Aufschlussmethoden abhängig von
Art des Probenmaterials (Pflanzen, tierisches Gewebe, Insekten)
zu isolierender Probenmenge
Probenzahl (paralleler Aufschluss mehrerer Proben)
Aufschlussmethoden
Ultraschall
Osmotische Verfahren
Freeze-Thaw Verfahren
Mörser und Pistill
Kugelmühlen (Kugeln aus Zirkonia oder Edelstahl
Blender (schnell rotierende Messer, 1ml - 100L)
DNA Isolierung Herausforderungen
DNA sehr langes homogenes Molekühl, teilweise sehr dicht gepackt
Fragmentierung sehr leicht möglich
Trennung von anderen zellulären Komponenten (RNA, Proteine, Lipide,…)
DNasen/RNasen
bauen DNA (RNA) ab
DNasen einfacher zu inaktivieren (Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen ➡️ + EDTA)
Autoklavierung + “Backen” (> 8h bei 180 Grad)
Behandlung mit Biethylpyrocarbonat (DEPC)
Schaffung eines seperaten Teils im Labor für DNA/RNA-Arbeiten
DNA Isolierung - Grundlegende Schritte
Lyse (Aufbrechen der Zelle/des Zellkerns) & Homogenisierung (Detergenz)
Denaturierung von Proteinen und Nukleoprotein-Komplexen (Protease/Denaturierungsagenz)
Inaktivierung von endogenen Nukleasen (sog. DNasen)
Isolierung und Aufreinigung der DNA (Abtrennung von Proteinen, RNAs,…)
Denaturierungssubstanzen
Ionische Detergentien (SDS)
brechen hydrophobe Bindungen und Wasserstoffbrücken auf
Chaotrope Reagenzien
Harnstoff, Guanidinhydrochlorid, Phenol
entfernen Hydrathüllen von Biomolekülen
positiv geladene Salze können Salzbrücken bilden
Reduzierende Agenzien
zum Aufbrechen von Disulfidbindungen
Salze
interagieren mit geladenen Gruppen und erhöhen die Proteinlöslichkeit
Wärme
bricht Wasserstoffbrückenbindungen und unpolare Bindungen auf
Protease (Proteinase K) und RNase
Möglichkeiten zur Abtrennung von Proteinen und Zellrückständen (DNA Isolierung)
Organische Extraktion
Aussalzen / Fällung
Selektive Bindung von DNA an Säulchen,…
DNA ist polar (negativ geladen durch Phosphatrückgrat) ➡️ unlöslich in organischen LM
Traditionell: Phenol / Chloroform Extraktion
DNA ➡️ wässrigen Phase (oben)
Denaturierte Proteine ➡️ organische Phase (unten)
1:1 Phenol:Chloroform oder 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl-Alkohol
Phenol
denaturiert Proteine
➡️ Bildung einer festen Interphase zwischen organischer und wässriger Phase
Chloroform
erhöht die Dichte der organischen Phase
Isoamyl-Alkohol
verhindert Schaumbildung
Ethanolfällung
am häufigsten verwendet
70%-EtOH (1 vol DNA Lösung + 2 vol 96% (v/v) Ethanol)
Ethanol entzieht der DNA die Hydrathülle, negativ geladene Phosphatgruppen biilden zB. mit Na+ ein Salz
DNA wird präzipitiert ➡️ Reinigungsschritt
unerwünschte Stoffe werden entfernt
DNA/RNA wird konzentriert
Überführung in neuen Puffer möglich
Isopropanolfällung
Finale Konzentration 40-50% (v/v)
häufig eiskalt, 30 min bei -20 Grad
Zentrifugation, waschen mit 70% Ethanol
Zucker und NaCl werden mitgefällt
nicht ganz so effizient
PEG (Polyethylenglykol) Fällung
lässt sich nur schwer wieder entfernen
stört viele Enzymreaktionen
Binden der DNA an Hilfsmittel
Anionenaustauscher (Dextran, Cellulose mit positiv geladenen Gruppen)
Stärke der Bindung für DNA, RNA und Proteine ist unterschiedlich und vom pH und der Ionenstärke des Puffers abhängig
Silikat-Säulchen
binden in der Gegenwart hoher Konzentrationen chaotroper Salze spezifisch DNA, die nach dem Waschen problemlos mit H2O oder TE-Puffer elutiert und direkt weiterverwendet werden kann
+ Schnell, einfach, keine organischen LM, automatisierbar
- DNA Fragmentierung
Isolation von hochmolekularer DNA
stark sensibel gegenüber Scherkräften
Entstehen beim Vortexen, wiederholten Auf- und Abpipettieren,…
meist:
CTAB-Fällung
Zugabe von EtOH im Überschuss
DNA fällt aus und kann auf einem Glasstäbchen aufgerollt werden
vorsichtig trocknen, lösen in H2O für mehrere Tage bei 4 Grad
Gängige RNA Methoden
Isolation der Gesamten RNA
Anreicherung der polyA-RNA
cDNA Synthese
Einsatz in Microaarays
Erstellung einer cDNA Bank
PCR, RACE
RNA Isolierung
Ähnliche Prinzipien wie bei der DNA Isolierung
ABER: hohe Sensitivität gegenüber RNasen
Handschuhe
eigener Laborbereich
eigene Reagenzien (RNase frei, nur für diesen Zweck)
Autoklavieren von Gefäßen, dann “backen”
eventuell Verwendung von DEPC vor dem Autoklavieren ➡️ Inaktivierung der RNasen, zerfällt in H2O und EtOH
Tipps zur Erzielung hoher Ausbeuten
möglichst frische Proben
möglichst schnelle Extraktion
DNA-Modifizierungen (unerwünscht) werden durch hohe DNA Konzentrationen gehemmt
Lagerung der DNA:
aufgereinigte dsDNA bei 4 Grad in H2O oder TE Puffer
erst bei Lagerung > 1 Woche ➡️ -20 Grad
Quantifizerung von Nukleinsäuren
zur Bestimmung der Menge, aber auch der Qualität (Reinheit)
Methoden unterscheiden sich in:
Arbeitsaufwand
Kosten
Genauigkeit
Photometrische Methoden
Aromatische Strukturen absoribieren Licht bei bestimmter Wellenlänge
Basen der Nukleinsäuren bei 260nm
AS mit aromatischen Seitenketten bei 280nm
Spektrophometer
unspezifisch über weiten Wellenlängenbereich (UV-Bereich notwendig)
spezifisch für DNA / RNA / Proteine
Spektophometer vs. Nanodrop
Unterschied v.a. in der notwendigen Probenmenge
Klassischer Spektrophometer (50ul - 1ml)
Nanodrop (0.5 - 5ul)
Verbrauchsmaterial
Quarz-Küvette (Spektrophometer)
keines außer Pipettenspitze
Konzentrationsbestimmung
aus der optischen Dichte (Absorption) bei 260nm (OD 260)
Andere Methoden zur Quantifizierung
Agarosegel
Fluorometrische Bestimmung (Hoechst 33258)
DNA-Agarosegel
0.5 - 2 %-ige Agarosegele für DNA-Fragmente zwischen 300 und 5000 Basen
große DNA-Fragmente durchlaufen Agarosegele langsamer als kleine
Färbung der DNA
Ethidiumbromid
SYBR Green I, SYBR Green II, OliGreen oder PicoGreen (höhere Empfindlichkeit, aber teuer)
Größenstandards (DNA-Leiter)
Quantifizierung “semiquantitativ” über entsprechende Software
RNA-Agarosegel
RNA neigt zur Uasbildung von Sekundärstrukturen (Formaldehyd oder DMSO und Glyoxal)
RNA-Größenmarker
gesamt RNA besteht zu 80% aus rRNA
Eukaryonten 18S, 28S rRNA
mRNA unterschiedlich lang ➡️ Schmier
Störstoffe (Argarosegel)
Ethanol (Banden ziehen Schweife hinter sich)
Natriumchlorid (Banden nach oben gebogen)
Ammoniumacetat (Größenverschiebung, gebogene Banden)
CTAB (keine distinkten Banden)
Bioanalyzer
RNA Proben QC vor Microarray oder qPCR-Experimenten
DNA-Analyse vor PCR/mPCR- und RT-PCR-Produkten
Proteinexpressionsanalyse
Proteinreinheit während der Aufreinigung
Zellbasierende Analyse in Gen-Silencing oder Apoptose
Die Probe bewegt sich vom Probengefäß durch die Mikrokanäle
Die Probe wird in den Trennkanal eingespritzt
Die Probenkomponenten werden elektrophoretisch getrennt
Die Komponenten werden durch eingelagerten Fluoreszenzsfarbstoff detektiert und in gelartige Bilder (Banden) und Elektropherogramme (Peaks) übersetzt
Polymerasekettenreaktion (PCR)
stellt eine zentrale Drehscheibe bei molekularbiologischen Arbeiten dar
Prinzip der PCR
Denaturierung
Trennung der doppelsträngigen Ausgangs-DNA (Template-DNA)
Anlagerung (Annealing)
kurze DNA-Stücke (Primer, Sense-Antisense) lagern sich an komplementäre Sequenzen der Ausgangs-DNA an
Elongation (Extension)
thermostabile DNA-Polymerase baut die vorhandenen dNTPs komplementär zur Ausgangs-DNA beginnend bei den Primern ein (72 Grad)
Thermostabile DNA-Polymerasen
notwendig, damit man nicht nach jedem Denaturierungsschritt die Polymerase neu zugeben muss (Nobelpreis für K. Mullis)
Saiki et al. Thermus aquaticus (thermophiles grampositives Bakterium, heiße Quellen) ➡️ Taq-Polymerase
Vielzahl an Polymerasen
Proofreading Polymerase (mit Exonnuclease Aktivität)
Phusion (fusioniert mit dsDNA Bindedomäne ➡️ sehr lange Amplifikate und hohe Synthesegeschwindigkeit)
Puffer
üblicherweise vom Hersteller der Polymerase mitgeliefert
Tris-HCl
MgCl2, KCl
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Primer (DNA-Stücke)
typischerweise zwischen 15 und 30 Basen lang (- 150 Basen)
selbst designed
kommerziell erhältlich
Annealing Temperatur (3 - 5 Grad unter der Schmelztemperatur, ergibt sich aus Basensequenz und Länge des Primers)
PCR Geräte
Theromcycler
zyklisch arbeitende Thermoelemente
Gradientencycler
Temperaturbereich (z.B. wenn die genaue Annealingtemperatur nicht bekannt ist)
Speedcycler
schnellere Heizraten (10Grad/s statt 2Grad/s)
Gradienten PCR
mehrere gleiche PCR Ansätze
Annealing Temperatur für jede Probe unterschiedlich
Temperaturgradient
Nested PCR
wenn unspezifische Amplifakte auftreten
bei niedriger Effizienz der Amplifikation
Erste PCR wie Standard PCR
1/10 bis 1/100 der des ersteb PCR Ansatzes für 2.PCR mit neuen Primern, die innerhalb des amplifizierten DNA-Bereiches liegen
Multiplex PCR
verschiedene Bereiche der Ausgangs-DNA durch unterschiedliche Primerpaare amplifiziert
Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR)
2 Reaktionen, die nacheinander im gleichen Reaktionsgefäß stattfinden
Reverse Transkription (Reverse Transkriptase wandelt RNA in cDNA (complementary DNA) um
PCR: Amplifikation der cDNA
Quantitative PCR (qPCR)
Thermocycler + Fluoreszenzphotometer
Messung der Menge der gebildeten DNA schon während Amplifikation in Echtzeit am Ende jedes Zyklus (real time PCR)
bei herkömmlicher PCR nur am Ende der Gesamtreaktion (Endpunkt-PCR)
Kombination von RT und qPCR (RT-qPCR) erlaubt die Quantifizierung von mRNA
Fluoreszenzfarbstoffe
SYBR Green = unspezifisch
TagMan = spezifisch
Anwendung der PCR
Analyse und Klonierung von DNA Fragmenten
Molekulare Diagnostik
Identifizierung von Bakterien, Parasiten,…
Erkennung von Mutationen/Polymorphismen
Forensiche Medizin
Vaterschaftstest
Lebensmittel Analytik
Nachweis von genetisch veränderten Organismen
DNA Sequenzierung
Sequenzierung nach Sager (Didesoxy-Methode)
Denaturierung der DNA
Sequenzprimer bindet an DNA
dNTP (ein Teil davon fluoreszenzmarkiert ohne OH-Gruppe am 3´ Ende) werden eingebaut
Auftrennung nach Größe
Weitere Methoden
Identifizierung einer bestimmten Nukleinsäure aus einem Gemisch an Nukleinsäuren
Southern Blot (DNA)
Northern Blot (RNA)
Herstellung einer Sonde
Hybridisierung
Markiertes DNA Molekül, das an eine komplementäre Sequenz binden und diese sichtbar machen kann
30 - 40 Basen bis zu 500 Basen
Markierung
Radioaktiv (32P)
Indirekte Markierung (Molekül wird eingebaut, das später einem Antikörper nachgewiesen werden kann; Biotin, Fluorescein, Digoxygenin)
Fluorophore (Cy3, Cy5)
Absichtliche Sequenz-spezifische Zusammenlagerung zwischen 2 komplementären Nukleinsäure-Strängen
in vitro
einer der Partner ist auf einer festen Oberfläche immobilisiert
Anlagerung der NS
Fixierung an der Trägeroberfläche (ca. 2h bei 80 Grad, UV-Crosslinking)
Blocken der freien Oberflächen (Absättiigung mit fremder DNA)
Eigentliche Hybridisierung der Sonde (42 Grad über mehrere Stunden)
Abwaschen der überschüssigen Sonde
Detektion
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