Proteinaufreinigung
Ausgangsmaterial
Entfernen von Gewebe- und Zelltrümmern
Homogensiation
Filration
Zentrifugation
Rohextrakt
Entfernen von anderen Zellbestandteilen
Fällung der Proteine
Aufnehmen in neuem Puffer
Dialyse
Konzentrierung
Proteinextrakt
Chromotographie
Entfernen von anderen Proteinen
Ionenaustauscher
Hydrophobe Interaktion
Affinitätschromatographie
Gelfiltration
Quantifizierung von Proteinen
Fragen bei der Aufreinigung von Proteinen
Ausgangsmaterial?
Welche Menge des Protein wird benötigt?
Wie rein muss das gesuchte Protein sein?
Muss das Protein noch biologisch aktiv sein?
Vorerfahrungen (eigenes Labor, Literatur)?
Aufschlussverfahren
Mechanische AV
Nicht mechanische AV
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen (tierischen Gewebekultur)
Hypotoner Schock (Erythrozyten und Retikulozyten)
Autolyse (Hefezellen)
Enzymatische Lyse (Hefezellen, gram-positive und negative Bakterien)
Proteasen und Phenoloxidasen
bauen Protein ab (Hydrolyse der Peptidbindungen)
Endopeptidasen (Trypsin ➡️ Arg, Lys, Chymotrypsin ➡️ Trp, Tyr, Phe, Pepsin,…)
Exopeptidasen (nicht spezifisch, bauen Protein vom Ende her ab)
äußerst stabil
normale Funktion: Abwehr von Pathogenen
in unterschiedlichen Mengen im Ausgangsmaterial vorhanden
Proteaseinhibitoren
Phenylmethylsulfonylflurorid (PMSF)
Leupeptin-Hemisulfat
Pepstatin A
Phenanthrolin
Benzamidin HCl
Aprotinin
Trypsin Inhibitpr
Extraktion aus Pflanzen / Pilzen
bei Isolation von Proteinen aus Pflanzen oder Pilzen
enthalten Polyphenole (Quercentin, Kaffeinsäure,…)
Polyphenol-Protein-Aggregate ➡️ unlöslich, fallen aus
Oxidation durch Polyphenoloxidasen, Peroxidasen,…
Zusatz von synthetischen Polymeren (PVPP, PVP)
Zusatz von Oxidationshemmern (Diethyldithiocarbamat (DIECA), Dithiothreitol (DTT),…)
Homogenisationspuffer
möglichst physiologische Umgebung (pH, Salzgehalt,…)
Lagerbar, preiswert, keinen Einfluss auf nachfolgende Analyse (Phosphatpuffer nicht geeignet für ATP-abh. Enzyme)
Tris-HCl
Phosphatpuffer
Boratpuffer
Zwitterionische Pufferlösungen
Weiterverarbeitung
abtrennen von Zell- und Gewebetrümmern (Filtern, Zentrifugation) ➡️ Rohextrakt
Fraktionierung
Entfernung löslicher Zellbestandteile (KH, Nukleinsäuren,…)
Fraktionierung des Proteingemisches
reversible oder irreversible Proteinfällung (Abtrennung unerwünschter Substanzen, Konzentrierung, Umpuffern)
Ammoniumsulfat (Verlust der Hydrathülle)
Polyethylenglykol
Butanol, Aceton
Trichloressigsäure
Saltung out (hohe Konzentration an Salzen)
Salting in (destilliertes Wasser)
Diffundierung über eine semi-permeable Membran
Niedermolekulare Teilchen (Salze,…) können diffundieren, große (Proteine) nicht ➡️ Pufferaustausch
einstellen eines Gleichgewichts (mehrere Stunden bei 4 Grad)
Ultrafiltration
Ultrafiltrationszelle
effizient, schnell
durch Druck wird eine Flüssigkeit über eine semipermeable Membran gepresst
Chromatographische Auftrennung
Auftrennung eines Gemisches durch wechselwirkung eines Stoffes in der mobilen Phase mit einer stationären Phase
Flüssigkeitschromatographie (WW mit Säule)
Ionenaustausch-Chromatographie (Proteinladung bestimmt wie lange das Protein interagiert)
Affinitätschromatographie (sehr spezifische Interaktionen, zB: Enzym-Ligand)
Gelfiltration (poröse Matrix, große Mol wandern schnell durch, kleine verfangen sich in der Matrix)
Detektion der Proteine (Chromatogramm)
UV-Detektor
Fluoreszenzdetektor
Quantifizierung
Absorption bei 280nm ➡️ ungenau
Farbstoffe, die mit Protein reagieren
Proteinbestimmung nach Bradford
Proteinbestimmung nach Lowry
BCA-Test (Bicinchoninsäure)
Bradford
Bindung von Coomassie Brilliant Blue an Proteine (eig. Arg)
Absorptionsmaximum bei 595nm
BCA Test
Proteine bilden mit Cu2+ im alkalischen Milieu enen Komplex
Reduktion des Cu2+ zu Cu+
bilden mit BCA einen Farbkomplex
Absorptionsmaximum bei 562nm
Geleletrophorese
Proteinlösung
Konzentrieren und Entsalzen
SDS PAGE, natitive PAGE, IEF, Blue native PAGE
Gellauf wird durch folgende Eigenschaften bestimmt
Größe
Ladung (abh. vom pH Wert)
Form
Polyacrylamidelektrophorese (PAGE)
Native PAGE
SDS-PAGE
IEF
Blue native PAGE
Auftrennung nach
Größe, Form, Ladung
kein Zusatz
Anwendung
Enzymaktivität bleibt erhalten. Einige Proteine können aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität im Gel nachgewiesen werden
Größe (Maskierung anderer Eigenschaften)
Zusatz von
SDS
Das am häufigsten verwendete Verfahren
trennt die Peptide nur nach Größe auf
Verfahren
Denaturierung der Proteine (Aufkochen)
Umhüllung mit Detergens (SDS) zur Maskierung der Ladung
DTT spaltet bei Hitze Disulfidbrücken
IEF (Isoelektrische Fokussierung)
Ladung (isoelektrischer Punkt)
Ampholyte
meist als erste Dimension bei der 2D-Elektrophorese
trennt die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt auf
pH-Gradient wird im PA-Gel erzeugt (Ampholyt-Gemische für bestimmten pH-Bereich)
Proteine laufen im Gel so weit bis der umgebende pH-Wert ihrem isoelktrischen Punkt entspricht
Bindungsfähigkeit für Coomassie
Coomassie
Ablauf einer typischen PAGE
Probenvorbereitung
Herstellen des Gels
Ansetzen der Gellösung (Acrylamid, Bisacrylamid, APS, TEMED)
Auftragen der Proben
Gellauf
Sichtbarmachen der Proteinbanden im Gel
Polyacrylamidgele
Acrylamid
Bis-Acrylamid
APS (Starter)
TEMED (Katalysator)
Gelladung und -lauf
Auftragen einer gleichen Menge an Protein
Anlegung von SPannung (100 - 200V)
Stromstärke ca. 12 - 15 mA
Färbemethoden
Silberfärbung
Kupfer
Fluoreszenzfarbstoffe
Coomassie Brilliant Blue
Färbung sehr von AS-Zusammensetzung der Proteine abhängig
sehr sensitiv
nur sehr saubere Chemikalien und Gefäße verwenden!
Kupferfärbung
Negativfärbung
die Gelmatrix wird gefärbt, die Banden bleiben klar
eine dunkle Pappe wird zum Betrachten unter das Gel gelegt
Fluoreszenbasierte Farbstoffe
sehr teuer
Beispiele sind Sypro-Farbstoffe, Deep Purple oder Cy-Farbstoffe
Immunpräzipitation
Antigen und Antikörper (polykklonal) werden in Lösung vermischt
Bildung von Aggregaten ➡️ fallen in Abhängigkeit von Konzentration an Antigen und Antikörper aus
Optimale Konzentration in der Äquatorialzone
Trägermaterialien
Membranen
Plastikoberflächen
Chromatographische Trägermaterialien (Agarose, Sepharose)
Magnetic Beads
Gold
Markierungsverfahren
Enzyme
Fluoreszierende Substanzen
Biotinylierung
Radioaktivität
Western Blot
Transfer der Proteine vom Gel auf Membran im elektrischen Feld
Wet Blot
Semi-Dry Blot
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