Kapitel 2: Vererbung

Gen: spezifischer Abschnitt auf der DNA, der Anweisungen für die Synthese von Proteinen/RNA-Molekülen enthält.

-> Protein kann zur Ausbildung eines spezifischen Merkmals beitragen

Abruf:

• Umschreibung DNA in RNA (Transkription)

• Übersetzung in Proteine (Translation)

  -> Erfolgt durch genetischen Code

  
  

=> Durch Gregor Mendel

• Kreuzungsversuche mit reinrassigen Erbsenpflanzen

  • Reinrassig = homozygot/reinerbig: Gen mit 2 identischen Allelen -> dominant (AA) oder rezessiv (aa)

1) Uniformitätsregel:

Kreuzung zweier homozygoter Pflanzen mit 1x Merkmalsunterschied (z.B. Farbe) -> Nachkommen 1. Generation alle uniform (gleich)

2) Spaltungsregel:

Kreuzung 1. Generation (Aa) -> Merkmalsspaltung in 2. Generation in 3:1 Verhältnis

3) Unabhängigkeitsregel:

Kreuzung von Individuen, die sich in zwei oder mehr Merkmalen unterscheiden -> Verteilung der Allele der Gene unabhängig voneinander + neue Kombination bei Nachkommen, sofern die Gene auf unterschiedlichen Chromosomen liegen

=> Beschreibung durch Watson und Crick im Jahr 1953

• DNA:2x komplementäre Kettenmoleküle zur Doppelhelix aufgewunden

  • Innern: Doppelhelix

  • Außen: Zucker-Phosphat-Rückgrat

  • Konfiguration: B-Form (unter normalen Bedingungen)

    -> B-Form: rechtshändig -> Windungen der Doppelhelix im Uhrzeigersinn

• DNA-Kettenmolekül:lange Kette von Nukleotiden (Bausteine)

• Aufbau Nukleotid:

  • Zucker (Desoxyribose/Ribose bei RNA)

  • Phosphatgruppe

  • Eine der 4 Basen: Adenin, Thymin, Guanin oder Cytosin

    -> Purinbasen: Guanin, Adenin

    -> Pyrimidinbasen: Cytosin, Thymin

• Zusammenhalt:

  • Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Basen

  • Zucker-Phosphat-Rückgrat: Phosphodiesterbindung zwischen Phosphatgruppe eines Nukleotids und Zucker des nächsten Nukleotids

Grundlage: Komplementarität der Basen

1) Initiation der DNA-Replikation: Ori-Komplex

• Startpunkt: Origin of Replication (ORI) -> bestimmte Startpunkte auf DNA (meist AT-reiche Sequenzen) -> leichter zu trennen

• Bindung von Ori-Komplex (6 Proteine bei Eukaryoten) an ORI -> Einleitung

• Entwindung Doppelhelix durch Topoisomerase

2) Auftrennung Doppelhelix nach Bindung des Ori-Komplexes

• Auftrennung Doppelhelix am ORI -> DNA-Helicase -> in 3’ -> 5’ Richtung des Mutterstrangs

• Entstehung Replikationsgabeln -> Synthese der neuen DNA-Stränge

3) RNA-Primer + Rolle DNA-Polymerase alpha

• Primase: Herstellung kurzer RNA-Primer (fungieren als Startpunkt) Einfügen am 3’ Ende des Mutterstrangs

  -> DNA-Polymerase α benötigt kurzen Doppelstrang für Anhaltspunkt -> fügt DNA-Nukleotide ein (ca. 20-30)

• Nach ca. 20-30 Nukleotiden -> Ersetzung der DNA-Polymerase α zu δ/ε

  -> Weitere Synthese der DNA-Stränge

4) Synthese beider Stränge

• Leitstrang: Synthese in Richtung 5’ -> 3’ = parallele Arbeit zur Helicase

• Folgestrang: Synthese in Richtung 5’ -> 3’ (entgegengesetzt zur Helicase)

  • Entstehung Okazaki-Fragmente: kurze DNA-Stücke beginnend mit RNA-Primern

  • Einfügen von DNA-Nukleotiden an RNA-Primer durch Polymerase bis nächstes Fragment beginnt

5) Verknüpfung Okazaki-Fragmente

• Entfernung RNA-Primer und Ersetzung durch DNA durch DNA-Polymerase I

• DNA-Ligase: Verknüpfung einzelner Fragmente zu durchgehenden DNA-Folgestrang

1. DNA-Helicase:

   • Bewegt sich in 3’ > 5’ Richtung entlang des Mutterstrangs und trennt die Doppelhelix auf

2. Wanderung der DNA-Polymerase:

   • Ablesen des Matrizenstrangs in 3' -> 5' Richtung

   • Synthese des neuen Strangs nur in 5' -> 3' Richtung

3. Synthese neuer DNA-Stränge durch DNA-Polymerase:

   • Erfolgt immer in 5' -> 3' Richtung

• DNA wird semikonservativ repliziert

  -> Nach Replikation: Neue Doppelhelix aus 1x alten Strang und 1x neuen Strang

  -> Jeder DNA-Strang der Doppelhelix -> Vorlage für Bildung eines komplementären Strangs

=> Durch Meselson herausgefunden (Experimente mit E.Coli)

Prokaryoten:

• DNA liegt kreisförmig im Nucleoid vor

• Start Replikation: Am ORI (meist nur 1x ORI)

• Verschiedene Replikationsformen: abhängig von Art der DNA

  • Theta-Form: bidirektional (typisch bakterielle Chromosomen)

  • D-Schleife und rollender Kreis: unidirektional (oft bei Plasmiden oder Viren)

• Einleitung neuer Replikationsrunde vor Abschluss der vorherigen

  -> (ermöglicht schnellere Zellteilung)

Eukaryoten (höhere Organismen):

• DNA linear in Chromosomen angeordnet

• Start Replikation: Viele ORIS (Startpunkte)

• Einleitung neuer Replikationsrunde nach Abschluss der vorherigen Runde

• Replikation bidirektional -> Verlauf in beide Richtungen vom ORI aus

  
  

=> Umwandlung der genetischen Information eines Gens in ein funktionelles Protein

Schritte:

1) Transkription (DNA -> mRNA)

• Umwandlung DNA eines Gens in mRNA

• Ort: Zellkern (Eukaryoten); Cytoplasma (Prokaryoten)

2) Translation (mRNA -> Protein)

• Übersetzung der Information der mRNA in Aminosäuresequenz -> Entstehung Protein

• Ort: Ribosomen im Cytoplasma (Eukrayoten und Prokaryoten)

=> Genetischer Code als “Übersetzungsschlüssel”

Genetischer Code: “universal”

• Gruppierung von 3 RNA-Basen = Triplett/Codon -> kodieren für eine Aminosäure

• 64 verschiedene Codons -> die für 20 Aminosäuren kodieren

  -> Einige Aminosäuren werden durch mehrere Codons repräsentiert

  • UUA, UUG -> Leucin

• Startcodon = AUG -> Beginn Translation: gleichzeitig Kodierung für Methionin

• Stoppcodon = UAA, UAG, UGA -> Beenden Translation

1) mRNA = messenger RNA

• Transkription: Umschreibung genetischer Information von DNA in mRNA

• Translation: mRNA -> Übersetzung von Ribosomen in Proteine

• Synthetisierung: von RNA-Polymerase II

2) tRNA = transfer RNA

• Translation: Transportiert Aminosäuren zu Ribosomen

• Synthetisierung: von RNA-Polymerase III

3) rRNA = ribosomale RNA

• Herstellung im Zellkern durch RNA-Polymerase I und III

• Translation: Hauptbestandteil der Ribosomen

  • 4 rRNA-Species: 18S (kleine Untereinheit), 28S + 5,8S + 5S (große Ribosomenuntereinheit)

4) snRNA = small nuclear RNA

• Nach Transkription, vor Translation:

  -> Spleißen der prä-mRNA -> Introns

• Synthetisierung: von RNA-Polymerase II

5) miRNA = micro RNA

• Translation: Binden an mRNA -> verhindern deren Translation in Protein

• Synthetisierung: von RNA-Polymerase II

6) nc-RNA = non-coding RNA -> Moleküle, die nicht in Protein übersetzt werden z.b. miRNA

• Einige ncRNA -> Interaktion mit miRNA -> Blockierung ihrer Funktion

• Synthetisierung: von RNA-Polymerase II

UNTERSCHIED PROKARYOTEN:

-> Alle RNA-Klassen werden von derselben RNA-Polymerase synthetisiert!

Prokaryoten: mRNA, tRNA, rRNA

1) Initiation:

• Bindung an Promotor der DNA-Sequenz (auf Sense-Strang) -> RNA-Polymerase

• Promotor = spezifischer Abschnitt der DNA (Beginn des Gens) -> markiert Beginn der Transkription

2) Öffnung der DNA:

• Trennung der DNA-Doppelhelix -> RNA-Polymerase

• Bildung 2x Einzelstränge (Einer zur Vorlage “Antisense”)

  • Ablesung des Antisense-Strangs in 3’→5’-Richtung

  • Synthese des neuen RNA-Strangs in 5’→3’ Richtung

3) Elongation:

• RNA-Polymerase wandert entlang Antisense-Strang in Richtung 5’-Ende -> synthetisiert mRNA-Strang

• Hinzugabe von komplementären RNA-Nukleotiden

4) Termination:

• Ende Transkription bei Terminationssequenz (Ende des Gens) auf Sense-Strang

• Ablösung RNA-Polymerase und neuer synthetisierter mRNA von DNA

RNA-Prozessierung: sekundäre Nachbearbeitung der prä-mRNA

5) Nachbearbeitung der prä-mRNA:

• Spaltung = Aufteilung in Introns und Exons

• Verspleißen = Entfernung der Introns

• Chemische Modifikation

  • Polyadenylierung: Hinzugabe Kette von Adenin-Nukleotiden an 3’-Ende

  • Capping: Hinzugabe Guanin-Struktur am 5’-Ende

6) Export

• Überarbeitete mRNA verlässt Zellkern durch Kernpore -> Transport in Cytoplasma für Translation

Eukaryoten:

• Jedes Gen besitzt seinen eigenen Promotor und eigenen Terminator

• Keine Operons

• mRNA wird prozessiert (Capping, Polyadenylierung, Spleißen)

• ein mRNA-Molekül codiert i.d.R. nur für ein einziges Protein

Prokaryoten:

• besitzen Operon = Gruppe von Genen, die zusammen als ein mRNA-Molekül transkribiert werden

  • Promotor

  • Operator

  • Strukturgene

  • Terminator

=> Operon besitzt einen einzigen Promotor und Terminator für alle Gene dieser Gruppe

Beispiel:

• Lac-Operon -> drei Gene: lacZ, lacY, und lacA

• Transkription als einzige mRNA -> aber unterschiedlicheÜbersetzung in Proteine

Aufbau Ribosomen:

=> 2 Untereinheiten 60S und 40S

• A-Stelle: Bindungsstelle der tRNA mit nächster AS

• P-Stelle: Halteplatz für tRNA, die wachsende Polypeptidkette trägt

• E-Stelle: Ort, an dem entladene tRNA Ribosomen verlässt

Ribosomenbildung: -> “Initiation”

• kleine Untereinheit bindet an mRNA am Startcodon AUG

• Bindung einer komplementären tRNA mit Anticodon

• Zusammenbau des Ribosoms mit großer Untereinheit

• Wanderung des Ribosoms in 5’ -> 3’ Richtung -> Startcodon rutscht in P-Stelle

  
  

tRNA Aufbau:

• Anticodon-Schleife: 3 Nukleotide, die komplementär zum Codon auf mRNA sind

• CCA-Sequenz am 3’-Ende: Ort, an dem AS an tRNA bindet

• Bindung AS an tRNA -> durch Aminoacyl-tRNA-Synthetase

=> Anticodon Spezifität: Jedes Anticodon ist spezifisch für tRNA

=> Einige tRNAS können mit mehreren Codons interagieren (dritte Base muss nicht streng komplementär sein)

1) Sekundäre Modifikation der Proteine

• Abspaltung einer/mehrerer AS -> damit nicht jedes Protein mit Methionin beginnt

• Synthese vieler Proteine als Vorläufer -> Abspaltung -> aktive Form (Proinsulin -> Insulin)

2) Inhibitoren:

• Puromycin -> Struktur einer tRNA mit AS

  • Einbau -> verfrühter Kettenabbruch

• Cyclohexamid/Chloramphenicol -> Inhibitoren der Peptidyltransferase

1) Initiation = Start der Translation

• Bindung der kleinen ribosomalen Untereinheit an die mRNA

• Bindung der Initiator-tRNA

• Assemblierung des vollständigen Ribosoms

  -> A-, P-, E-Stelle

2) Elongation = Verlängerung der Polypeptidkette

• Wanderung Ribosomen entlang 5’ -> 3’

• Bindung der neuen tRNA an A-Stelle

• Peptidbindung -> Knüpfung AS von P-Stelle zu AS in A-Stelle über Peptidyltransferase

• Entladene tRNA verlässt Ribosomen über E-Stelle

3) Termination = Beendigung der Translation

• Erkennung eines Stopcodons: UAA, UGA, UAG

• tRNA und Ribosomen lösen sich von mRNA

• Freisetzung der Polypeptidkette von Ribosomen

• Ribosomen zerfällt in Untereinheiten

=> Veränderung der genetischen Information (DNA) (VERERBBAR)

• Genmuationen -> in somatischen Zellen und Keimzellen

• Strukturmutationen -> in somatischen Zellen und Keimzellen

• Chromosommutationen -> erfolgt meistens durch Fehler in Meiose bei den Keimzellen

  somatische Zellen mit Mutation -> Trotz Zellteilung bleibt Mutation auf Organismus beschränkt => KEINE Vererbung

• Keimzellen mit Mutation => Vererbung an nächste Generation

Haploider Organismus:

• Direkte Auswirkung auf Phänotyp

  -> Jedes Gen (1x Kopie) -> Kein Ausgleichen durch 2x Kopie

Nachweismethode: Direkte Selektion der Organismen

Diploider Organismus:

• Gen 2x Kopien (auf mütterlichem und väterlichem Chromosom)

• Dominante und rezessive Mutationen

  • Dominant: Auswirkung auf Phänotyp schon bei einer mutierten Genkopie (Allele)

  • Rezessiv: Auswirkung auf Phänotyp erst bei zwei mutierten Genkopien (Allele) -> (Genotyp aa)

Nachweismethode rezessiv: Kreuzungsversuche + molekulare Nachweisverfahren (PCR, Sequenzierung etc.)

Definition:

Zufällige Veränderung der DNA, die durch endogene Faktoren (Innere Prozesse) oder exogene Faktoren (Umwelteinflüse) entstehen.

Ursachen:

• Endogene Faktoren (Innere Prozesse):

  • Fehler in DNA-Replikation

  • Fehler in DNA-Reparaturmechanismen

• Exogene Faktoren (Umwelteinflüsse):

  • Physikalisch:

    • Ionisierende Strahlung (Röntgen-, Gammastrahlung)

    • Hitze

    • Ultraviolettes Licht (UV)

  • Chemische Mutagenzien:

    • Direkt wirkende Mutagene: Ethidiumbromid, 5-Bromuracil (führen direkt zu Mutationen)

    • Indirekt wirkende Mutagene: Alfatoxine/Benzpyren -> nicht mutagen, können aber in mutagene Verbindungen umgewandelt werden

  • Biologisch:

    • Transposonen -> DNA-Abschnitte, die Position im Genom ändern können

    • Retroviren -> Gruppe von Viren mit RNA-Genom

    -> Fügen sich in DNA von Wirtsgenom ein -> Eingriff Genregulation -> Deletionen/Inversionen

Definition:

Veränderung der Basensequenz eines Gens. Betroffen sind einzelne Basen (Punktmutationen) oder Gruppen von Basen (Insertions- oder Deletionsmutationen).

Alle 3 Varianten -> Punktmutationen!

1) Missense-Mutation:

• Austausch einzelner Base -> Einbau anderer AS -> Veränderung Protein

• Folge: Krankheiten wie Sichelzellanämie

2) Neutrale (stumme) Mutation:

• Austausch einzelner Base -> entstandenes Codon, codiert für gleiche AS -> Protein unverändert

3) Nonsense-Mutation:

• Austausch einzelner Base -> Entstehung eines Stoppcodons (UAA, UAG, UGA) -> vorzeitiger Abbruch + verkürztes/nicht funktionelles Protein

Definition:

Veränderung in der Struktur von Chromosomen, ohne die Anzahl der Chromosomen zu beeinflussen.

Entstehung:

• ungleiches Crossing-Over -> Deletion, Duplikation

• Fehlerhaftes Crossing-Over -> Inversion, Translokation

• Fehlerhafte DNA-Reparatur -> Translokation

Varianten:

1) Deletion:

Fehlen eines bestimmten Chromosomenabschnitts

• Nachweis: In Metaphase-Chromosom als Verkürzung

2) Duplikation:

Verdopplung eines DNA-Abschnitts (Vorkommen hintereinander)

• Rolle in Evolution neuer Gene -> Verdopplung eines Gens mit neuer Funktion

3) Inversion:

Drehung eines DNA-Abschnitts innerhalb eines Chromosoms um 180 Grad

• Perizentrisch -> umgekehrter Abschnitt umfasst Centromer

• Parazentrisch -> umgekehrter Abschnitt umfasst nicht das Centromer

4) Translokation:

Austausch von Abschnitten zwischen zwei nicht-homologen Chromosomen (meistens)

• Reziproke Translokationen: beide Chromosomen tauschen Fragmente aus

• nicht-reziproke Translokationen: Chromosom überträgt einen Abschnitt auf ein anderes

5) Transposition:

Bewegung eines DNA-Segments (Transposon) von einer Position im Genom zu anderer Position (innerhalb eines Chromosoms oder zwischen verschiedenen, nicht homologen Chromosomen)

Definition:

Mutationen, die sich auf numerische Veränderungen der Chromosomen beziehen.

1) Euploidie:

• Änderung der gesamten Chromosomenzahl -> Alle Chromosomen in Zelle werden verringert/erhöht

  • Diploidie 2n: normaler Zustand, 46 Chromosomen (23 Paare)

  • Triploidie 3n: Zelle mit 69 Chromosomen -> Ein Paar aus 3x Chromosomen

2) Aneuploidie:

• Änderung der Anzahl einzelner Chromosomen

  • Monosomie: Ein Chromosom eines Paares fehlt -> 45 Chromosomen

  • Trisomie: zusätzliches Chromosom im Paar -> 47 Chromosomen

Auswirkung von Aneuploidie bei Autosomen:

• Autosomale Monosomie/Trisomie -> letal/lebensfähig

  • Trisomie 21: lebensfähig

  • Monosomie 21, Trisomie 13: letal

Auswirkung von Aneuploidie bei Gonosomen (Geschlechtschromosomen):

• weniger schwerwiegender als bei Autosomen -> Dosis-Kompensationsmechanismus sorgt für Abschächung der Auswirkung des zusätzlichen X-Chromosoms

Aneuploidie:

• Triple-X-Syndrom XXX: Inaktivierung 2/3 X-Chromosomen bei Frauen

• Klinefelter-Syndrom XXY: zusätzliches X-Chromosom bei Männern wird inaktiviert

Nondisjunction:

Fehler, bei dem homologe Chromosomen oder Schwesterchromatiden sich nicht richtig trennen.

-> Abnormale Anzahl von Chromosomen in Tochterzelle

Fehler in Mitose:

• Fehler bei der Trennung der Schwesterchromatiden

  -> 47 oder 45 Chromosomen

Fehler in Meiose I:

• Fehler bei der Trennung der homologen Chromosomen

  -> 24 oder 22 Chromosomen

Fehler in Meiose II:

• Fehler bei der Trennung der Schwesterchromatiden

  -> 24 oder 22 Chromatiden

Warum kommt es zur Nondisjunction?

• Alter der Eltern

• Spontane Fehler

• Umweltfaktoren (Strahlung etc.) -> spontane Mutation (Schädigung der DNA)

Zwei Wege:

1) Rückmutation:

• Exakte Rückmutation: Wiederherstellung der ursprünglichen Basensequenz

• Zweite Mutation im gleichen Codon: Einbau richtiger AS ohne Herstellung “ursprünglicher Basensequenz”

2) Suppressormutation: Ausgleich der Auswirkung einer vorhergehenden Mutation

• Intragene Suppressormutation (innerhalb desselben Gens wie Ursprungsmutation)

  • z.B. von Nonsense-Mutation (Stoppcodon -> richtige AS)

• Extragene Suppressormutation (Außerhalb des Gens mit ursprünglicher Mutation)

  • Nonsense-Suppressoren

    • Amber-, Ocker-, Opal-Suppressor -> wandeln Stoppcodons in AS um

Definition:

Neukombination des genetischen Materials (Gene) bei den Nachkommen

Meiotische Rekombination erfolgt auf zwei Wegen:

1) Segregation:

• Zufällige Verteilung der homologen Chromosomen und ihrer Allele auf die Gameten während der Meiose

  • Willkürliche Trennung und Verteilung der mütterlichen und väterlichen Chromosome auf die Tochterzellen

    (Interchromosomale Rekombination)

  • Resultat: Jede Keimzelle -> 1x Allel pro Gen

2) Crossing-Over:

• Austausch von Chromosomensegmenten zwischen homologen Chromosomen

  -> Entstehung neuer Allelkombinationen innerhalb eines Chromosoms (Intrachromosomale Rekombination)

Kopplung:

• Bezieht sich auf Gene, die auf demselben Chromosom (z.b. mütterlichem oder väterlichem) liegen

• Wenn sie nah beieinander liegen auf selbem Chromosom -> gemeinsame Vererbung (Gene sind gekoppelt)

  => Je näher = desto unwahrscheinlicher ist ein Crossing-Over zwischen beiden Genen

Rekombinationswert: in Morgan/Centimorgan

Maß für Häufigkeit von Crossing-over-Ereignissen zwischen zwei Genen während der Meiose

=> Durch Struktur-Mutationen

Z.B. Perizentrische und parazentrische Inversionen:

• Homologen Chromosomen können sich aufgrund der Inversion nicht richtig ausrichten (Fehlpaarung) nicht komplementär -> bilden Inversionsschleife

• Crossing-over innerhalb der Inversionsschleife -> rekombinierte Chromosome mit Deletionen und Duplikationen (nicht funktionsfähig -> werden eliminiert) In Keimzellen

• Crossing-over fehlerhaft

  Segregation: Fehlpaarung der homologen Chromosome könnte dazu führen, dass sie sich nicht gleichmäßig auf Tochterzellen aufteilen (Non-disjunction)

Intrachromosomale Rekombination: Crossing-Over

• Rekombination innerhalb eines Chromosoms

  
  

Interchromosomale Rekombination: Segregation

• Rekombination durch zufällige Verteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen

  
  

Intragene Rekombination:

• Rekombination innerhalb eines einzelnen Gens

  
  

Intergene Rekombination:

• Rekombination zwischen verschiedenen Genen

Ortsspezifische Rekombination:

• Integration von Fremd-DNA (z.b. Virus) an spez. Stelle im Wirtsgenom

• Ungleich zur Transformation, weil Transformation unspezifisch erfolgt an einer Stelle im Wirtsgenom

Transduktion:

• Übertragung von Wirtsgenen durch Bakteriophagen zwischen Bakterien

Definition:

Form der nicht-homologen Rekombination: Änderung der Position von Transposons innerhalb eines Genoms

-> Änderung innerhalb eines Chromosoms oder zwischen nicht homologen Chromosomen

Eigenschaften: Transposons

• Integration ins Wirtsgenom

• Beitrag zur genetischen Vielfalt

• Bildung neuer Gene/Proteine durch Copy-and-paste-Mechanismus

Prokaryotische Elemente:

• Insertionselemente (IS): IS1 von E. coli

  • Transposase -> katalysiert Transposition (nur ein Gen)

  • Cut-and-Paste-Mechanismus

• Komplexere Transposons (Tn): Tn9 bei E. coli

  • wie IS-Elemente, aber mit zusätzlichen Genen, z. B. für Antibiotikaresistenzen

• Bakteriophagen

Eukaryotische Elemente:

• Retroviren: z.B. RSV (Viren mit RNA-Genom)

  • Eindrigen durch Endocytose in Wirtszelle

  • Umschreibung RNA-Genom in DNA

  • Integration Wirtsgenom

• Retrotransposons: z.B. Ty-1 in Hefe (DNA-Abschnitt im Genom)

  • Befinden sich bereits im Wirtsgenom

  • Bei Aktivierung -> Erstellung RNA-Kopie von DNA-Sequenz -> wieder Umwandlung in DNA -> Integration Genom

  • Neue Position im Wirtsgenom

1. Homologe Rekombination (zwischen ähnlichen Sequenzen): -> meiotische Rekombination

   • Crossing-Over -> Intrachromosomale Rekombination

   • Segregation -> Interchromosomale Rekombination

2. Nicht-homologe Rekombination (zwischen unähnlichen Sequenzen):

   • Transposition

Definition:

Einführung von (veränderter) DNA in lebende Zellen, die DNA in ihr eigenes Genom integrieren.

-> Veränderung der genetischen Information -> Verleihung anderer Eigenschaften

Transformationen bei…

Hefe:

• besitzen natürliche Plasmide (2µ-Plasmid) -> doppelsträngiges DNA-Molekül

  • Isolierung aus Hefe und Einbau neuer Spendergene “verändertes Plasmid”

  • Integration in Wirtsgenom oder autonome Replikation in Zelle -> Herstellung von gewissen Proteinen

Maus:

• Retroviren als Vektoren

  • Einbau Spendergen in Retrovirus “in vitro” -> Danach Infektion des Virus mit Zelle

    
    

Definition:

Manipulation von DNA außerhalb lebender Zellen – also in künstlicher Umgebung, wie einem Labor oder Reaktionsgefäß.

-> Isolierte DNA (liegt nicht in Zelle vor)

Zwei Schlüsselkomponenten:

1) Restriktionsenzyme:

• Funktion: Enzyme -> Schneiden DNA an spezifischer Erkennungssequenz “Scheren”

• 2 Typen: Schneiden blunt ends/sticky ends

  
  

2) DNA-Ligasen:

• Funktion:

  • Zusammenfügen geschnittener DNA-Fragmente

  • Einfügen eines DNA-Fragments in Vektor-DNA (wie ein Plasmid)

  
  

Ablauf:

• Isolierung Ziel-DNA aus der Zelle durch Zentrifugation

• Schneiden Ziel-DNA und Vektor mit Restriktionsenzymen

• Zusammenfügen der Ziel-DNA und Vektor mit DNA-Ligasen -> Hybridplasmid

-> in-vivo -> Transformation!

• Einfügen des Plasmids in Wirtszelle

• Selektion und Vermehrung

  -> Durch Selektionsmarker (AB-Resistenz) -> Identifizierung der Zellen, die Plasmid aufgenommen haben

Vorraussetzung: Vorlage des vollständigen Genoms des Organismus

Online verfügbare Genomdatenbanken:

Liefern Informationen…

• Position des Gens

• Anmerkungen zum Gen (Größe, Funktion etc.)

Ablauf:

1) Suche nach Sequenz des Gens in Datenbank

2) Gen gefunden -> Notiz über Größe/Sequenz

3) Isolierung der Ziel-DNA

• Zellaufschluss (Lyse) mit Zentrifugation -> Trennung DNA von Zellbestandteilen (isoliert)

• Entwurf Primer für PCR -> komplementär zu Enden des Gens

• PCR -> Vervielfältigung des Gens

• Restriktionsenzyme -> Schneiden Gen heraus

• Integration des herausgeschnittenen Gens in Vektor (Plasmid) -> in-vitro-Rekombination!!!

Definition:

Überbegriff für alle Verfahren zur gezielten Veränderung von Genen/genetischem Material, um bestimmte Eigenschaften zu erzeugen.

Ein Verfahren der Gentechnologie -> Genklonierung

umfasst…

=> Manipulation der DNA außerhalb lebender Zellen -> In-Vitro-Rekombination

=> Einsetzen veränderter DNA in lebende Zellen mit dem Ziel der Genexpression -> Transformation

Vektor = DNA-Moleküle “Träger”, um eine zuvor isolierte und veränderte DNA in Wirtszelle einzuschleusen

Formen:

• Prokaryoten (Bakterien) = Plasmide -> zirkuläre DNA-Moleküle

• Eukaryoten = virale Vektoren (Retroviren)

Eigenschaften:

• Origin of Replication (ORI) -> sorgt für autonome Replikation des Plasmids in Wirtszelle

• Markergene z.B. AB-Resistenzen -> Ermöglichung der Selektion der Wirtszellen, die Plasmid aufgenommen haben

• Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme -> Für Erleichterung des Einbaus der Ziel-DNA

Prokaryoten:

• Einfachere Genome…

• hauptsächlich einmalig vorkommenden, funktionalen Sequenzen

• Keine oder nur sehr wenig repetitive DNA

  
  

Eukaryoten:

Komplexere Genome aus…

Einmalig vorkommende DNA-Sequenzen:

• entsprechen meist den proteinkodierenden Genen

• etwa 1–2 % des eukaryotischen Genoms

• Bsp: Gene, die Enzyme oder Strukturproteine kodieren

Mittelrepetitive DNA-Sequenzen: mehreren bis hunderten Kopien

• Bsp: tRNA- und rRNA-Gene -> Viele Kopien, weil sie oft gebraucht werden für Zellfunktion

Hochrepetitive DNA-Sequenzen: tausend- bis millionenfache Kopien

• Erheblicher Teil des eukaryotischen Genoms (bis zu 50%)

• Bsp: Satelliten-DNA (in Centromeren und Telomeren) -> Chromosomenstabilität

  
  

Einmalige DNA-Sequenzen -> Protein-Kodierung

Beispiele:

• Hitzeschockgen HSP22 -> Drosophila

• ß-Globin-Gen -> Maus

Aufbau: Bsp: ß-Globin-Gens

5’-Ende des Sense-Strangs: Promotor

• Spezifischer Abschnitt -> Beginn der Transkription

• Promotor enthält…

  • TATA-Box (liegt kurz vor Transkriptionsstart)

    • Erkennungsmerkmal für die RNA-Polymerase II

    • Bindung von Transkriptionsfaktoren -> Komplexentstehung -> begünstigt Aufbrechung der DNA + Anlagerung der RNA-Polymerase

3’-Ende des Sense-Strangs: Terminator

• Spezifischer Abschnitt -> Ende der Transkription

5’-Ende der prä-mRNA: "Schutzkappe" (Cap-Struktur)

• Besteht aus 7-Methylguanosintriphosphat

  • Schutz vor Abbau der mRNA

3’-Ende der prä-mRNA: Polyadenylierung

• Anhängung Poly-A-Schwanz aus vielen Adenin-Nukleotiden

  • (Wenn Signal von AAUAAA erkannt wird)

  • Schutz vor Abbau

  • Stabilisierung der mRNA

Exons und Introns:

• Exons: kodierenden Bereiche eines Gens

• Introns: nicht-kodierende Sequenzen

• Grenze Exon/Intron -> Consensus-Sequenz -> 5’ GU…AG 3’ (Intron)

=> 3 Exons und 2 Introns (ß-Globin-Gen)

Unterschied zu Prokaryoten:

• Keine Introns

• Keine Prozessierung der mRNA -> direkte Nutzung für Translation

• Operon Struktur

Prozess: Verspleißen durch Spleißosom!

=> Beteiligung von 5 RNA-Molekülen (snRNAS) -> U1, U2, U4, U5, U6 = Spleißosom + snRNPs

• Erkennung der Consensus-Sequenz durch Spleißsom -> Schneidet Intron als schleifenförmiges RNA-Molekül (Lariat)

• Verbindung der übrigen Exons

Selbst-Spleißung:

• Tetrahymena (einzelliger Eukaryot)

  -> Selbstständige Spleißung einiger Introns ohne Hilfe von Proteinen

Mittelrepetitiven Gene:

Tandemrepertiert:

=> Gene, die in mehrfachen Kopien hintereinander im Genom angeordnet sind

• Bsp: rRNA-Gene: 18S und 28S-rRNA-Gene -> kodieren für rRNA

Dispersrepetiert:

=> Gene, die in mehrfachen Kopien an verschiedenen Stellen im Genom verteilt sind

• Bsp: tRNA-Gene -> kodieren für tRNA

• z.B. Transposons

Hochrepetitiven Gene: nicht-kodierende-DNA-Abschnitte

• Bsp: Satelliten-DNA = kurze, wiederholende DNA-Sequenzen

• Lokalisation: Centromeren/Telomeren des Chromosoms

• Funktion: Beteiligung an Chromosomenorganisation und Struktur

Allgemeine Mechanismen:

• Dosiskompensation (Inaktivierung des X-Chromosoms)

• Genamplifikation - Erhöhung Kopienanzahl eines Gens

• Genaktivierung durch Strukturveränderung - Umsortierung von Genabschnitten

Regulation auf Transkriptionsebene:

• Regulatorgene + Kontrollelemente

• Signale zur Steuerung der Genexpression

  • Innere Signalsubstanzen: Hormonelle Regulation

  • Äußere Signalsubstanzen: Umweltstress

Inaktivierung DNA-Sequenzen (Verhinderung der Transkription):

• Silencing

  • Silencing schädlicher DNA-Sequenzen:

    • durch Chromatinverdichtung

  • Silencing von Entwicklungsgenen:

    • Durch das Polycomb-System

  • Methylierung der DNA

    • Anhängen von Methylgruppen an Cytosinbasen

      
      

Regulation auf Translations-, und Posttranslationaler Ebene:

• Translation:

  • miRNA

  • Inhibitoren

• Posttranslational: Proteinebene

  • Synthese von inaktiven Vorstufen (Proproteinen)

  • Modifikation: Phosphorylierung etc.

Dosisproportionalität:

Menge des Genprodukts in Relation zur Anzahl der Genkopien

-> Mehr Genkopien → mehr Genprodukte

Problematik:

Frauen: 2 X-Chromosomen -> doppelte Menge an X-chromosomalen Genprodukten

Männer: 1 X-Chromosom

Lösung: Mechanismus der Dosiskompensation

Mechanismus: Inaktivierung eines X-Chromosoms

Ziel: Gleiche Menge an X-chromosomalen Genprodukten bei beiden Geschlechtern

Vorgehen:

• Inaktivierung in früher Embryonalentwicklung

  • Verbleib als Barr-Körper (kondensierter Chromatinkörper)

  • DNA im Barr-Körper als Heterochromatin dicht verpackt

    (Nicht für Transkription zugänglich)

  • XIST-Gen codiert XIST-RNA (lncRNA)

    (Xist-Gen wird auf inaktiviertem Chromosomen aktiviert -> RNA)

  • RNA umhüllt Chromosom und zieht Proteine (Polycomb-System) an, die DNA modifizieren -> Kondensation und Inaktivierung (Polycomb-System wichtig für Inaktivierung für Entwicklung!

Genamplifikation

Definition:

Erhöhung der Kopienanzahl spezifischer Gene im Genom.

Ziel:

Steigerung des Genprodukts (z.b. Protein/RNA), um Bedarf der Zelle zu decken.

Mechanismen der Erhöhung von Kopien:

1) DNA-Replikation

2) Gen-Duplikation durch Transposons

• durch Transposition kann “Transposon” dupliziert und an eine andere Stelle im Genom eingefügt werden

  -> Copy-and-paste-Mechanismus

=> Aktivierung eines Gens kann auf Umlagerung von Genabschnitten innerhalb eines Chromosoms beruhen = somatische Rekombination

Beispiel: Immunglobuline

• Immunglobuline: 3 Segmente (V-, D-, J-Segment)

  • Segmente bestimmen die variable Region des Antikörpers in B-Lymphozyten

  • Umsortierung oder Neuordnung dieser Segmente während Reifung der B-Zellen im Knochenmark

  • Umsortierung notwendig für Produktion und Vielfalt der Antikörper

Variable Region wird durch Gen kodiert (bestehen aus D, J, V-Segment) -> durch Neukombination entsteht neues Gen, dass variable Region des Antikörpers kodiert

Mechanismen zur Genregulation auf Transkriptionsebene:

1) Regulatorgene:

=> kodieren für Transkriptionsfaktoren (Regulatorproteine), die Transkription anderer Gene steuern

Aufgabe der Proteine:

• Bindung an spezifische DNA-Sequenzen nahe am Zielgen (z. B. Promotor) oder entfernt (z. B. Enhancer/Silencer)

• Bindungsmotive (Homeodomäne, Zinkfinger etc. -> strukturelle Bereiche in Protein) innerhalb der Proteine ermöglichen Bindung an DNA-Sequenz

• Aktivatoren = Steigern die Genexpression

  • DNA-Sequenzen wie Enhancer-Regionen (und Promotoren)

  • Erleichtern Anlagerung der RNA-Polymerase

  • Auflockerung der DNA-Struktur -> Chromatinauflockerung

• Repressoren = Hemmen die Genexpression

  • DNA-Sequenzen: Silencer (oder Promotorregionen)

  • Verhinderung der Anlagerung der RNA-Polymerase oder anderer Faktoren

2) Kontrollelemente: Promotor, Enhancer, Silencer

=> DNA-Abschnitte, die Transkription eines Gens beeinflussen

1) Promotor: DNA-Sequenz an die RNA-Polymerase bindet für Transkriptionsstart

2) Enhancer/Silencer: DNA-Abschnitte

• Verstärken/hemmen Transkriptionsaktivität eines Gens durch die Bindung von Regulatorproteinen (Aktivatoren/Repressoren)

Innere Signalsubstanzen: z.B. Hormone -> Intrazelluläre Signalübertragung

• Bsp: Steroidhormon Ecdyson von Insekten

  • Signal (z. B. Ecdyson) bindet an intrazelluläre Rezeptoren in Zelle (gelangt über Diffusion in Zelle)

  • Entstehung Komplex zwischen Hormon und Rezeptor

  • Hormon-Rezeptor-Komplex fungiert als Transkriptionsfaktor -> bindet an DNA, um Gene zu aktivieren

Innere Signale wirken direkt innerhalb der Zelle und beeinflussen die Gene direkt durch die Bindung an Rezeptoren oder DNA.

Äußere Signalsubstanzen: z.B. Hitzeschock -> Extrazelluläre Signalübertragung

• Bsp: Hitzeschock bei Drosophila

  • Hitzeschock führt zu Stressantwort -> löst Signalkaskade aus

  • Verstärkte Aktivierung der Hitzeschock-Gene -> vermehrte Expression von Hitzeschockproteinen

Äußere Signale wirken zuerst außerhalb der Zelle, und ihre Wirkung wird über Signalwege (z. B. über Rezeptoren an der Zelloberfläche) in die Zelle übertragen und beeinflusst dann die Genregulation indirekt.

Silencing beruht auf…

1) Strukturelle Veränderung des Chromatins -> Bildung Heterochromatin

Ziel: Inaktivierung schädlicher DNA-Sequenzen wie Retroviren oder Transposons

Mechanismus: Bildung von konstitutivem Heterochromatin

Chromatinstruktur

• Euchromatin: locker gepackt, für Transkription zugänglich (Gene aktiv)

• Heterochromatin: dicht gepackt, für Transkription unzugänglich (Gene oft inaktiv)

  • Konstitutive Heterochromatin: immer dicht gepackt und inaktiv; enthält zahlreiche Retroviren/Transposons

  • Fakultatives Heterochromatin: Wechseln zwischen aktiv/inaktiv je nach Bedingung; z.B. X-Chromosom

Wie wird Chromatinstruktur verändert?

• Modifikation der Histone -> Beeinflussung der Chromatine (offen/geschlossen)

  • Methylierung:

    • Verdichtung des Chromatins durch Methylgruppen und zur Bildung von Heterochromatin

  • Acetylierung:

    • Lockerung des Chromatins, DNA zugänglicher für die RNA-Polymerase

    • Acetylgruppen neutralisieren -> weniger feste Bindung der DNA an Histone

2) Unterdrückung durch Poly-Comb-System

Ziel: Dauerhafte oder temporäre Inaktivierung von Genen, die in bestimmten Zelltypen oder Entwicklungsstadien nicht aktiv sein sollen

Mechanismus: Modifikation von Histonen durch PRC2 und weitere Kondensation des Chromatins durch PRC1

=> zwei Hauptkomplexe: PRC1 und PRC2

• PRC1: Bindung an die durch PRC2 modifizierten Histone -> weitere Verdichtung des Chromatins (Kondensation)

• PRC2: Durchführung von Histonmodifikation -> Methylierung

3) Methylierung der DNA

Ziel: Inaktivierung von Genen oder DNA-Sequenzen (z. B. schädliche Sequenzen oder nicht benötigte Gene)

Mechanismus: DNA-Methylierung an Cytosin-Basen -> Blockade für Transkriptionsfaktoren

Translationsebene:

1) Mikro-RNAs (miRNAs) oder RNA-bindende Proteine -> gezielte Hemmung der Translation durch Bindung an mRNA

2) Inhibitoren:

• Puromycin = ähnlicher Aufbau wie tRNA

• Cyclohexamid -> Blockierung Bewegung der Ribosomen /Chloramphenicol -> Blockierung Peptidyltransferase

Posttranslationale Ebene (Proteinaktivität):

1) Modifikationen wie Phosphorylierung, Acetylierung:

• Phosphorylierung aktiviert oder inaktiviert viele Proteine/Enzyme

=> Prozess, wie genetische Informationen zu sichtbaren/messbaren Merkmalen führen.

Interne Faktoren - Beeinflussung Phänotyp

• Gesundheitszustand, Alter, Geschlecht

  -> unterschiedliche Genexpression in Geschlechtern

Äußere Faktoren - Beeinflussung Phänotyp

• Temperatur, Nährstoffe, Soziales Umfeld

Penetranz:

Anteil der Individuen mit bestimmter genetischer Mutation, bei denen das assoziierte Merkmal oder Krankheit der Mutation auftritt.

=> “Kommt das Merkmal überhaupt zum Vorschein?”

Expressivität:

Grad, in dem das genetische Merkmal bei einem Individuum ausgeprägt ist.

=> “Wie stark zeigt sich das Merkmal?”

Beschreiben, wie Gene und Merkmale miteinander verknüpft sind.

Pleiotropie:

=> Ein einziges Gen beeinflusst mehrere, unterschiedliche Merkmale

Polygenie:

=> Ein einzelnes Merkmal wird durch kombinierte Wirkung verschiedener Gene beeinflusst

• z.B. Merkmal: Körpergröße -> Beeinflussung durch Zusammenspiel von Genen

Epistase:

Allel von Gen 1 verändert oder überlagert die Wirkung eines Alles eines anderen Gens (Gen 2).

Beispiel: Gen für Fellfarbe mit 2x Varianten (Allelen)

• S = schwarz (dominant)

• s = weiß (rezessiv)

Geschlechtsbegrenzte Mutation:

=> Ausprägung/Auswirkung der Mutation zeigt sich nur bei einem der beiden Geschlechter

-> Ausprägung abhängig von geschlechtsspezifischen Faktoren/hormonellen Unterschieden

• Mutation kann jedoch auf beiden Geschlechtern vorhanden sein

Bsp: Androgenetischer Haarausfall “Männerglatze”

• Männer: hohe Konzentration von Testosteron -> Mutation kann sich stärker auswirken

• Frauen: Niedrige Konzentration -> Wirkung mildern oder sogar verhindern

Geschlechtsgekoppelte Mutation:

=> Mutation, die auf den Geschlechtschromosomen liegen

• Vererbung abhängig, welches Geschlechtschromosom betroffen ist (meistens x-Chromosom)

• Betrifft häufig ein Geschlecht mehr z.B. Männer bei X-chromosomal rezessiven Mutationen wie Rot-Grün-Blindheit

Maternal-Effekte:

=> Einflüsse des mütterlichen Genotyps auf den Phänotyp der Nachkommen, die durch maternale Faktoren (wie mRNA, Proteine, Organellen) im Zytoplasma der Eizelle vermittelt werden.

Bsp: Bicoid-Protein

• Vor Befruchtung: Mutter lagert maternale Faktoren wie Proteine und RNA in das Zytoplasma der Eizelle

• Nach Befruchtung: Spermium bringt wenig mit ins Cytoplasma

• Zygote: Größter Teil des Cytoplasmas stammt aus Eizelle der Mutter, die die maternalen Faktoren enthält, die die Entwicklung des Embryos steuern

Paternal-Effekte:

=> Einflüsse des väterlichen Genotyps auf den Phänotyp der Nachkommen, die durch das Spermium oder Väterliche Faktoren im Erbgut vermittelt werden.

• Seltener: Spermium steuert nur sehr wenig zum Cytoplasma bei

• Ausnahme: Nematoden

=> Vererbung der genetischen Informationen, die sich außerhalb des Zellkerns befinden.

-> Vererbung mitochondrialer und chloroplastärer DNA über Fortpflanzung!

Mitochondrien und mtDNA in der Eizelle:

• Oogenese: Einlagerung von maternalfaktoren (auch Mitochondrien) in Eizelle

• Eizelle etwa 100.000 Mitochondrien

Spermien und ihre mtDNA:

Mitochondrien des Spermiums gelangen entweder gar nicht in Eizelle bei Befruchtung oder werden später abgebaut

Fazit: Gesamte mtDNA der Nachkommen stammt aus Mitochondrien der Mutter

Definition:

Veränderung einzelner Gene oder DNA-Sequenzen in den somatischen Zellen (Körperzellen)

• Ansammlung im Laufe des Lebens und Beteiligung an Entstehung von Tumoren

• Entstehung: Umweltfaktoren (Strahlung etc. oder Fehler in der DNA-Replikation)

Beispiel:

Translokation zwischen Chromosom 9 und 22 -> verändertes “Philadelphia-Chromosom”

• Bildung eines Fusionsgens -> Entwicklung einer unkontrollierten Onkogen-Aktivität

• Folge: Unkontrolliertes Wachstum -> Entstehung von Krebs

Hintergrund:

• Chromosomen-Mutationen (Trisomie/Monosomie) -> können somatische Zellen betreffen (Wirkung auf chromosomaler Ebene)

• Genmutationen -> können somatische Zellen betreffen

Definition:

Umlagerung von Genabschnitten innerhalb eines Chromosoms oder zwischen Chromosomen in den somatischen Zellen (Körperzellen).

• Wichtig bei Immunzellen (B-, und T-Zellen)

Methoden zur Auslösung:

1) Röntgenstrahlung - veraltet bei Drosophila

• Strahlung induziert DNA-Schäden (Doppelstrangbrüche) -> Aktivierung Reparaturmechanismen -> hervorrufen Chromosomenumlagerung

2) Flippase/FLP-System - neu bei Drosophila

• Enzym Flippase (FLP) erkennt spezifische DNA-Sequenzen -> führt gezielte Rekombination zwischen den Stellen durch

3) Cre-Rekombinase-System - Mäusen

• Enzym Cre-Rekombinase (aus Bakteriophagen) tauscht DNA-Sequenzen aus

MHC-Komplex:

Gruppe von Genen, die Proteine (MHc-Moleküle) kodieren, die bei der Antigen Präsentation helfen.

MHC-I-Moleküle:

• präsentieren Antigene, die aus Innerem der Zelle stammen (Proteine durch Virusproduktion im Zellinnern)

  -> Transport Zelloberfläche (z.b. infizierte Zellen) -> Erkennung von T-Killerzellen

MHC-II-Moleküle

• präsentieren Antigene, die aus externen Quellen stammen und von Zelle aufgenommen wurden durch Phagocytose (z.b. Bakterien, Viren)

  -> Transport Zelloberfläche (können Makrophagen sein) -> Erkennung von T-Helferzellen

B-Lymphocyten:

• Antikörper (Immunglobuline) binden ohne vorherige Präsentation von MHC-Komplex an Antigene

T-Lymphocyten:

• Erkennung von Antigenen nur durch vorherige Präsentation von MHC-Molekülen

Immunglobulin (Antikörper):

• Charakteristische Y-Form

• FAB-Region: “Arme des Y” -> enthalten variable Region für Antigen-Erkennung

• FC-Region: “Schwanz des Y” -> mit konstanter Region

  -> Konstante Region: bestimmt Klasse des Antikörpers (lgG, lgA)

• 2 schwere Ketten (H-Ketten) 2 leichte Ketten (L-Ketten)

T-Zell-Rezeptor:

• Alpha-, und Beta-Ketten (2 Polypeptidketten)

• Variable Region von a-, ß-Kette -> Antigen-Bindungsstelle

• Konstante Region von a-, ß-Kette -> Stabilität

Bausteine der variablen Region der Antikörper/Rezeptoren:

• 3 genetische Segmente (V-, D-, J-Segment)

• Somatische Rekombination: Zufällige Neukombination dieser Segmente

  • Enorme Vielfalt an neuen Antikörpern/Rezeptoren

  • Entscheidend für adaptives Immunsystem! -> Reaktion auf unterschiedliche Krankheitserreger