Welche Vorteile könnte der Einbau von unAA in eine bestehende AA-Sequenz haben?
therapeutisches Anwendungsbeispiel?
Neue o. verbesserte Eig.
-> erhöhte Bindungsaffiniät, Stabilisierung/Veränderung d. Struktur
-> Löslichkeit
->Verhinderung proteolyt. Abbau u. Erhöhung Halbwertszeit
photochemische Quervernetzung v. Proteinen (zB mit pBpa) bei UV-Bestrahlung
Bsp.: Glykosylierung von Epo -> durch Einbau v. unAA zusätzl. N-Glykosylierungsstellen eingeführt
Methode von Xie und Schultz beschreiben und die 2 Arten der Selektion mit je einem Grund nennen
Selektionmechanismen?
Prinzip:
Methode dient dazu, um unAS in Proteine einbauen zu können, indem gen. Codierung so erweitert wird
nutzt orthogonale tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS)-Paare, die speziell f. unAA entwickelt
kreuzreagieren nicht mit natürlichen tRNA- und aaRS-Sets der Wirtszelle
2 Selektionsmechanismen:
Pos.:
Ziel: Identifizierung von Mutanten mit verbesserter Aktivität
Grund: nur Zellen, die erfolgreich unAA einbauen, können überleben u. wachsen
Neg.:
Ziel: Eliminierung von Hintergrundaktivität, um Spezifität zu erhöhen
Grund: nur Zellen, die fehlerhaft die unAA einbauen oder nicht korrekt integrieren, unter Bedingungen kultiviert, die ihr Überleben nicht zulassen -> Mutanten eliminiert, die unAA falsch integrieren
DSC: Was heißt das ausgeschrieben?
Worauf beruht das Prinzip?
= Differential Scanning Calorimetry
bei Untersuchung von Proteinentfaltung misst DSC die Wärmemenge/Energie, die erforderlich ist, wo Protein denaturiert, dh Struktur entfalten —> misst Differenz v. Wärmefluss zw. Probe u. Referenz, die beide der gleichen Temp.erhöhung unterliegen
Was bringt Änderung der Bindungspezifität?
Bsp.: AK können durch unAA modifiziert werden, um bessere Affinitäten für AG zu erzielen
Was ist DNA-Shuffeling?
Technik zur rekombinanten DNA-Technologie, die zur Erzeugung neuer gen. Variationen (gen. Variabilität erhöhen) u. Optimierung v. Proteineigenschaften verwendet
-> imitiert natürliche Evolutionsprozesse wie Rekombination und Mutation, um DNA-Fragmente in vielfältige u. neue Kombinationen zu mischen
Vor und Nachteile des Verkürzens eines Proteins?
Vorteile:
HöhereExpressionsausbeute
Einfachere Isolierung
Vermeidung v. sterischen Hindernissen durch große Proteine
Nachteil:
evtl. Verlust biologische Aktivität u. Protein-Interaktionen
Beeinträchtigte Faltung/Stabilität
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