (Reversed Phase) und Diethyl-aminoethyl (DEAE)-Cellulose (Ionenaustausch)

• Unpolare Lösungsmittel wie Hexan/Isopropanol oder

  Chloroform/Methanol Mischungen.

• In Ionenpaarchromatographie Zugabe von Gegenionen wie

  Triethylamin, Cholinchlorid

• Detektion von Lipiden mit aromatischen Systemen oder konjugierten Doppelbindungen durch UV-Detektion

• Vor- oder Nachsäulen Derivatisierung notwendig für andere Lipide

• Lysophosphatidsäure (LPA) – ein Phospholipidderivat mit Funktion als Signalmolekül

• Synthese und biologische Funktion

• Detektionsmethoden für LPA

1. ester freisetzen

2. Fettsäure freisetzen

• Eicosanoide sind Lipidhormone und werden aus Arachidonsäure synthetisiert.

  Enzymatische Zwischenprodukte wie Prostaglandin H2 und Leukotrien A4 werden in kaskaden-artigen Abläufen in zahlreiche, zum Teil strukturell sehr ähnliche carboxyl-haltige Substanzen umgewandelt. Neben enzymatischen

  Reaktionen werden Eicosanoide auch nicht-enzymatisch zu iso-Eicosanoiden oxidiert.

• Eicosanoide sind wichtig in Zell-Zell Kommunikation als Mediatoren und wirken in sehr geringen Konzentrationen (zwischen 10-8 und 10-10 mol pro Liter) auf benachbarte Zellen (parakrin) oder auf die produzierende Zelle

  selbst (autokrin).

• Eicosanoide spielen eine Rolle in vielen pathophysiologischen Prozessen (z.B. Entzündung, Allergie, Thrombose) sowie der Regulation der Nierenfunktion, der Aggregation von Blutplättchen, der Lungenfunktion (Bronchokonstriktion und –dilatation)

• Synthese von Prostaglandinen nach Freisetzung von Arachidonsäure aus Phospholipidmembranen durch Phospholipase A2

• Metabolisierung der Arachidonsäure durch Prostaglandin Synthasen G und H (genannt Cyclooxygenasen; COX1 und COX2)

• Cyclooxygenasen sind bi-funktionelle Enzyme, die

  sowohl Cyclooxygenase als als auch Peroxidase

  Aktivität aufweisen.

• wird von beiden COX Isoformen COX-1 und COX2 synthetisiert. PGH2 is das Substrat für eine Serie von spezifischen Isomerasen und Synthasen. Diese

  produzieren PGE2, PGI2, PGD2, PGF2α and TXA2.

• Aktivität von COX-1 koppelt bevorzugt mit Thromboxan-Synthase (TXS), Prostaglandin F synthase und der cytosolischen Prostaglandin E synthase (cPGES).

• Aktivität von COX-2 koppelt bevorzugt mit Prostaglandin-I-synthase (PGIS) und der microsomalen (m) Prostaglandin-E-Synthase (mPGES), die beide oft durch Cytokine und

  Tumor-promoters mit COX2 coinduziert werden.

• Das Profil von Prostaglandin (auch Prostanoide genannt) ist bestimmt durch die differentielle Expression der beteiligten Enzyme innerhalb der Zellen am Ort der

  Entzündung.

• Beispiel:

  • Mastzellen generieren bevorzugt PGD2, während Makrophagen PGE2 and TXA2 produzieren.

  • Veränderungen im Profil der Prostaglandin Synthese erfolgt bei zellulärer Aktivierung.

  • Ruhende Makrophagen produzieren mehr TXA2 als PGE2, dieses Verhältnis wechselt zu erhöhtem PGE2 nach Aktivierung durch bakterielles Lipopolysaccharide (LPS).

EP1 (E Prostanoid Rezeptor 1)

EP2, EP3, und EP4 (Subtypen

PGE Rezeptor

PGD Rezeptor (DP1)

PGF Rezeptor (FP)

PGI Rezeptor (IP)

TX Rezeptor (TP)

• Biologischer Assay: Wirkung auf Organpräparationen, zelluläre Assays

• Klassische Chromatographie: Dünnschichtchromatographie

  Gaschromatographie (nach Derivatisierung)

  Flüssigkeitschromatographie (HPLC, reversed-phase und normal-phase)

• Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays

  • Vorreinigung mit HPLC oder Extraktionsverfahren, da Spezifität der Antikörper nicht immer ausreichend ist.

• Massenspektrometrie (in Kopplung mit GC oder HPLC)

• Eicosanoide und Iso-eicosanoide können ex-vivo als Artefakt gebildet werden, z.B. bei der Blutabnahme

  Artefakt Bildung kann die in vivo Konzentration mehrfach übertreffen.

  
  

GC-MS/MS Analysis of PGE2 erfordert eine Derivatisierung in drei Schritten:

1. Durch Pentafluorobenzylbromid (PFB-Br) Bildung des Pentafluorobenzyl (PFB)-Esters von PGE2.

2. Durch Methoxyamine (MOX) Hydrochlorid Umwandlung der Ketogruppe.

3. Trimethyl-Silyl-Etherbildung der zwei Hydroxylgruppen mit N,O-bis-(trimethylsilyl)- trifluoroacetamid (BSTFA).

• Electrospray Ionization im Negativ-Modus

  (ESI-) des nativen PGE2 Carboxylats

  m/z) 351.

• Collision-induced dissociation (CID) des

  Precursors ergibt verschiedene

  Produktionen.

• Das Anion m/z 271 [M − 2H2O−CO2) − wird

  oft zur quantitativen Analyse von PGE2 im

  Selected-Reaction Monitoring (SRM)

  Modus verwendet.

• Übergang m/z 351 → m/z 271

• Negative-Ion-Chemical-Ionisation (NICI) des

  derivatisierten PGE2 erzeugt das intensivste

  Anion bei m/z 524 [M − PFB]−.

• Collision-induced-dissociation (CID) dieses

  Precursors ergibt verschiedene Produktionen.

• Das Anion m/z 268 [M − PFB − 2 × TMSOH − CH3OH–CO2]

  − wird oft zur quantitativen GC-MS/MS Analyse von

  PGE2 im SRM Mode verwendet.

• Zugabe von bekannter Menge eines synthetisch hergestellten Standards mit bestimmter Anzahl an stabilen Isotopen, z.B: Deuterium (2H = D, 13C, 15N) zur

  Probe vor Extraktion

• Voraussetzung: Standard verhält sich chromatographisch und in der Massenspektrometrie identisch zu Analyt, stabile Isotope im Fragmention.

• Verluste bei Extraktion, Probenbereitung, Chromatographie beeinflussen Menge des internen Standard in gleichem Maß wie den Analyt