Altklausur ab SoSe 17

besitzt eine stabförmige Struktur bei der die Polypeptid- Hauptkette den inneren Teil des Stabes bildet und die Seitenketten nach außen ragen.

• durch intramolekulare H- Brücken ((NH)n … (C=O)n+4) stabilisiert.

• eine Peptidkette

• kontinuierliche Sequenz

• rechtsgängige Helix

• 3,6 AS pro Windung

• Seitenketten zeigen nach außen

• H- Brücken innerhalb der gleichen Peptidkette zwischen Peptidbindungen, übereinander liegender Helixwindungen

• zwischen der Carbonylfunktion der n-ten AS und dem Amidwasserstoff der (n+4)-ten AS

• eine Peptidkette

• kontinuierliche Sequenz

• rechtsgänge Helix

• 3,6 AS pro Windung

• Seitenketten zeigen nach außen

Plattenartige Struktur mit fast komplett gestreckter Polypeptidkette.

• Die Stränge liegen parallel oder antiparallel (stabilder) nebeneinander

• entsteht, weil die CO-NH- Gruppen der Peptidbindung starr in einer Ebene vorliegt, die benachbarten Bindungen dagegen frei drehbar sind.

• Stabilisiert durch intramolekulare H- Brücken

sind Verbindungen zwischen antiparallelen beta- Ketten.

• eine H- Brücke verbindet die C=O- Gruppe der ersten AS mit der NH- Gruppe der vierten AS.

Zusammenlagerung von mehreren Proteindomänen (Tertiärstrukturen) durch:

• nicht- kovalente- WW

• ionische Bindungen

• H- Brücken

• vdW-Kräfte

Bsp. Hämoglobin:

• besteht aus 4 Polypeptidketten (2 alpha- und 2 beta- Ketten)

• je eine alpha- und beta- Kette lagern sich zu einem alpha-beta- Dimer zusammen.

• 2 Dimere assoziieren zu nativen Quartärstruktur, dem Tetramer alpha2beta2

• sind Aufgebaut aus alpha- und beta- Tubulindimeren

• mehrere Protofilamente bilden einen Mikrotubulus

• Hohlkörper spiralförmig durch versetzte seitliche Zusammenlagerung der Protofilamente

Funktion:

• Transport von Membranvesikeln

• Axonwachstum

• Chromosomenanordnung in Mitose

• bilden Geißeln/ Zilien -> (Fort-) Bewegung

• Glycin (30%)

• Prolin (Xaa; 20%)

• Hydroxyprolin (Yaa; 20%)

• Hydroxylierung

• Glykosylierung

• limitierte Proteolyse

• Prolin: hydroxyliert

• Lysin: hydroxyliert und glykosyliert

• bestehen aus Kollagenmolekülen, die die charakteristische Form einer Tripelhelix aufweisen

• Moleküle sind gegeneinander versetzt angeordnet, was in einer Querstreifen resultiert.

-> Skorbut! (Avitaminose C)

• zur richtigen Funktion benötigen die Hydroxylasen von Prolin und Lysin Vit. C als Cofaktor!

• sonst fehlerhafte Biosynthese des Kollagens

• durch Vit. C kommt es zur Hydroxylierung von :

  • Prolin zu -> Hydroxyprolin

  • und von Lysin zu -> Hydroxylysin

  -> tragen zur Stabilisierung durch Ausbildung einer Tripelhelix und von Quervernetzung bei

• bei Wundheilung, Wachstum von Knochen, Knorpeln

• Genexpression der Kollagenbildung von Fibroblasten

… ist kovalent an ein Enzym gebunden und für dessen Funktion notwendig.

• Bsp. Häm ist die prosthetische Gruppe des Hämo- und Myoglobins und vermittelt durch sein gebundenes Fe2+ die Sauerstoffaufnahme.

… bezeichnet den Übergangszustand aus Enzym und gebundenem Substrat bei einer enzymkatalysierten Reaktion.

• Enzyme verfügen über ein aktives Zentrum, welches das Substrat bindet.

• Die Interaktion erfolgt nach dem “Schlüssel-Schloss-Prinzip” -> nicht-kovalente Bindung!

der Pyruvat- Dehydrogenase-Komplex (= eukaryotische PDH-Komplex) ist mit ca. 7800kd einer der größten bekannten Multienzymkomplexe.

bestehend aus:

• ca. 22 Pyruvat- Dehydrogenase Molekülen (E1)

• die einen Kern aus ca. 60 Untereinheiten Dihydrolipoyl- Transacetylase (E2) umschließen

• darin sind 6 Moleküle Dihydrolipoyl- Dehydrogenase (E3) eingelagert.

Der E2- Kern bildet ein Dodekaedergerüst, an dessen Ecken sich zahlreiche trimere Reaktionszentren für die Acetyl-CoA-Synthese gruppieren.

• Kern ist relativ flexibel und kann seine Größe bis zu 20% verändern

• E2- Komponenten besitzen mit den Liponamiden flexible Schwenkarme, um Acetylgruppen zu übertragen

Zum PDH-Komplex gehören weitere assoziierte Proteine wie z.B. PDH-Kinase und PDH-Phosphatase

• regulieren die enzymatische Aktivität des Komplexes durch reversible Phosphorylierungen.

Laut Antestat 7&8, Folie 30: ist involviert:

• Thiaminpyrophosphat (TPP)

=> Inhibitor bindet reversibel/ nicht-kovalent an das Enzym und senkt damit die Geschwindigkeit der Substrat- Produkt- Reaktion.

• der Inhibitor kann vom Substrat verdrängt werden.

Inhibitor bindet kovalent an das Enzym, wodurch das Enzym inaktiv bleibt.

• Verdünnungsreihe anfertigen

• Inkubationssatz aus Ellmanns- Reagenz, Substratlösung der entsprechenden Konzentration, Inhibitorlösung und Enzymlösung

• Enzymaktivität wird bei verschiedenen Kombinationen an Substrat- und Inhibitorkonzentrationen ermittelt.

• reziproke Enzymaktivität wird gegen die Inhibitorkonzentration aufgetragen.

-> Jede Gerade entspricht einer Substratkonzentration

-> Der Schnittpunkt der Geraden entspricht der Inhibitorkonstanten Ki

• Schlüsselreaktionen werden von Schlüsselenzymen reguliert.

• Sie katalysieren irreversible Reaktionen und bestimmen die Geschwindigkeit, mit der ein Stoffwechselweg abläuft

• sind allosterisch regulierbar

• Ihre Aktivität ist von der Konzentration bestimmter Metabolite abhängig

Bsp.:

• Hexokinase

• Phosphofructokinase

• Pyruvatkinase

-> 3 Schlüsselenzyme der Glykolyse

• Acetyl-CoA-Carboxylase

-> Schlüsselenzym der FS-Synthese

-> Schlüsselenzym: biotinhaltige Acetyl-CoA-Carboxylase. Katalysiert die Reaktion von Acetyl-CoA zu -> Malonyl-CoA unter ATP- Verbrauch (in Fettsäuresynthese)

• Positiver Effektor: Citrat

• Negativer Effektor: Palmityl-CoA

Im Cytoplasma

weil sie durch ihre C- Skelette nur Acetyl-CoA liefern. Dessen Acetylrest im Cirtatzyklus wird zu CO2 oxidiert, bevor die Stufe des Oxalacetats erreicht wird.

-> Als ketogene Aminosäuren bezeichnet man Aminosäuren, die zu Ketonkörpern abgebaut werden und nicht für die Gluconeogenese verwendet werden können.

Bei Mangel an Oxalacetat akkumuliert Acetyl-CoA, das nicht für die Neuproduktion von Pyruvat verwendet werden kann.

• dieses wird in der Leber zu den folgenden wasserlöslichen Ketonkörpern verwendet:

  -> Aceton

  -> Acetoaceton

  -> und beta-Hydroxybutyryl

Damit der katabole Stoffwechsel nicht zum Erliegen kommt.

in den Mitochondrien der Hepatozyten.

• kann zur Übersäuerung (Ketoazidose) des Blutes führen, was zum diabetischen Koma führen kann.

• Diabetis Typ I -> Insulinmangel -> erhöhte Glucagonkonz. -> Aktivierung von Lipasen -> Hydrolyse von Triacylglycerinen -> FS- Konz. steigt -> erhöhte Konz. an Acetyl-CoA -> Bildung von vielen Ketonkörpern -> senkung des Blut-pH- Wertes

• DNA- Verpackung (Form des Chromatins) und damit die Größe

• die Ladung

• Zusammensetzung des Gels (Trenngel/ Sammelgel)

• Wanderungsgeschwindigkeit ist umgekehrt proportional zum log (Anzahl Basenpaare)

Restriktionsenzyme:

• BamHI

• Xhol

• Xbal

Restriktionsverdau:

• zur Erstellung von Restriktionskarten

• Insertion eines Gens in ein Plasmid zur Herstellung rekombinanter Proteine, Proteasen, etc

Antestatfolien 11&12, Folie 25 ff.

a) isoelektrische Fokussierung

b) agarose Gelelektrophorese

c) ELISA, Western-Blot

• cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat

• DAG: Diacylglycerin

• IP3: Inositol-1,4,5- triphosphat

-> RNA- Polymerase I

• kat. Bildung von rRNA als prä-rRNA im Nucleolus

-> RNA- Polymerase II

• kat. Bildung von: prä-mRNA, snoRNAs, snRNAs, siRNAs, miRNA

-> RNA- Polymerase III

• kat. Bildung von: tRNA, 4S rRNA, snRNA und kleiner RNAs

-> RNA- Polymerase IV

• kat. Bildung von siRNA

Peptidabbau und Derivatisierung:

• Edman- Abbau

• AS-Analyse (ASA)

  • Q (Glutamin) / K (Lysin)

  -> genauso und zusätzlich über HR-MS

-> die Prozessierung erfolgt im Zellkern und umfasst 3 Reaktionen:

1. 5´Capping: ein 7- Guanylrest wird an das 5´- Ende der Prä-mRNA geheftet

2. Spleißen: Entfernen der Introns und Verknüpfung der Exons (am Spleißosom)

3. Polyadenylierung: Poly(A)-Schwanz aus 50-205 Adeninresten wird an das 3´- Ende geheftet.

Introns sind nicht- codierende und Exons codierende Sequenzen der prä-mRNA.

• Introns enthalten meist Regulationselemente für die Transkription

• sind bei Prokaryonten nicht vorhanden.

• H- Brücken verbinden CO- und NH- Gruppen unterschiedlicher Peptidbindungen miteinander

• Pro Windung werden 3,6 AS benötigt

• elektrostatische Anziehungskräfte

• alpha- Helix

• beta-Faltblatt

• beta- Schleifen

• beide Proteine haben als prosthetische Gruppe das sauerstoffbindende Häm.

• beim Häm kann ein Fe2+ im Zentrum einer Protoporphyrin-IX-Einheit O2 binden.

• das zentrale Eisenion ist je über eine Helix F der Proteine, über den dort ansässigen proximalen Histidinrest verbunden.

-> Myoglobin hat eine stärkere Affinität zu Sauerstoff als Hämoglobin.

-> Myoglobin nimmt schon bei niedrigem pO2 Sauerstoff sehr gut auf und gibt es bei solchem auch wieder ab.

-> die Affinität des Hämoglobins zum O2 ist pH- abhängig und wird von der CO2- Konz beeinflusst.

-> Hämoglobin bindet O2 unter hohem pO2 besser und löst sich unter niedrigem pO2 wieder.

• die Sättigungsfraktion Ys ist als Funktion des O2- Partialdrucks dargestellt.

• Sigmoidale O2- Dissoziationskurve des Hämoglobins im Vergleich mit der hyperbolischen Kurve des Myoglobins.

1. alpha- Amylase

2. Pepsin

3. Pankreaslipase

Abbau von Lipiden durch Lipasen:

• hormongesteuerte Lipasen spalten die Esterbindungen (rot umrandet) stellungsspezifisch der Triacylglycerine hydrolytisch und setzen somit 3 freie FS (lila Umkreist) und ein Glycerinmolekül (blau) frei.

• Lipasen sind eine heterogene Enzymklasse, die in Adipocyten als intrazelluläre Lipasen, im Gefäßsystem als endotheliale Lipoprotein- Lipasen oder im Darmlumen als Pankreaselipasen vorkommen.

• gibt die Reaktionsgeschwindigkeit bei einer bestimmten Substratkonzentration an.

• zur Beurteilung von Kinetik enzymatischer Umsetzung.

Annahmen:

• Reaktion ist exergonisch

• Gleichgewicht auf Seiten der Produkte

• Reaktion befindet sich im Fließgleichgewicht (steady-state)

=> v = Vmax [s] / Kmt[s]

b) Km, kcat, Vmax

Kompetitive Hemmung:

• Km erhöht, Vmax unverändert

nicht- kompetetive Hemmung:

• Vmax gesenkt, Km leicht erhöht bis unverändert

irreversible Hemmung:

• Km und Vmax gesenkt

=> Thiamin

• Pyruvat wird mittels Pyruvatdehydrogenase- Komplex zu -> Acetyl-CoA in den Mitochondrien umgebaut

• Thiaminpyrophosphat dient als Coenzym der Pyruvatdehydrogenase, das CO2 abspaltet.

Vitamin B6 = Pyridoxin

=> Transaminierung, Eliminierungsreaktion und Decarboxylierungen

-> Transaminierung: Ping-Pong-Mechanismus!

• Pyridoxalphosphat (PLP) im aktiven Zentrum an Lysin im Grundzustand gebunden.

• 1. AS bindet über Bildung eines Ketimins (Schiffsche Base) mit Aminofunktion, Bindung von PLP zu Lysin wird gespalten

• alpha-Ketosäure wird unter Zufuhr von H2O freigesetzt, Aminofunktion verbleibt am Cofaktor und es entsteht Pyridoxaminphosphat (PMP)

• PMP bindet 2.alpha- Ketosäure (meist alpha- Ketoglutarat) unter H2O- Abspaltung, Aldimin entsteht

• Aminofunktion wird auf Ketosäure übertragen, es entsteht 2.AS, die freigesetzt wird.

  -> PLP wird regeneriert und bindet wieder an Lysin des Proteins

• typischerweise von großen Enzymkomplexen, wie:

  1. Pyruvat- Dehydrogenase- Komplex

  2. alpha-Ketoglutarat-Dehydrogenase Komplex

Enzym: Pyruvatcarboxylase

• Die TATA-Box ist eine DNA- Sequenz in der Promotor-Region vieler eukaryontischer Gene mit der Konsensus- Sequenz:

  • 5`-TATAAA-3`

• etwa 30 bp vor dem Transkriptionsstartpunkt

  -> hier bindet das TATA-Box Binding Protein, der einzige Transkriptionsfaktor, der an die kleine Furche der DNA bindet.

• sie bewirkt eine Biegung der DNA- Struktur von ca. 90° und entwindet 1/3 einer Helixwindung und ist damit wichtig für die Ausbildung des Transkriptions- Initiations- Komplexes

• die alpha- Untereinheit besitzt 4 Kopien einer Spannungssensordomäne (S4, positiv geladene AS), die sich bei Depolarisation aus der Membran herausdrehen

  -> erhöht so die Öffnungswahrscheinlichkeit für den Kanal.

• die Depolarisation der Membran induziert eine Drehgleitbewegungdes des Sensors, die zur Auslagerung von 1 oder 2 Ladungen aus der Membran führt

  -> Drehgleitbewegung bei Aufsicht: gegen den Uhrzeigersinn!

• die dadurch bewirkte Konformationsänderung wird an die Domänen im Inneren weitergegeben

  => Kanal öffnet sich und ermöglicht den Ionenfluss

• V = hypervariable Region

• Fab und Fc sind durch den Verdau mit Papain unterscheidbar

• “glykosylierte Proteine” sind aus 4 UE aufgebaut, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind.

• Paratop gebildet aus Segmenten der leichten und schweren Kette, den hypervariablen Regionen

-> IgG, D, E: Monomere

-> IgA: Dimer

-> IgM: Pentamer

• Affinität = Stärke einer einzelnen AK-AG- Interaktion.

• Avidität = Summe der Stärke ALLER AK-AG- Interaktionen eines polyvalenten Anikörpers!

• Isoenzyme sind von verschiedenen Genen codierte Enzyme, die die gleiche biochemische Reaktion katalysieren.

• sie unterscheiden sich :

  • in Primärsequenz

  • der Art ihrer Regulierung

  • ihrem Vorkommen, d.h. am gleichen Ort in der Zelle, in unterschiedlichen Zellkompartimenten oder in verschiedenen Organen

Enzymhauptklassen:

• Oxidoreduktasen:

  • Lactatdehydrogenase

  • Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

• Transferase:

  • Glucokinase

• Hydrolasen:

  • keine Coenzyme

• Lyasen:

  • Pyridoxalphosphat

• Isomerasen

  • Glucose-1,6-bisphosphat

• Ligasen:

  • ATP

  • NAD+

• Translokasen:

  • ATP (Carnithin-Shuttle)

• Hydrolasen: Keine Coenzyme

• Lyasen: Pyridoxalphosphat

• Isomerasen: Glucose-1,6-bisphosphat

• Ligasen: ATP, NAD+

• Translokasen: ATP (Carnithin-Shuttle zB)

• Oxidoreduktasen

• Transferasen

= Peptidhormon, gebildet in den beta- Zellen der Langerhans´schen Inseln des Pankreas

• besteht aus 2 Peptidketten, die über Disulfindbrücken kovalent verbunden sind.

  • A- Kette: 21 AS

  • B- Kette: 30 AS

• innerhalb der A- Kette stabilisiert eine weitere Disulfidbrücke die Tertiärstruktur

• zunächst entsteht Präinsulin, was im ER durch Abspaltung des Signalpeptids zu Proinsulin wird.

• nach Translokation in den trans- Golgi spalten Konvertasen 2 Peptidbindungen und setzen das C- Peptid frei

• Insulin wird mit Proinsulin, C- Peptid und Zn2+ in sekretorischen Granula gelagert. Zn2+ komplexiert es zur hexameren Speicherform

Antestatfolien 7&8 Folie 22

Proteinexpression:

Induktion? Voraussetzung? Regulation?

-> IPTG - Isopropyl- beta- D- thiogalactopyranosid als künstlicher Induktor

• P= Promotor

  • bestimmende Sequenzen, die als Erkennungs- und Bindungsstelle für die RNA- Polymerase dienen (an der DNA)

• i= Repressor

  • reguliert die Aktivität der RNA- Polymerase

Ablauf:

• Bindung blockiert das Ablesen der Strukturgene, weil keine korrekte Bindung an DNA möglich ist.

  -> kann durch Substratinduktion inaktiviert werden, was das Ablesen ermöglicht

• der Induktor “Lactose” bindet an den Repressor, was zu einer Konformationsänderung führt.

  -> Repressor kann dadurch nicht mehr an die DNA binden => Ablesung Strukturgene

• o = Operator

  • Bindungstelle für Repressor- Protein (an der DNA)

• z = Strukturgen “lacZ”: beta- Galactosidase, zur hydrolytischen Spaltung von Lactose in Glc und Galactose

• y= Strukturgen “lacY”: Permease, ein Transportprotein, welches Lactose in die Zelle transportiert

• a= Strukturgen “lacA”: Transacetylase, Acetylierung nicht abbaubarer beta- Galactoside

Modell kann durch künstliche Induktion zur Genexpression genutzt werden.

Ablauf:

• der künstliche Induktor IPTG bindet an den Lac- Repressor

  -> Konformationsnderung, inhibiert WW mit Operator

  -> Transkriptions der Strukturgene

• IPTG ist nicht vom Bakterium metabolisierbar, der Repressor bleibt inaktiv.

  -> führt zur dauerhaften Transkription und kann für die Expression rekombinanter Proteine genutzt werden.

Blotten = Übertragung von Molekülen auf eine Membran.

Arten:

• Elektroblotting (Proteine/ nukleinsäuren)

  • übertragung von Proben von einem Gel auf eine Membran durch Anlegen einer elektrischen Spannung an ein Blotsandwich.

• Dot Blot (Proteine/ Nunkleinsäuren)

  • Übertragung von Proben durch Pipettiren auf eine Membran

• Kapillar- und Vakuumblotting (Nukleinsäuren)

  • Übertragung von Proben von einem Agarose- Gel auf eine Membran durch Kapillarkräfte oder Anlegen eines Vakuums.

Western Blot:

• ein AK wird verwendet, um das entsprechende Antigen auf einer Membran zu detektieren.

• nicht- markierte primäre AK

• enzymmarkierte sekundäre AK

Far- Western- Blot:

• wird zum Nachweis von Protein- Protein- Interaktionen eingesetzt.

• unmarkiertes Protein

• Enzymmarkierter spez.- AK

• für denaturierungs- unempfindliche Interaktionen (lineare Sequenzen)

• untersuchung der Auswirkung von posttranslationalen Modifikationen auf Prot- Prot- Interaktion

• [M+H+] = 323 + a = 324 m/z

• die Paare B1 und y2 und y1 und b2 sind je komplementär

PCR:

• Amplifikation eines bestimmten DNA- Abschnittes -> Denaturierung

• Ablauf:

  • DNA wird dafür erhitzt (95°C)

  • Annealing: 60°C, Ansatz wird abgekühlt, sodass sich Primer an DNA anlagert

  • Elongation: 70-72°C, Taq- Polymerase synthetisiert vom Primer aus 5´-3´Richtung den komplementären Strang

  • erneutes Erhitzen: Stopp Elongation

• 2 Primer erforderlich

Sequenzierung nach Sanger:

• Bestimmung der Basenabfolge eines DNA- Abschnittes

• DNA wird denaturiert, es wird nur ein Einzelstrang benötigt

• Einsatz von ddNTP´s (Didesoxynukleosidtriphosphaten)

• (keine 3´-OH-Gruppe)

• wird zufällig eine modifizierte Base eingebaut, bricht die Kette ab.

• DNA- Fragmente werden per Kapillarelektrophorese nach der Größe geordnet und damit die Sequenz rekontruiert.

• nur 1 Primre notwendig.

Fettsäurebiosynthese:

• Träger = Acyl-Carrier- Protein

• Cofaktor = NADPH, H+

• Ort = Cytoplasma

Beta- Oxidation:

• Träger = CoenzymA

• Cofaktor = NAD+, FAD

• Ort = Mitochondrienmatrix

=> Retinoblastom = seltene Tumorerkrankung des Auges im Kindesalter. Der Tumor geht von genetisch veränderten unreifen Netzhautzellen aus

• P53: ein nukleäres Phosphorprotein, gehört zur Gruppe der Tumorsupressorproteine

  • Konzentration steigt bei Schäden an der DNA stark an

  • ist an Regulierung der Apoptose und DNA- Reparatur beteiligt => Tumorzelltod

• es erfolgt eine Unterbrechung der Zellteilung in G1- Phase

  • durch Expression von p21 wird Übergang aus G0 in G1- Phase gehemmt

  • bei fehlerhafter Replikation wird die Zellteilung während dem G2- Stadium unterbrochen.

GPCR = G-Protein-gekoppelter Rezeptor

• im Grundzustand bindet ein GDP- beladenes G- Protein an einen unbesetztes Rezeptor

• nach Bindung eines Liganden ändert sich die Rezeptorkonformation

• das bewirkt, dass am G- Protein GDP gegen GTP ausgetauscht und dadurch das trimere G- Protein gespalten wird

• es zerfällt in seine alpha- UE und den beta- gamma- Komplex

• die aktivierte alpha- UE (G alpha s) kann die Adenyl- Cyclase stimulieren, das in der Zellmembran eingelagert ist.

• Adenylcyclase setzt ATP zu cAMP um

• Phosphodiesterasen spalten cAMP und inaktivieren es damit.

• G alpha s kann somit die Konz. des second- Messengers (cAMP) regulieren

-> steigerung der Herzfrequenz, Relaxation glatter Muskulatur

weitere G- Proteine:

• Gq -> Aktivierung der Phospholipase C, Bildung von IP3 und DAG -> Kontraktion glatter Muskulatur, Erregungsweiterleitung

• Gt -> Aktivierung der Phosphodiesterase 6, Abbau von cGMP

• Gi/o -> Hemmung der Adenylcyclase, Hemmung von cAMP, Öffnung von K+- Kanälen, Hemmung von Ca2+- Kanälen -> hemmung Erregungsweiterleitung

• ATP heftet sich an das Myosinköpfchen, wodurch dieses sich vom Actin löst

  -> dabei wird ATP zu ADP + Pi gespalten

• die daraus freiwerdende Energie führt dazu, dass sich das Myosinköpfchen in der angespannten “Ausgangsposition” befindet

  -> und bei einem neuen Reiz das Actin erneut anspannen kann.

• steuern phasenspezifische Genexpression innerhalb des Zellzyklus

• katalysieren Phosphorylierung von Retinoblastom- Proteinen (Genprodukte des RB- Tumorsupressorgens)

  
  

• Konformationsänderung des RB-Proteins

• Übergang von G1- Phase zur S-Phase durch Cyclin E

-> Cyclin A -> G2

-> Cyclin B -> Start Mitose

• Sequenzierung nach Sanger

• MS/MS

Semidry:

• höhere Transfergeschwindigkeit bei geringerem Pufferverbrauch (schneller!)

  -> diskontinuierliches Puffersystem!

• Gel und immobilisierte Membran zwischen mehrere mit Puffer getränkte Filterpapiere legen, die direkten Kontakt zu 2 Elektrodenplatten haben

  • Filterpapiere an Kathode (-) mit Kathodenpuffer getränkt

    • Tris(Base) -> pH8,3 -> muss negativ geladen sein, E-Aminocapronsäure -> Puffer, Methanol, SDS, H2O

  • Filterpapiere an Anode (+) mit Anodenpuffer getränkt

    • Tris(Base) -> pH 7,8 -> pH- Gradient, Methanol, H2O -> ohne SDS, um Gefahr des Durchblottens zu verringern!

Tank-Blot:

• dauert lange, muss gekühlt werden (4°C), höherer Pufferverbrauch

• Sandwich: wird ähnlich gepackt wie beim Semidry-Verfahren, weniger Filterpapier

• steht senkrecht in einem Tank, gefüllt mit Puffer

• Orientierung:

  • Gel auf der Seite der Kathode

  • Membran auf der Seite der Anode

• Anderer Puffer und nur einer!

SDS:

• Denaturierung und Beladung von Proteinen mit SDS für Transfer zur Anode, verbessert Transfereffizienz

Methanol:

• SDS-Stripping, Reduktion der Hydrophie der Membran, verbessert Adsorption an Membran, verringert Porengröße der Membran

1. Initiation:

• (Startet an der Promotorregion (zB TATA-Box) -> Bindung der RNA-Polymerase II

• diese liegen 10-35 (Eukaryonten: -30 mehr als bei Prokaryonten) Nucleotide 5´-stromaufwärts des Starts

• Promotor enthält zusätzlich pyrimidinreiche Initiator- Elemente, CCAAT- und GC- Boxen)

• Sequentieller Aufbau des Initiationskomplexes

• TFIID vermittelt Initiation für RNA-P I, II und III

• weitere TF binden und RNA-PII dockt mit C- Terminalem Ende an TFIID an

• weitere TF bilden Multiproteinkomplexes

• TFIIH (Proteinkinase) phosphoryliert RNA-PII C-terminal (an Ser und Thr), sie verlässt den Komplex.

• gleichzeitig entwindet TFIIH über Helikaseaktivität unter ATP- Verbrauch die DNA -> Startschuss

1. Elongation:

• an der entwundenen Doppelhelix entsteht eine Transkriptionsblase

• die entstehende RNA- Sequenz entspricht der des kodierenden Strangs (T gegen U gestauscht)

• beginnt wenn kritische Länge von ca. 12 Nucleotiden überschritten wird

• Polymerase läuft nun den Matrizenstrang in 3´-5´- Richtung entlang

• schiebt offenen Komplex aus entwundener DNA und naszierender RNA

1. Termination:

• Polymerase arbeitet solange, bis sie auf ein Stopsignal trifft

• zB GC- reiche Struktur und kurzes Segment mit U- Resten (Poly-U)

• RNA assoziiert dadurch selbst zu einer Haarnadelschleife

• Arginin

  • polar und basisch

• Valin: unpolar

• Verdauungsenzyme Trypsin, Chymotrypsin und Elastase katalysieren spezifisch dei Spaltung der Proteinbindung an AS mit bestimmten Seitenketten.

-> Trypsin:

• Spaltet nach basischen AS mit langen positiv geladenen Seitenketten

  • Lysin, Arginin

-> Chymotrypsin:

• spaltet nach aromatischen oder langen unpolaren Seitenketten

  • Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin, Leucin

-> Elastase:

• spaltet nach nicht aromatischen AS mit kleinen Seitenketten

  • Alanin, Glycin, Serin, Valin

• das Enzym "Meerrettich- Peroxidase, das an dem sek.AK konjugiert ist, katalysiert eine Farbreaktion in Gegenwart eines Substrates (3,3´,5,5´Tetramethylbenzidin = TMB)

  -> TMB wird oxidiert und liefert ein blaues Oxidationsprodukt.

  -> die Farbentwicklung wird photometrisch gemessen.

  -> die Konzentration mittels Eichkurve ermittelt (Antestatfrage 3&4 Folie 8)

Auch möglich:

• mit Radioisotopen, Gold-Nanopartikel, Chromophoren

• oder: Nachweis des Immunkomplexes über Immundiffusionsessays

Direkt:

• prim. AK ist mit dem Enzym/ Farbstoff gekoppelt

• anti- humanes IgE- Detektions- AK

• prim. AK -> Meerretich- Peroxidase

Indirekt:

• sek. AK ist mit Enzym/ Farbstoff gekoppelt und erkennt den prim. AK -> Anti- Hühnerlysozym- IgG (Kaninchen)

  • prim. AK: unmarkiert

• sek.AK: alkalische Phosphatase

• Substrat BCIP: 5-Brom-4-Chlor-3-indoxylphophat / NBT: Nitroblautetrazolium- chlorid

-> katalysieren unter Verbrauch von Wasser die Esterspaltung zwischen einem Phosphatrest und einer Hydroxylgruppe.

• es gibt saure und alkalische

-> katalysieren die Übertragung eines Pentose- oder Hexose-Rests von einem Di- oder Polysaccharid oder einem Nucleosid auf ein Orthophosphat- Ion.

• Bsp.: Glykogenphosphorylase

-> Übertragen Phosphatgruppen, oft von Nucleosidtriphosphaten, auf andere Substrate.

• zB die Phosphofructokinase

-> die Prozessierung erfolgt im Zellkern und umfasst 3 Reaktionen:

1. 5´Capping: ein 7- Guanylrest wird an das 5´- Ende der prä-mRNA geheftet.

2. Spleißen: Entfernen der Introns und Verknüpfung der Exons (am Spleißosom)

3. Polyadenylierung: Poly(A)- Schwanz aus 50-250 Adeninresten wird an das 3´- Ende geheftet.

1) Denaturierung (95°C) -> Trennung der DNA- Doppelstränge

2) Annealing (Abkühlen auf T passend zum verwendeten Primer, ca. 60°C)

• Primer lagern sich an komplementäre DNA- Sequenz

3) Elongation (70- 72°C):

• verlängerung der Sequenz mit Nukleotiden durch Taq- Polymerase

• Temp- Erhöhung um unspezifische Bindung des Primers zu verhindern

• DNA- Stränge lagern sich nicht mehr zusammen, da Primer gebunden sind.

• Promotorregion (zB TATA- Box) -> Bindung der RNA- Polymerase II

• diese liegen 10-35 (Eukaryonten: -30 mehr als bei Prokaryonten) Nucleotide 5´-stromaufwärts des Starts

• Promotor enthält bei Eukaryonten zusätzlich pyrimidinreiche Initiator- Elemente, CCAAT- und GC- Boxen

1. Skelett- und Herzmuskelzellen

1. mit Actin und Tropomyosin + Troponin => dünne Myofilamente

• Aufgabe der Probe auf das Probenkissen

  -> durch Kapillarkräfte wandert Flüssigkeit

• am Konjugatkissen:

  -> kommt es zur Bindung des konjugierten AKs an das nachzuweisende Peptid

  -> oder wenn kein AG vorhanden ist, werden die AK einfach mit dem Fluss mitgerissen.

• bei der Testlinie binden die fixierten AK die mit dem konjugierten AK markierten Peptid Epitope -> wenn positiv!

• bei der Kontrolllinie binden die AK die konjugierten AK (bei positivem und negativem Ergebnis! -> dient zur Validierung des Testergebnisses.

Sauerstoffbindung im Vergleich:

• die Sättigungsfraktion Ys ist als Funktion des O2- Partialdrucks dargestellt.

• Sigmoidale O2- Dissoziationskurve des Hämoglobins im Vergleich mit der hyperbolischen Kurve des Myoglobins.

• Sequenzmodell der Kooperativität:

  -> die Bindung von Liganden führt zu zunehmenden lokalen Konformationsänderungen, die noch unbesetzte, benachbarte Untereinheiten in ihrer Ligandenaffinität verändern.

• Symmetriemodell der Kooperativität:

  -> T- und R- Zustand von Hämoglobin stehen im Gleichgewicht.

  -> In Abwesenheit des Liganden dominiert der niederaffine T- Zustand.

  -> spontane Übergänge in den hochaffinen R- Zustand sind nur selten möglich.

  -> die Bindung eines Liganden an wenigstens eine Untereinheit macht die allosterische Transition des gesamten Tetramers in den R- Zustand wahrscheinlicher, usw.

Unterschiede:

-> Sequenzmodell:

• Kooperativität

• Bindung des Substrates ändert nur die Konformation der UE, an die es bindet.

• es findet ein Übergang von T- nach R- Form statt

• es entsteht eine TR- Zwischenform

-> Symmetriemodell:

• Kooperativität + allosterische Vorgänge

• bei Substratbindung an aktives Zentrum: ALLE UE des Enzyms durchlaufen gleichzeitig T- und R- Form

• es gibt keine Zwischenform

-> Reinheit und Molekülmasse

• Probenpuffer zur Probe geben, erhitzen bei 95°C (Denaturierung), 5min.

  • SDS: Sodium dodecyl sulfate PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis

• SDS = anionisches Tensid (Detergens)

  • denaturiert Proteine und maskiert ihre Ladung = ermöglicht Trennung nach GRÖßE

    -> Molekularsiebeffekt/ Größenausschluss

• SDS- Proteinkomplexe -> negative Ladung -> wandern zur Anode (+)

  • ca 1 SDS pro 2 AS; 1,4g SDS pro 1g Protein

• TRIS: verringert positive Ladung basischer AS

• beta-Mercaptoethanol: Reduzierung der Disulfidbrücken, Thiol als Reduktionsmittel

• Glycerin: Dichteerhöhung, zum Absenken in die Geltasche

• Bromphenolblau: Markierung der Lauffront, anionischer Farbstoff, inert ggü. Proteinen, wandert schneller als Proteine

Detektion mit Comassie- Färbung:

• Sichtbarmaschen der Proteine, lagert sich an basische AS- Seitenketten an

  = Sequenzunspezifische Proteinfärbung.

-> Die Trennung erfolgt auf Grund des Polyacrylamidgels aus Sammelgel und Trenngel und wegen des elektroosmotischen Flusses.

• Ladungstechnisch wären die Proteine gleichschnell (EOF) ABER das Gel sorgt für Molekularsiebeffekt/ Größenausschluss, wodurch die Proteine nach Größe verlangsamt und so aufgetrennt werden.

• das Mischungsverhältnis des Acrylamids mit dem Quervernetzer “Bisacrylamid” determiniert die Maschenweite des Gels.

• GDP- beladenes G- Protein bindet im Zellinneren an einem unbesetztes GPCR (beta-adrenerger Rezeptor)

• nach Bindung von Adrenalin und Glucagon an ihren jeweiligen Rezeptoren ändert sich deren Rezeptorkonformation

• am G- Protein wird GDP gegen GTP ausgetauscht und das trimere G- Protein wird in seine alpha- und beta-gamma- UE gespalten.

• aktivierte alpha- UE (G alpha s) kann die Adenylat-Cyclase stimulieren, welche ATP zu cAMP umsetzt

• cAMP aktiviert allosterisch Proteinkinase A und inaktiviert Proteinphosphatase- 1

• Proteinkinase A phosphoryliert Glykogensynthase, was damit inaktiviert wird

• Proteinkinase A phosphoryliert Phosphorylase- Kinase, die dann Glykogenphosphorylase phosphoryliert = aktiviert

= Tumorsupressor mit einer Molekülmasse von 53 kDa

• reguliert die Zellapoptose (über Expression des bax-Gens), DNA- Reparatur und den Alterungsprozess

• das TP53- Gen ist in 50% aller Tumore mutiert. p53 ist in so gut wie jedem Krebs ausgeknockt.

  -> durch seine Fähigkeit den Zellzyklus zu unterbrechen, könnte p53 die Vermehrung einer entarteten Zelle verhindern.

• Organ: Leber und Niere

• Zellorganellen: Mitochondrium und Cytoplasma

• Stoffwechselrouten: oxidative Desaminierung über Glutamat- Dehydrogenase und Harnstoffzyklus

-> Anaplerotische Reaktion = Auffüllreaktion

• Stoffwechselwege, die Substrate produzieren, welche dem Citratzyklus zugeliefert werden.

-> die Desaminierung von Glutamat zu alpha- Ketoglutarat durch die Glutamat- Dehydrogenase, welches in den Citratzyklus eingeschleust wird.

=> Ping-Pong-Mechanismus!

• PLP (Pyridoxalphosphat) im aktiven Zentrum an Lysin im Grundzustand gebunden.

• 1. AS bindet über Bildung eines Ketimins (Schiffsche Base) mit Aminofunktion, Bindung von PLP zu Lysin wird gespalten.

• alpha- Ketosäure wird unter Zufuhr von Wasser freigesetzt, Aminofunktion verbleibt am Cofaktor und es entsteht PMP (Pyridoxaminphosphat)

• PMP bindet 2. alpha-Ketosäure (meist alpha- Ketoglutarat) unter Wasser- Abspaltung!

  • Aldimin entsteht

• Aminofunktion wird auf Ketosäure übertragen, es entsteht 2. AS, die freigesetzt wird.

-> PLP wird regeneriert und bindet wieder an Lysin des Proteins

• Alanin- Aminotransferase -> Herzinfarkt

• Aspartat- Aminotransferase -> Lebererkrankung/ -entzündung

=> Anaplerotische Reaktion = Auffüllreaktion

• Stoffwechselwege, die Substrate produzieren, welche dem Citratzyklus zugeliefert werden.

• die Desaminierung von Glutamat zu alpha- Ketoglutarat durch die Glutamat- Dehydrogenase, welches in den Citratzyklus eingeschleust wird.

• Resistenz- Plasmide: enthalten Resistenzgene gegen Antibiotika oder Gifte

• Degradations- Plasmide: ermöglichen Abbau von ungewöhnlichen Substanzen, wie zB Toluol, Salicyls

• Virulenz- Plasmide: machen Bakterium zum Krankheitserreger

• Fruchtbarkeitsplasmide: Einleitung der Konjugation enthalten nur tra- Gene

• Col- Plasmide: enthalten Gene, die für Colicine (Proteine, die für andere Bakterien toxisch sind) codieren.

Hydrolasen

-> die verschiedenen Enzyme ergeben verschiedene Produkte, wenn sie einen Streifen DNA schneiden.

-> Die gesamt Länge des Plasmid- Ringes ist 48,5 kiloBasenpaare

-> in der Tabelle stehen die Produkte- Fragment- Längen. Wenn 2 stehen, existieren auch 2 Schnittstellen.

• die ersten 2 Enzyme haben daher 2 Schnittstellen.

-> wenn xbal und xhol genommen wird,

Bsp:

• xbal schneidet so, das einmal ein 24-er Stück und ein 24,5 er Stück entsteht

• durch das xhal entstehen zusätzliche Schnittstellen am ganzen!

• dadurch das beide am großen Ring schneiden, kommen teilweise nur diese kleinen Stücke raus.

Bsp.:

• beim letzten Bsp, mit xhol und Kpnl, muss eine Schnittstelle von beiden gleich sein, da

  • laut Kpnl (allein) 1,5 , 17 und 30 Rauskommen. Bei der Kombi beider Enzyme sind die Stücke 1,5 und 17 geblieben. Daher kann nur noch das große 30er Stück zersplittet worden sein. Da Xbal allerdings 2 Schnittstellen aufweise, muss es sich daher um eine Überschneidung handeln.

-> Chymotrypsin spaltet hinter Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin und Leucin.

496,53M

-> vmax: sinkt

-> Km: unverändert, bis leicht erhöht