Einführung in die Labordiagnostik

• Ermittlung klinischer Parameter

• Labormedizin = diagnostischs Fachgebiet der Medizin -> Laborparameter müssen immer durch einen Arzt verifiziert werden

• Biologen hauptsächlich für die Bereitstellung der Test und der reibungslose Funktion verantwortlich

• Eine zeitnahe und sichere Bestimmung mit Hilfe von standartisierten Tests ist entscheidend

  -> Erstellung von Verdachts- und Differentialdiagnosen aufgrund der Laborwerte -> Auf Basis dieser, mögliche Veranlassung von Verlaufskontrollen oder Therapien

-> Interpretation von klinischen Parametern immer in Kombination mit der Klinik

-> Grundsärtlich wird im UV/Vis Spektrum gearbeitet

• Bei organischen Substanzen können durch UV/VIS-Spektroskopie nur ungesättigte Systeme angeregt werden.

• Die UV/VIS-Spektroskopie ist also eine Methode zum Nachweis ungesättigter organischer Substanzen.

-> ungesättige Verbindungen sind organisch-chemische Verbindungen, deren Molekülstruktur eine oder mehrere C-C Doppelbindungen oder Dreifachbindungen enthält

Transmission: Der Anteil einer Welle (z. B. Licht, Schall), der ein Medium durchdringt, ohne absorbiert oder reflektiert zu werden. Wird oft als Transmissionsgrad TTT angegeben und in Prozent ausgedrückt.

Absorption: Der Anteil einer Welle, der beim Durchgang durch ein Medium in andere Energieformen, wie Wärme, umgewandelt wird. Der Absorptionsgrad AAA beschreibt den Anteil der absorbierten Strahlung und wird ebenfalls in Prozent angegeben.

Die Lichtdurchlässigkeit oder Transmission (T) nimmt exponentiell mit der Konzentration des Farbstoffs ab

Biuret-Test – Detaillierte Zusammenfassung für Karteikarte

Zweck: Nachweis von Proteinen und Peptidbindungen in einer Lösung.

Prinzip:

• Kupfer(II)-Ionen (Cu2+Cu²⁺Cu2+) reagieren in alkalischem Milieu mit den Peptidbindungen (C=O–NH).

• Es bildet sich ein violetter Farbkomplex, dessen Intensität proportional zur Anzahl der Peptidbindungen ist.

Durchführung:

1. Reagenzien:

   • Biuret-Reagenz (Kupfersulfat (CuSO4)(CuSO_4)(CuSO4​) in NaOH oder KOH).

2. Probenvorbereitung:

   • Proteinlösung in ein Reagenzglas geben.

   • Biuret-Reagenz hinzufügen und vorsichtig mischen.

3. Reaktion:

   • Positive Reaktion: Violette Färbung → Proteine/Peptidbindungen vorhanden.

   • Negative Reaktion: Keine Farbänderung → Keine oder nur sehr wenige Peptidbindungen.

Voraussetzungen:

• Mindestens zwei Peptidbindungen erforderlich.

• Keine Reaktion mit freien Aminosäuren.

Anwendung:

• Nachweis von Proteinen in Lebensmitteln oder biologischen Proben.

• Semiqualitative Analyse der Proteinmenge (bei 540–560 nm messbar).

Limitierungen:

• Keine Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Proteinen.

• Nicht sensitiv bei sehr niedriger Proteinkonzentration (< 0,1 mg/ml).

Zweck: Nachweis und Bestimmung von Harnsäure in biologischen Proben (z. B. Blut, Urin).

Prinzip:

• Harnsäure wird enzymatisch mit Uricase (Harnsäureoxidase) zu Allantoin oxidiert.

• Dabei entsteht Wasserstoffperoxid (H₂O₂).

• H₂O₂ reagiert mit einem Farbstoffsystem (z. B. 4-Aminophenazon und Phenol) zu einem farbigen Produkt, dessen Intensität proportional zur Harnsäurekonzentration ist.

Durchführung:

1. Probenvorbereitung:

   • Blutserum oder Urin als Probe.

2. Reagenzien:

   • Uricase, Farbstoffsystem und Pufferlösung.

3. Reaktion:

   • Enzymatische Oxidation der Harnsäure.

   • Farbentwicklung durch Reaktion des entstandenen H₂O₂ mit dem Farbstoff.

4. Messung:

   • Spektralphotometrisch bei 520–550 nm.

(Normalwerte:)

• Blutserum:

  • Frauen: 2,6–6,0 mg/dl

  • Männer: 3,5–7,2 mg/dl

• Urin: 250–750 mg/Tag

Anwendung:

• Diagnose von Gicht und Harnsäurestoffwechselstörungen.

• Überwachung von Nierenfunktionsstörungen.

Limitierungen:

• Störfaktoren wie Vitamin C (Ascorbinsäure) oder Medikamente können zu falsch niedrigen oder hohen Ergebnissen führen.

Merksatz: "Enzym + Harnsäure = Farbe sichtbar machen."

Zweck: Nachweis und Messung der Lactat-Dehydrogenase (LDH)-Aktivität in biologischen Proben (Blutserum, Plasma, Gewebe).

Prinzip:

• Die LDH katalysiert die reversible Reaktion: Lactat + NAD⁺ ⇌ Pyruvat + NADH + H⁺

• Im Test wird die Umwandlung von Lactat zu Pyruvat oder umgekehrt gemessen.

• Dabei entsteht oder verbraucht sich NADH, das bei 340 nm photometrisch nachweisbar ist.

Durchführung:

1. Probenvorbereitung:

   • Blutserum oder Plasma verwenden (nicht hämolysieren!).

2. Reagenzien:

   • Lactat oder Pyruvat, NAD⁺ oder NADH, Pufferlösung.

3. Reaktion:

   • Die LDH katalysiert die Reaktion in Abhängigkeit von der Richtung.

   • NADH-Änderung wird photometrisch bei 340 nm gemessen.

4. Messung:

   • Absorptionsänderung bei 340 nm entspricht der LDH-Aktivität.

Normalwerte:

• Serum-LDH:

  • Erwachsene: 135–225 U/l (Normwerte können je nach Labor variieren).

Anwendung:

• Diagnose von Zellschäden (z. B. Herzinfarkt, Hämolyse, Lebererkrankungen, Tumore).

• Marker für Gewebezerstörung, da LDH bei Zellzerfall freigesetzt wird.

Limitierungen:

• Erhöhte LDH-Werte sind unspezifisch und müssen mit anderen Tests ergänzt werden.

• Hämolyse der Probe kann zu falsch hohen Werten führen.

Merksatz: "LDH misst Zellzerfall, wenn NADH zeigt's am Schall."

-> Endpunkbestimmung immer komplett ablaufen lassen

-> Koínetik Bestimmung immer im Zeitfenster messen

Zweck: Messung der Aktivität von Enzymen, die an der Reduktion oder Oxidation von NAD(P)H beteiligt sind.

Prinzip:

• Der Test basiert auf der photometrischen Messung der Absorption von NADH oder NADPH bei 340 nm.

• Die Reduktion von NAD(P)⁺ zu NAD(P)H oder die Oxidation von NAD(P)H zu NAD(P)⁺ wird verfolgt.

• Die Absorptionsänderung ist direkt proportional zur enzymatischen Aktivität.

Durchführung:

1. Reagenzien:

   • Substrat der zu testenden enzymatischen Reaktion.

   • NAD⁺ oder NADH (je nach Reaktion).

2. Probenvorbereitung:

   • Enzymprobe wird in einen Reaktionsansatz mit Puffer, Substrat und NAD(P)H oder NAD(P)⁺ gegeben.

3. Messung:

   • Photometrische Messung der Absorptionsänderung bei 340 nm.

   • Die Geschwindigkeit der Änderung entspricht der Enzymaktivität.

Anwendungsbeispiele:

• Untersuchung von Enzymen wie Lactat-Dehydrogenase (LDH), Malat-Dehydrogenase (MDH) oder Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD).

• Stoffwechselanalysen und Diagnostik (z. B. bei Enzymdefekten oder Zellstoffwechselstörungen).

Vorteile:

• Hohe Spezifität für NAD(P)H-abhängige Reaktionen.

• Nicht-invasiv und präzise.

Limitierungen:

• Nur für NAD(P)H-abhängige Enzyme geeignet.

• Störsignale durch andere absorbierende Moleküle möglich.

Merksatz: "340 nm: NADH gibt Signal für Enzymaktivität."

ATP, NAD+ muss neben der Glucose, die in Probe enthalten ist, in den Test zugegeben werden

3.1 Einfach optisch-enzymatischer Test

• Prinzip: Messung der Enzymaktivität bei Reaktionen mit NAD⁺/NADP⁺ als Cofaktor.

• Absorptionsänderung:

• NADH/NADPH (reduziert): 2 Maxima bei 340 & 260 nm.

• NAD⁺/NADP⁺ (oxidiert): 1 Maximum bei 260 nm.

• Messung:

• Absorptionsänderung bei 340 nm im Photometer.

• Berechnung der Substratkonzentration mit dem Lambert-Beer’schen Gesetz.

3.2 Gekoppelter optisch-enzymatischer Test

• Prinzip: Indirekte Messung der Enzymaktivität durch Kopplung an eine Reaktion mit NAD⁺/NADP⁺.

• Beispiel: Glucose-Bestimmung

• 1. Reaktion: Glucose + ATP → Glucose-6-phosphat (Hexokinase).

• 2. Reaktion: Glucose-6-phosphat → 6-Phosphogluconolacton + NADPH (Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase).

• NADPH (bei 340 nm gemessen) ist proportional zur Glucosekonzentration.

• Berechnung: Lambert-Beer’sches Gesetz.

• kommt in jeder Muskelzelle vor

• Beim Herzinfarkt, vermehrter Untergang der von Herzmuskelzellen -> Creatinkinease wird kurzzeitig freigesetzt -> Nachweiszeitraum siehe Folie

• Bei anderen Muskelerkrankungen ebenfalls erhäht, daher kein speziefischer Marker für Herzinfarkt

• erzeugt aus Creatin Creatinphosphat -> Creatinphosphat kann zur ATP Gewinnung genutzt werden, wenn die ATP Speicher verbraucht sind -> ATP Reserve

Zum Nachweis der Creatinkinease Reaktion bedient man sich der Hexokineasereaktion. Die Menge an NADPH Zunahme ist proportional zur Zunahme an CK. Die Messung erfolgt nicht direkt. Wichtig ist das genug Hexokinease und Gluc 6 DH vorhanden sind, um eine ausreichende Geschwindigkeit für die CK Reaktion zu ermöglichen. Messung kann nur erfolgen wenn genug Substrate vorhanden sind und diese noch njcht verbraucht sind

Grundprinzip

• Ziel: Messung der Sauerstoffsättigung (SpO₂) im Blut, basierend auf Lichtabsorption.

• Hämoglobin-Arten:

  • Oxygeniertes Hämoglobin (HbO₂): Absorbiert weniger rotes Licht (ca. 660 nm), erscheint rot.

  • Desoxygeniertes Hämoglobin (Hb): Absorbiert mehr rotes Licht und weniger infrarotes Licht (ca. 940 nm), erscheint bläulich.

Funktionsweise der Pulsoximetrie

• Zwei Lichtquellen:

  • Rotes Licht (660 nm): Stärker von Hb absorbiert.

  • Infrarotes Licht (940 nm): Stärker von HbO₂ absorbiert.

• Messung: Lichtstrahlen durchdringen ein gut durchblutetes Körperteil (z. B. Finger, Ohrläppchen).

  • Ein Sensor misst die Intensität des durchgelassenen Lichts.

  • Berechnung der SpO₂ erfolgt durch Analyse der Absorptionsunterschiede während des Herzzyklus.

Absorptionsspektrum von Hämoglobin

• Wellenlängenbereiche:

  • 600–750 nm: Sichtbares Licht.

  • 750–1000 nm: Nahinfrarot (NIR-Region).

• Sauerstoffsättigung wird durch charakteristische Unterschiede in den Extinktionskoeffizienten von Hb und HbO₂ bestimmt.

Farbindruck des Blutes

• Arterielles Blut (sauerstoffreich): Rot, da weniger rotes Licht absorbiert wird. Bei 900 nm Messung am besten möglich

• Venöses Blut (sauerstoffarm): Bläulich, da mehr rotes Licht absorbiert wird. Bei 700 nm Messung am besten möglich

Anwendungen

• Überwachung in der Intensivmedizin, Anästhesie, und Notfallmedizin.

• Praktisch zur Überwachung bei Atemwegs- oder Herzproblemen sowie während Operationen.

Grenzen und Fehlerquellen

• Bewegungsartefakte: Körperbewegungen können die Messung stören.

• Durchblutungsstörungen: Niedrige periphere Durchblutung beeinflusst die Werte.

• Äußere Faktoren: Nagellack, künstliche Nägel oder Hautpigmentierung können Lichtdurchlässigkeit beeinträchtigen.

• Kohlenmonoxidvergiftung: Falsch hohe SpO₂-Werte durch ähnliche Absorptionseigenschaften von Kohlenmonoxid-Hämoglobin.

Chemische Grundlage

• Häm-Gruppe im Hämoglobin: Bindet Sauerstoffmoleküle, wobei die Farbveränderung des Blutes durch den Sauerstoffbindungszustand beeinflusst wird.

Vorteile

• Nicht-invasiv, schnell und schmerzfrei.

• Erlaubt eine kontinuierliche Überwachung des Sauerstoffgehalts.