Altklausur

1. Ordnen Sie die Begriffe zu

   a) MALDI	1-ddNTP
   b) Phred Score	2-Stempelförmig
   c) Edman Abbau	3-Cystein
   d) Lysin	4-Sinapinsäure
   e) EOF	5-Fehler
   f)Epitop	6-FWHM
   g) Massenauflösung	7-Primer
   h)Disulfid	8-e-Aminogruppe
   i)PCR	9-Phenylisothiocyanat
   j) Sanger	10-Paratop

1. Wofür stehen die folgenden Abkürzungen?

• MALDI

• NHS

• ELISA

• PITC

• HPLC

1. Welche der folgenden Aussagen zur Spaltung von Proteinen ist richtig?

1. Welche der folgenden Aussagen zum Edman-Abbau ist richtig?

1. Welche der folgenden Aussagen zu Detergenzien ist richtig?

1. Welche der folgenden Aussagen zu Trennmethoden ist richtig?

1. Welche der folgenden Aussagen zur Kapillarelektrophorese (CE) ist richtig?

1. Welche der folgenden Aussagen ist richtig zum Prinzip der MALDI-MS ist richtig?

1. Welche Aussage zur Verwendung von Antikörpern ist richtig?

1. Welche Aussage zur Verwendung von Biotin zur Kopplung von Proteinen IN verschieden Assayformen ist richtig?

1. Sie haben ein Protein identifiziert, welches eine wichtige Rolle im Insulinsignalweg spielt und vor allem bei Diabetikern vorzuliegen schreint. Um Antikörper für Westernblot und ELISA zu generieren, haben Sie ein syntehtisches Peptid ihres Proteins herstellen lassen. Das Peptid hat die Sequenz YYTTTWVMT und eine Masse von 1165,5 Da.

a) Der Hersteller hat das Peptid nach der Synthese mit ESI-MS analysiert und das Massenspektrum zur Qualitätskontrolle mitgeliefert. Leider ist beik Ausdruck ein Großteil der Schrift nur unleserlich gedruckt worden.

Vervollständigen sie das Spektrum mit den m/z Werten und mit den Bezeichnungen der Ionenspezies für alle drei Peaks. Beschriften Sie die Achsen des Massenspektrum.

Welche Masse ergibt sich für die Molekülmasse des Peptids? Was folgern Sie daraus für das synthetische Peptid?

11b) Zusätzlich zum Massenspektrum nehmen Sie ein Fragmentionen-spektrum (MS/MS Spektrum) des Peptids nach Fragmentierung des zweifach-geladenen Molekülions an ihrem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer auf. Erklären Sie die Einstellungen, die Sie dafür an Q1, an Q2 und an Q3 im Triplequadropol benötigen durch Beschriftung der folgenden Zeichnung und kurzen erklärenden Text.

11c. Nach Zuordnung von nur einer Aminosäuren zu Peaks im MS/MS-Spektrum stellen Sie fest, dass das gelieferte Peptid nicht die gewünschte Sequenz hat. Wie haben Sie dies festgestellt?

Sequenz YYTTTWVMT

1. Erklären Sie die Vorgehensweise bei der quantitativen Aminosäurenanalyse von Proteinen.

   Beantworten Sie dabei folgende Fragen:

   • Für welche Aminosäuren können Sie keine spezifischen Informationen gewinnen?

   • Welche Aminosäuren sind nur bedingt quantitativ bzw. nach Optimierung der Methode bestimmbar?

   • Wie kann die Empfindlichkeit der Aminosäurenanalyse beeifnlusst bzw. verbessert werden?

   • Wie können Sie aus der Menge an Aminosäuren die Menge eines Proteins mit bekannter Aminosäuresequenz berechnen?

1. Sie analysieren ein Peptid mittels Aminosäureanalyse, Endgruppenbestimmung durch Dinitrolfluorbenzol (DNFB) und Carboxypeptidasen, Edman Abbau sowie enzymatischen Abbau mit den Enzymen GluC und Trypsin. Sie stellen folgendes fest:

   • Aminosäureanalyse ergibt eine Aminosäurezusammensetzung (2xE, 2xH, F, L, N, K, S, Y)

   • Endgruppenanalyse mit DNFB ergibt: H

   • Carboxypeptidasespaltung ergibt: L

   • Abbau mit GluC und Bestimmung der Aminosäurenzusammensetzung der entstandenen Peptide ergibt (E, F, H) und (E, K) und (H, L, N, S, Y)

   • Abbau mit Trypsin ergibt (E, F, H, K) und (E, H, L, N, S, Y)

   • Edman Abbau des dritten Peprids des GluC Abbaus (H, L, N, S, Y) ergibt NHS (L,Y)

(In klammern und mit Komma getrennt: Aminosäurenzusammensetzung)

a) Wie ist die Sequenz des Ausgangpeptids?

13b. Geben Sie die Reaktionsgleichung (mit Strukturen) für Phenylisothiocyanat mit dem Peptid an. Diese Reaktion wird zum Beispiel im ersten Schritt im Edman Abbau verwendet?

1. Erklären Sie die Vorgehensweise beim Westrn Blot in 5 Schritten, jeweils mit kurzer Erklärung von 1-2 Sätzen. Wie können Sie den Western Blot für sehr kleine Proteine optimieren?

1. Sie haben mittels Sanger Methode die Sequenz einer unbekannten DNA untersucht, doch ist ein großer Teil der Sequenz nur mit hoher Fehlerrate bestimmt worden. Sie wiederholen die Analyse mit einer neu erworbenen NGS-technik, die als IonTorren bekannt ist.

a) Erklären Sie das zugrundeligende Prinzip der IonTorrent Methode zur Sequenzierung von DNA und nennen Sie dabei die Details, die zu einer eindeutigen Basenzuordnung wichtig sind.

15b)Sie haben mittels Sanger Methode die Sequenz einer unbekannten DNA untersucht, doch ist ein großer Teil der Sequenz nur mit hoher Fehlerrate bestimmt worden. Sie wiederholen die Analyse mit einer neu erworbenen NGS-technik, die als IonTorren bekannt ist.

Durch welche Innovation konnte dieses als NGS Technik implementiert werden (3 allgemeine Punkte, 1 speziell für Ion Torrent)?

15c) Zur Berechnung von fehlerraten für jede einzelne Base wird der Phred-Score verwendet. Wie ist dieser definiert?

15d) Warum ist die Zurodnung eines individuellen Fehlers für jede sequenzierte Base ein wichtiger Faktor um eine zuverlässige und genaue Sequenzierung von DNA in komplexen Gewebeproben zu erreichen?

1. Bei der Verwendung von PCR zur Amplifikation treten oft Fehler auf, die einen korrekten DNA Sequenzierung erschweren.

a) Nennen Sie zwei Ursachen für PCR Fehler, die bei der Sequenzierung der folgenden DNA Sequenz wahrscheinlich sind.

AGTCTCGATACTACCCCCCCCGATCGATCGAGACT

1. Wie kann durch die sogenannte Bar-coding Methode, ein spontan auftretender Fehler bei der PCR Amplifikation durch Einbau des falschen Nucleotids von real vorliegenden DNA Mutationen unterschieden werden?