04.1 Rezeptoren I

• G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR)

• Rezeptortyrosinkinase-Rezeptoren (RTK)

• Rezeptor-Guanylatcyclasen

• Gesteuerte Ionenkanäle

• Kernrezeptoren

• 7 Transmembran-Helices („7TM-Proteine“)

• Cytosolische Seite bindet G-Protein

• „G-Protein“ = GTP bindendes Protein (meist Trimer mit α-, β- und γ Untereinheit, α-Untereinheit mit GDP / GTP)

• Bei Bindung eines Liganden am Rezeptor wird die α-Untereinheit freigesetzt

• Die freie α-Untereinheit des G-Proteins aktiviert (oder hemmt) ein Zielenzym

  —> Zielenzyme produzieren sekundäre Botenstoffe

• GAP: GTPase aktivierende Proteine (Effektoren)

  —> Beschleunigt die Inaktivierung des G-Proteine und begrenzen dadurch die Wirkdauer

• RGS: Regulators of G-protein signaling (binden häufig an GAP)

• GEF: Guanin nucleotid exchange factor (kann Teil des GPCR oder mit GPCR assoziiert sein)

  —> Durch die Wechselwirkung mit dem GEF kann GDP schneller gegen GTP ausgetauscht werden. Dadurch wird das G-Protein schneller aktiviert

• Permanente Aktivierung des G-Proteins durch das Cholera-Toxin

  —> Bindung der ADP-Ribose-Einheit an Arg der Gs𝛼-Untereinheit

  —> keine Hydrolyse von GTP, permanente Aktivierung der Adenylatcyclase

  —> Anstieg der cAMP-Konzentration auf ca. das Hundertfache des Normalwertes: Freisetzung großer Mengen von Verdauungsflüssigkeit aus den Darmepithelzellen durch cAMP-Wirkung auf Ionenkanäle

• Permanente Aktivierung der Adenylatcyclase durch Hemmung der inhibitorischen G-Protein-UE (𝛼-Gi) durch das Pertussistoxin

  —> Katalysiert die Übertragung Ribosylrestes des ADP-Ribosyl auf das Gi𝛼 Protein und stört damit die Hemmung der Adenylatcyclase

• β2-adrenerge Rezeptoren aktivieren den Adenylatcyclase/cAMP-Weg und führen zu einer Dilatation der glatten Muskelzellen in Bronchien und im Uterus und in Gefäßmuskelzellen

• 𝛼1-adrenerge Rezeptoren aktivieren den PLC-Weg und den Ca2+-Calmodulinweg und führen zu einer Konstriktion der glatten Muskelzellen in Bronchien und im Uterus und in Gefäßmuskelzellen

• V1-Vasopressinrezeptoren aktivieren den PLC-Weg und den Ca2+- Calmodulinweg und wirken wie 𝛼1-adrenerge Rezeptoren

• V2-Vasopressinrezeptoren aktivieren den Adenylatcyclase/cAMP-Weg und führen zum Einbau von Aquaporinen (Wasserkanälen in den Tubuluszellen der Niere und fördern die Wasserrückresorption

• H1-Histaminrezeptoren aktivieren den PLC-Weg und führen aktivieren allergische Reaktionen

• H2-Histaminrezeptoren aktivieren den Adenylatcyclase/cAMP-Weg und führen zur Magensäureausschüttung

• α1-adrenerge Rezeptoren hemmen die Adenylatcyclase oder stimulieren die PLC

• α2-adrenerge Rezeptoren hemmen die Adenylatcyclase und in bestimmten Zellen die Calzium-Ionen-Freisetzung

• β-adrenerge Rezeptoren stimulieren die Adenylatcyclase

1. Adrenalin bindet an den GPCR

2. das G-Protein aktiviert zum einen die Adenylat-Cyclase, die dafür sorgt, dass ATP zu cAMP umgewandelt wird

3. das G-Protein aktiviert zum anderen K+ Ionenkanäle, was zu einer Depolarisation der Zelle führt

4. cAMP aktiviert wiederum die PKA, welches die ebenfalls die K+ Kanäle aktiviert, den PLC-IP3-Ca2+ signalweg hemmt, den Na+/Ca2+ Austausch fördert und die MLCK runterreguliert

—> Relaxierende Wirkung

• es gibt eine Vielzahl von RTK-Typen

• üblicherweise handelt es sich um monomere Transmembranproteine mit vielen unterschiedlichen Domänen

• bei Ligandenbindung lagern sich die Monomere zu Dimeren zusammen

• bei Dimerisierung werden die intrazellulären Tyrosinkinasedomänen durch Autophosphorylierung aktiviert

• Ausnahme: Insulinrezeptor ist eine RTK, die schon dimerisiert vorliegt!

1. Der Rezeptor liegt ungepaart in der Membran vor

2. ein Sigalmolekul bindet an den Rezeptor und führt zur Dimerisierung

3. die Kinasedomäne des Rezeptors führt zu einer aktivierenden Autophosphorylierung

4. die aktiven Tyrosinkinasen können dann weitere Zielproteine phosphorylieren und aktivieren

   —> Zielproteine binden über SH2-Domänen an die phosphorylierten Tyrosinreste der intrazellulären Domänen und werden durch Phosphorylierung aktiviert

Beispiel PLC𝛄-Aktivierung durch RTK

SH2 domain = src homology region 2

• MAP Kinase Weg

• PKB Weg

• PKC Weg

• RTK-aktivierte Signalkaskaden werden in der Regel über Adaptormoleküle aktiviert, die das Signal weiterleiten

• Adaptormoleküle verfügen dabei über besondere Bindungsdomänen:

  1. Proteine mit SH2-Domänen (Beispiel: PLC𝛄): Binden an phosphorylierte Tyrosinreste

  2. Proteine mit PTB-Domänen (Beispiel: IRS-1): Binden an phosphorylierte Tyrosinreste

  3. Proteine mit SH3-Domänen (Beispiel: Grb2) Binden an Prolin-reiche Sequenzen

  4. GEF-Proteine (Beispiel: SOS): Bindet an G-Proteine

  5. Besondere G-Proteine (Beispiel: Ras): Aktivieren weitere Effektoren (Beispiel: Raf)

• SH2- oder PTB (Phospho-Tyrosin-Binding)- Domänen vermitteln die Bindung an phosphorylierte Tyrosinreste

• SH3-Domänen vermitteln die Bindung an Prolin-reiche Sequenzabschnitte

• spielen eine Rolle bei Signalwegen des Insulinrezeptors

• über den Insulinrezeptor

• Insulin-Rezeptor-Substrat 1 (IRS-1) besitzt eine Region mit verschiedenen Effektorbindestellen (effector binding sites) an der RTK

• Je nachdem, welcher Effektor in der betreffenden Zelle vorhanden ist, können verschiedene Signalwege aktiviert (Grb2; PI3K) oder gehemmt (SHP2) werden

1. Insulin bindet an den Rezeptor (RTK)

2. die RTK führt eine Autophosphorylierung durch

3. durch die Autophosphorylierung kann IRS1 phosphoryliert und somit aktiviert werden

4. IRS1 bindet mit dem phosphorylierten Tyrosinrest an die SH2 Domäne des PI3K

5. die PI3K phosphoryliert PIP2 zu PIP3 welches membranständig bleibt

6. die PKB (Akt) kann nun an PIP3 binden und wird so in räumliche nähe von der PDK1 gebracht

7. die PDK1 phosphoryliert die PKB unter ATP Verbrauch

8. pPKB (Akt) löst sich von der Membran und kann dann viele Signalwege aktivieren

• Die PKB oder AKT ist eine Schlüsselpunkt-Kinase, die bei einer Vielzahl von Signalwegen eine zentrale Rolle spielt

• Beispiel PKB (AKT) Wirkung in Hepatozyten

  1. Aktivierung der Glykogensynthese und Einbau neuer Insulin-abhängiger Glukosetransporter (Glut4) in die Membran

  2. Hemmung der Glukagonwirkung (Freisetzung von Glukose durch Aktivierung des Adenylatcylase/cAMP-Weges) zugunsten der Insulinwirkung

• PKB (AKT)-Signalwege besitzen Regulationsmechanismen, die eine andauernde Aktivierung verhindern

• andauernde PKB (AKT)-Aktivierung fördert die Tumorgenese

PKB bei der Tumorentstehen

1. Aktivierung über den Insulinrezeptor, PIP3 und PDK1

2. Akt kann dann die GSK3 Abschalten, wodurch diese die GYS nicht mehr inhibieren kann

3. dadurch kann die Glycogensynthese stattfinden

4. Aktiviert die PDE wodurch die Freisetzung von Glucose gehemmt wird

5. kann außerdem den einbau von Glucosekanälen in die Membran fördern um die Glucoseaufnahme zu erhöhen

• Aktivierung durch unterschiedliche Rezeptor-Typen als Antwort

  auf verschiedenste Stimuli

• Beispiele für Stimuli:

  1. Hormone (z.B. Insulin)

  2. Wachstumsfaktoren (z.B. EGF, FGF)

  3. Inflammatorische Zytokine (z.B. TNF)

  4. Stressfaktoren (z.B. Osmotischer Schock, Bestrahlung)

• Proteinfamilie aus verschiedenen Kinasen

• Teil einer dreistufigen Kinasekaskade

• Drei Hauptgruppen von MAP-Kinasen:

  1. ERK1/2: Extrazellulär regulierte Kinasen

  2. JNK: c-Jun-N-terminale Kinasen

  3. p38: p38 Mitogen-aktivierte Proteinkinasen

• charakteristisches TxY (Threonine-x-Tyrosine) Motiv

• Phosphorylierung von Thr und Tyr ist notwendig um die Kinase in der aktiven Konformation zu halten

• Zentraler Regulatorweg der Zellproliferation durch Kontrolle des Zellwachstums und des Zellzyklus (aktivierende Funktion)

  —> aktiviert Transkriptionsfaktoren, die für das Zellwachstum von Bedeutung sind (z.B. c-myc)

  —> inhibiert anti-proliferative Gene

• c-Jun-N-terminale Kinasen

• Zentraler Regulatorweg der Apoptose

  —> phosphoryliert c-myc beidseitig und führt so zur Inaktivierung

  —> aktiviert c-Jun durch N-terminale Phosphorylierung

  —> anti-apoptotische Regulationsfaktoren wie Bcl-2 und Bcl-xl werden durch Phosphorylierung inhibiert

• Mitogen-aktivierte Proteinkinasen

• Regulator von inflammatorischen Prozessen

  – ist essentiell für die Produktion von Interleukinen und Zytokinen

  – steuert die Signal-induzierte Stabilisierung von mRNAs, die für proinflammatorische Proteine codieren

• Aktiviert über den RTK Rezeptor

• Die Aktivierung des MAPK-Weges erfolgt in der Regel über die Adaptorproteine Grb2, SOS und Ras

• Bei Ras handelt es sich um ein G-Protein, das über den Austausch von GDP durch GTP aktiviert wird

• Bei der Aktivierung von Ras übernimmt SOS die Funktion eines GEF, d.h. der Austausch von GDP gegen GTP wird beschleunigt

• Das aktive Ras bindet an Raf und aktiviert dessen Kinasedomäne und damit die nachfolgenden MAP-Kinasen

• Mutiertes, permanent aktives Ras ist ein Onkogen

• MAPK-Signalwege wirken häufig auf die Genexpression

• Dazu muss die aktivierte MAPK passiv durch Diffusion oder aktiv als Dimer in den Zellkern gelangen

• Im Zellkern wirken MAP-Kinasen auf verschiedene Transkriptionsfaktoren

• Zellspezifische Regulation

• Ribosomale S6- Kinasen (RSKs) sind häufig an der MAPK- Wirkung beteiligt

• RSKs können über den MAPK- oder den PI3K-Weg aktiviert werden

• RSKs wechselwirken mit unterschiedlichen Regulatoren

• RSKs können verschiedenste regulatorische Proteine sowohl im Cytosol als auch in Zellkern aktivieren

• RSK Familie: p90rsk und p70rsk

  — Serin / Threonin-Kinasen:

  —> p90rsk- MAPK-Weg

  —> p70rsk- PI3K/AKT-Weg

1. Die aktive MAPK (Erk) phosphoryliert die p90RSK

2. Die aktive p90RSK wandert in den Zellkern

3. Der Serum Response Factor (SRF) durch wird durch die aktive p90RSK phosphoryliert

4. Die dimere MAPK wird aktiv in den Zellkern transportiert

5. Der Ternary Complex Factor (TCF) wird durch die MAPK aktiviert

6. Die phosphorylierten Transkriptionsfaktoren binden an das Serum Response Element (SRF) und regulieren die Transkription bestimmter Gene

• Die Geschwindigkeit der MAPK-regulierten Genregulationen ist abhängig von den Adaptorproteinen, dem MAPK-Typ und von weiteren regulatorischen Strukturproteinen, wie z.B. des JNK interacting proteins -1 (JIP1)

• Unterschiedliche MAP-Kinasen regulieren unterschiedliche Transkriptionsfaktoren

• Die JNK-Signalkaskade ist schneller als die ERK-Kaskade, durch Aggregation der Komponenten durch JIP1

  —> JNK induziert vornehmlich Immediate early genes (IEGs) und ERK induziert vornehmlich delayed genes (DG)

• „housekeeping genes“ (reizunabhängig)

• „immediate early genes“ (IEG), z.B. JNK:

  —> Stimulierung innerhalb weniger Minuten

  —> Transkriptionsfaktoren:

  —> Komponenten des TCF-Komplexes (ELK1)

  —> SRF, Jun

• „delayed genes“ (DG), z.B. ERK

  —> Langsame Aktivierung

  —> Aktivierung von Transkriptionsfaktoren aus der IEG-Gruppe über

  Zwischenschritte.

• Ras: Erk-Signalkaskade

• Rac: JNK-Signalkaskade

1. Insulin bindet an den Insulinrezeptor

2. Tyr Reste des Rezeptors werden autophosphoryliert

3. Rezeptor phosphoryliert die Tyr-Reste von IRS-1

4. die SH2 Domäne von Grb2 bindet an P-Tyr von IRS1

5. SOS bindet an Grb2 und dann an Ras und veranlasst so die Freisetzung von GDP und die Bindunb von GTP an Ras

6. Ras bindet an Raf-1 udn aktiviert dieses

7. Raf-1 phosphoryliert Serin Reste von MEK und aktiviert es

8. MEK phosphoryliert einen Thr und einen Tyr-Rest von MAPK (Erk 1/2) und aktiviert es

9. MAPK wandert in den Kern und aktiviert dort durch Phosphorylierung Transkriptionsfaktoren wie Elk 1

10. der phosphorylierte Faktor Elk 1 assoziiert mit SRF, um die Transkription und Translation einer Reihe von Genen anzuregen

    —> für die Zellteilung

• Das Stresshormon Adrenalin bewirkt in Hepatozyten die Freisetzung von Glukose in den Blutkreislauf, um die Energieverfügbarkeit bei Stress zu sichern

• Ist der Blutzuckerspiegel bereits durch Nahrungsaufnahme hoch genug, hat die Insulinwirkung in Hepatozyten Vorrang vor der Adrenalinwirkung

• Durch die Insulin-Signalwege kann der Adrenalinrezeptor gesteuert oder internalisiert werden.

• durch Insulin-Induktion des PI3K-Signalwegs

• Phosphorylierung des Adrenalinrezeptors und nachfolgende Induktion des Ras/ERK-Signalwegs verstärkt das Insulinsignal um das 5 – 10 fache

• Für jede MAPK gibt es besondere regulatorische MKPs bzw. DUSPs, die im Cytoplasma oder nuclear lokalisiert sein können

• MKP = MAPK Phosphatasen

• DUSP = Dual specificity Phosphatasen

• PPTs: Protein Ser/Thr-Phosphatasen

• PTPasen: Protein Tyr-Phosphatasen

• MAPK-Signalwege sind häufig vernetzt.

  —> MKPs bzw. DUSPs steuern MAPK auf unterschiedlichen Ebenen

  —> MKPs und DUSPs steuern MAKP in unterschiedlichen Zellkompartimenten

  —> MKPs bzw. DUSPs werden selber durch verschiedene Prozesse reguliert

• Regulieren Aktivität und intrazelluläre Verteilung von MAPK

• Zeigen Sequenzhomologie

• Unterscheiden sich in:

  —> MAPK-Substratspezifitäten

  —> subzellulärer Lokalisation

  —> Gewebeverteilung

  —> Induzierbarkeit durch externe Stimuli

• wichtig: jede MAPK hat eine eigene DSP Domäne an die die MKPs binden

• Regulation der Transkription und Translation von DUSPs

• Stabilisierung und Aktivierung von DUSPs durch Substratbindung

• Anbindung von DUSPs an Membrane durch Myristoylierung

• Destabilisierung von DUSPs durch Anhängen von Ubiquitinresten

• Aktivierung von DUSPs durch Reduktion katalytischer Cysteine

• Spezifität der MAPK Kaskade

• Dauer und Stärke des extrazellulären Signals

• Interaktion mit Regulatorproteinen

• subzellulare Lokalisation

• Anwesenheit von verschiedenen Isoformen auf jeder einzelnen Stufe

• extensive Vernetzung der MAPK Kaskade mit anderen Stoffwechselwegen

• Genexpression

• Zellzyklus

• Wachstum

• Entwicklung

• Differenzierung

• Motilität

• Apoptose

• Zellantwort

• Deregulationen des ERK1/2 Stoffwechselwegs sind verantwortlich für ~30% aller Krebserkrankungen

• Tumor-relevante Prozesse:

  —> Rezeptorüberexpression

  —> Mutationen im Ras- oder Raf-Gen (z.B. Oncogen B-raf)

  —> Störung von anti-proliferativen Effekten

  —> Förderung von malignen Phänotypen

• Mutationen regulatorischer Proteine des JNK Stoffwechselwegs führen zu Dysfunktion der Apoptoseregulation

• Mutationen der Phosphorylierungsstelle von c-Jun kann aber auch zu einer Reduktion von Tumoranzahl und –größe führen.

• Veränderungen der MKK3 und der MKK6 führen in Zellkulturen zu einem gesteigerten Zellwachstum und zu tumorähnlichen Veränderungen

• die Aktivierung von p38 hat dagegen tumor-suppressive Effekte