Chromatographische Trennmethoden:
Was ist der Unterschied zwischen DAD und UV? Welche Vorteile hat die DAD?
GC welche chemischen Eigenschaften muss eine Substanz haben, um mit FID detektiert werden zu können? 3 Faktoren nennen, die die Signalgröße bei der GC beeinflussen.
UV-Detektor (Single-Wavelength UV- Detektor):
misst die Lichtabsorption bei einer/ wenigen spezifischen Wellenlängen, die vorab eingestellt werden (z.B. 254 nm oder 280 nm)
Wellenlänge MUSS vor der Analyse ausgewählt werden, was die Flexibilität einschränkt.
Arbeitet mit einem Photodioden-Empfänger, der Licht einer einzigen Wellenlänge detektiert.
DAD (Dioden-Array-Detektor):
misst die Absorption von Licht über einen breiten Spektralbereich gleichzeitig (z.B. 190 bis 800 nm)
besthet aus einer Reihe von Dioden, die simultan die Lichtintensität bei verschiedenen Wellenlängen erfassen
-> es wird so ein ganzes Absorptionsspektrum der Substanz aufgenommen.
chemische Eigenschaften bei FID- Detektor: Hitzestabil, brennbar, organisch
Faktoren, die die Signalgröße beeinflussen:
Trägergas
Säulentemperatur
Länge der Säule: je länger, desto bessere Trennung
Anzahl der theoretischen Böden
Konzentration und Volumen der Probe
Vergleiche die im Praktikum genutzten Methoden der HPLC und GC:
HPLC
GC
Trennprinzip
stationäre Phase (Material)
mobile Phase (Aggregatzustand)
Detektion
Cyclodextrine werden manchmal als stationäre Phase für GC eingesetzt
a) Woraus bestehen Cyclodextrine chemsich?
b) Wozu werden sie eingesetzt? Nenne hierzu auch ein Naturstoffbsp.
a) Cyclodextrine = Glucosemoleküle, die mit Kieselsäure modifiziert sind
b)
zur Trennung von Enantiomere und Kontrolle der optischen Reinheit
-> Trennung von Steroiden
-> eingesetzt als stationäre Phase
Über DC, ankreuzen was richtig oder falsch ist:
um einen Extrakt in DCM zu untersuchen braucht man ein polares LM.
um eine bessere Trennung eines polaren Stoffes zu erhalten, muss die Polarität des Fließmittels erniedrigt werden.
Kieselgelplatten werden mit Mangan-haltigen Zinksilicat gemacht, was bei 366 nm leuchtet.
bei einer RP-Platte ergeben unpolare Substanzen hohe Rf-Werte.
eine Kammersättigung führt zur Besserung der Auftrennung und höheren Rf- Werten.
Was ist das für ein Material und für welche Methode wurde es im Praktikum verwendet?
um einen Extrakt in DCM zu untersuchen braucht man ein polares LM. Falsch
um eine bessere Trennung eines polaren Stoffes zu erhalten, muss die Polarität des Fließmittels erniedrigt werden.Falsch
Kieselgelplatten werden mit Mangan-haltigen Zinksilicat gemacht, was bei 366 nm leuchtet. Richtig
bei einer RP-Platte ergeben unpolare Substanzen hohe Rf-Werte. Falsch
-> sie werden damit zwar getestet aber ergeben KEINE hohen Rf- Werte.
eine Kammersättigung führt zur Besserung der Auftrennung und höheren Rf- Werten. Richtig
Kieselgel
stationäre Phase bei GC, HPLC und DC
-> chromatographische Auftrennung von Analyten
Vorteile der Kammersättigung
was ist “reversed Phase” und wozu nutzt man es?
verhindert das Verdampfen flüchtiger Fließmittelkomponenten -> damit die Zusammensetzung des Fließmittels sich nicht verändert.
Bessere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse -> bessere Trennung
unpolare stationäre Phase => modifiziertes Kieselgel
mobile Phase ist polar
wird in der Chromatographie zur Trennung von hydrophoben/unpolaren Analyten verwendet
Bsp. C18-RP
was versteht man unter Tailing? Was kann man tun um es zu verhindern?
nenne 3 Eigenschaften, die ein interner Standard bei der HPLC besitzen muss
Signale kommen verzögert am Detektor an, aufgrund von schlechter Trennung
kommt vor bei Analyten, die saure oder basische Eigenschaften besitzen
kann vermieden werden,
indem Modifier hinzugegeben werden, sodass der Analyt undissoziiert vorliegt
Austauschen der Säule
frisches Laufmittel
Überladung der Probe vermeiden
Kammersättigung bei DC
Ähnliche Polarität/ Eigenschaften wie die zu untersuchenden Substanzen aber andere Retentionszeit
chemisch stabil
darf keine Verunreinigungen enthalten, die die gleiche Retentionszeit wie die zu bestimmende Substanz aufweisen.
a) Welche chem. Eigenschaften muss ein Stoff haben um mit dem FID detektieren zu können?
b) nenne 3 Faktoren die die Signalgröße in der GC beeinflussen
für welche 4 Naturstoffgruppen kann zur Analytik nach AB die GC eingesetzt werden?
a)
C-H-Bindung: mind. eine H- Bindung an C muss vorhanden sein
Flüchtigkeit: die Substanz muss in der Gasphase vorliegen, um in den FID injeziert zu werden.
mobile Phase zu viel bzw. nicht reguliert -> Trägergas
Länge der Säule bzw. Anzahl der theoretischen Böden, je länger desto mehr theoretische Böden (bessere Trennung)
Konzentration der Substanz
Fette
Terpene (ätherische Öle)
Öle
Steroide
Nenne 5 verschiedene Detektoren, die für die HPLC eingesetzt werden. Erläutere ihre Voraussetzungen/ Vorteile
erläutere die unteren Begriffe in Bezug auf die mobile Phase einer DC
Fließmittel
Elutionskraft “Epsilon-Null”
Elutrope Rheie
nenne das Kernstück einer chiralen GC-Säule
UV/Vis
sofern Chromophor vorhanden
DAD
Mehrkanalphotometer -> Messung mehrerer Wellenlängen gleichzeitig
-> gesamtes Absorptionsspektrum des Analyten messbar
-> schnelle Aussage über Identität und Reinheit
!!! UV-CutOFF: zuverlässige Detektion des Analyten erst oberhalb des Cutoffs möglich.
RI = Brechungsindexdetektor
Substanz ohne Chromophor (Zucker, Polyethylenglycole, Polymere)
MS
extrem hohe Empfindlichkeit!
Massenspektren liefern zusätzliche Strukturinformation
hoher apparativer Aufwand zur Kopplung der Geräte
Fließmittel = Träger des Stofftransports über die Sorptionsschicht (stationäre Phase)
Elutionskraft = Maß für die Fähigkeit des Fließmittels Probenmoleküle in der mobilen Phase zu erhalten
Abhängig von einer Vielzahl von Faktoren (Polarität des LM und der stationären Phase, Löslichkeit der Analyten in der mobilen Phase, Temperatur, …)
Elutrope Reihe = empirische Einordnung der LM nach Polarität
Abhängig von verwendeter stationärer Phase
Cyclodextrine
bilden das Kernstück chiraler Kappilarsäuren
Biochemische Versuche:
Welche 3 Voraussetzungen muss ein Plasmid erfüllen, um als Vektor eingesetzt zu werden? (5)
Lückentext zur DNA:
Die DNA- Fragmente wandern wegen der … Ladung des Phosphatesters vom (…) zum (…)- Pol. Die Wanderung der DNA- Fragmente ist in einem bestimmten Bereich proportional zum … der … . Am weitesten wandern die … DNA- Fragmente, da diese durch das Gel wenig … bekommen.
ori = Origin of replcation, Replikationsursprung
geringe Molekülmasse
Polylinker = Restriktionsschnittstelle, die sich überlappen.
autonome Replikation
mindestens ein Selektionsmarker
Die DNA- Fragmente wandern wegen der negativen Ladung des Phosphatesters vom (-) zum (+)- Pol. Die Wanderung der DNA- Fragmente ist in einem bestimmten Bereich proportional zum Logarithmus der Größe. Am weitesten wandern die kleinen DNA- Fragmente, da diese durch das Gel wenig Widerstand bekommen.
Benenne die abgebildete Struktur:
a) Teile die Struktur nach ihren Abschnitten ein und benenne diese
b) nenne ein Makromolekül, in dem diese Struktur vorkommt.
Ein Plasmid hat eine Größe von 4000 bp. Das Restriktionsenzym BamHI schneidet bei 250 bp, EcoRI bei 1500 bp und 2500 bp.
a) Berechne die Fragmentgrößen bei Verdau mit:
BamHI
EcoRI
BamHI und EcoRI
b) Eine Sonde ist komplementät zu der Sequenz 0 bp bis 250 bp. Welche Fragmentgröße wird nachgewiesen bei Verdau 1?
Adenosinmonophosphat
-> bei DNA: Desoxyadenosinmonophosphat
a) Phosphatrest- Zucker- Nukleinbase Adenin
b) RNA (Ribonukleinsäure)
a) Plasmit = Ring
BamHI: 1 Fragmente
EcoRI: 2 Fragmente
BamHI und EcoRI: 3 Fragmente
es bleibt ein Fragment, welches an 250 bp geschnitten worden ist. Das Fragment hat die volle Länge 4000 bp.
-> Sonde ist normal radioaktiv markiert.
Plasmid wird mit Restriktionsenzymem geshcnitten bei:
1) HindIII 2) HindIII + Sal 3) ATG/Ndel + Sall 4) Pstl (unsicher)
-> daneben eine Abbildung der Fragmente auf einem Gel. Fragmentgrößen für 1-4 angeben und in der Abb. die dazugehörige Bande markieren.
Ein lineares Fragment mit der Größe 6 kb weist folgende Restriktionskarte auf:
in wie viele Fragmente wird dieses Stück durch gleichzeitige Spaltung mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI zerlegt? Welche Größen (in kb) weisen diese Fragmente auf?
Hind ist wirkungslos
2 und 5 kb
7,96 kb
Fragment 1: 1,0 kb
Fragment 2: 0,3 kb
Fragment 3: 1,1 kb
Fragnent 4: 1,6 kb
Fragment 5: 0,8 kb
Fragment 6: 1,2 kb
Was ist unten auf der Abb zu erkennen? (war nicht genau diese in der Klausur)
Restriktionsenzyme spalten hydrolytisch an bestimmten palindromischen Sequenzen, wobei 2 unterschiedliche Produkte entstehen können. Die da wären?
Abb von blunt (stumpf) und sticky (klebrig) ends
-> Restriktionsschnittstellen
sticky ends = versetzte Schnittstellen
blunt ends = gerade Schnittstellen
Wahr oder Falsch:
Restriktionsenzyme sind Lyasen
Restriktionsenzyme können nur im Polylinker von Plasmiden schneiden
Restriktionsenzyme sind hitzeempfindlich
taq-Polymerase ist ein Restriktionenzym.
genomische DNA besitzt keine Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme.
Restriktionsenzyme schneiden die WBB zwischen den Basenpaare.
Falsch oder richtig:
Restriktionsenzyme zählen zur Klasse der Hydrolasen.
sie werden auch als Restriktionsendonukleasen bezeichnet, weil sie einzelstränbgige DNA an spezifischen Stellen schneiden.
Als Hydrolysierungssonden können DNA- Fragmente und Oligonukleotide verwendet werden.
Hybridiseirungssonden binden über Wasserstoffbrücken an ihre Zielsequenzen.
Alkalische Phosphatase zählt zu den Lyasen
In der Agarose- Gelelektrophorese laufen DNA-Fragmente als Doppelstrang
-> Falsch: Restriktionsenzyme sind Hydrolasen, keine Lyasen (diese hinterlassen DB). Sie schneiden die DNA an spezifischen Erkennungssequenzen.
Restriktionsenzyme können nur im Polylinker von Plasmiden schneiden.
-> Falsch: Restriktionsenzyme können jede Erkennungssequenz schneiden, unabhäng davon, ob sie sich im Polylinker eines Plasmids oder woanders befindet.
-> Wahr: die meisten Restriktionsenzyme stammen aus Bakterien und denaturieren bei hohen Temperaturen, da sie nicht aus Hitzestabilen Bakterien stammen, sondern aus normalen Bakterien.
-> außer die Taq- Polymerase
-> Falsch: Taq-Polymerase ist eine thermostabile DNA- Polymerase, die in der PCR verwendet wird. Sie sind keine Restriktionsenzyme.
-> Falsch: genomische DNA kann Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme enthalten, da diese auf spezifische Basensequenzen basieren, die überall in der DNA vorkommen können.
Restriktionsenzyme schneiden die WBB (H-Brückenbindungen) zwischen den Basenpaare.
-> Falsch: Restriktionsenzyme schneiden zwischen den Basenpaaren entlang der Phosphordiesterbindungen und trennen somit die DNA-Stränge.
2. nur Doppelstrang
4. keine Klammer, ist vollkommen ok
5. so wie es da steht
Wahr oder falsch
Plasmide sind üblicherweise bei Prokaryoten vorhanden aber auch vereinzelt bei Eukaryoten
Die Konfiguration des Promotors kann über die Funktionalität eines Gens entscheiden.
E.coli kann zur Überexpression bestimmter Proteine verwendet werden.
Geben sie zu den jeweiligen Enzymen die Enzymklassen an:
Aliinase
Catecholoxidase
Restriktionsenzyme
Taq- Polymerase
11.
Plasmide sind üblicherweise bei Prokaryoten vorhanden aber auch vereinzelt bei Eukaryoten -> Wahr
in der Backhefe
Die Konfiguration des Promotors kann über die Funktionalität eines Gens entscheiden. -> Wahr
E.coli kann zur Überexpression bestimmter Proteine verwendet werden. -> Wahr
Aliinase -> Lyase
Catecholoxidase -> Oxidoreduktase
Restriktionsenzyme -> Hydrolase
Taq- Polymerase -> Polymerase
Welche der dargestellten Moleküle können durch Restriktionsenzyme geschnitten werden?
mRNA
tRNA
genomische DNA
Plasmid DNA
PCR
a) Die PCR ist ein Verfahren zur Amplifikation von DNA- Sequenzen. Dafür werden folgende Komponenten benötigt:
DNA- Vorlage
Primer
DNA- Polymerase
dNTPs
Pufferlösung
b) nenne die 3 Schritte eines PCR-Zyklus inklusive entsprechender T in der richtigen Reihenfolge
c) wovon ist die T des zweiten Schritts abhängig?
Restriktionsenzyme können schneiden:
a) DNA-Vorlage:
Template
enthält die zu vervielfältigende Sequenz
Primer:
kurze, einzelsträngige DNA- Stücke, die spezifisch an die Zielsequenz binden.
DNA- Polymerase:
ein Enzym, das die DNA synthetisiert (z.B. Taq-Polymerase)
dNTPs:
desoxynukleosidtriphosphat
die Bausteine für die DNA-Synthese
Puffersysteme:
stellen die optimale Umgebung für die DNA- Polymerase
inklusive Mg2+- Ionen
b) PCR- Zyklus
Denaturierung (95°C)
Annelierung (58/55°C)
Elongation (72°C)
c) T des zweiten Schritts ist abhängig von
T ist Primerabhängig, je nachdem welcher Primer verwendet wird
T richtet sich nach der Zusammensetzung und Länge des Primers
a) wie haben sie im Praktikum doppelstrangige DNA vervielfacht? Gebe 2 Methoden an
b) Wie unterscheiden sich die Methoden grundsätzlich?
welche Eigenschaften muss ein Enzym besitzen, dass bei der PCR genutzt wird?
a) mit PCR und isothermaler DNA-Amplifikation kann doppelstrangige DNA vervielfachte werden.
oder expression mit E.coli Bakterien, nach vollendung der Aufgaben, tötet man Bakterien. (= isothermale DNA- Amplifikation)
bei der isothermalen Amplifikation wird EINE Temperatur verwendet. Keine Zyklen mit unterschiedlicher T nötig.
Enzym für PCR muss:
hitzestabil sein, damit die Aktivität nicht beeinträchtigt wird.
Richtig oder Falsch
Midori Green wird zum Anfärben der DNA im Gel benutzt
Ethidiumbromid interagiert mit Peptidbindungen
Bromphenolblau erhöht die Dichte der Probe
Supercoiled und opencircle DNA werden durch Restriktionsenzyme hervorgerufen
Können Plasmide und DNA in einer Zelle gleichzeitig vorkommen.
wie weist Ethidiumbromid die Banden einer Agarose- Gelelektrophorese nach?
-> Richtig
-> Falsch (zwischen BP =Interkalationsverbindung)
-> Falsch
Da sich EtBr mit DNA verbindet, ändert sich so seine Absorption => interkaliert
lagert sich ein
dadurch erscheinen diese Stellen als helle Banden unter UV-Licht.
Bromphenolblau färbt die DNA- Banden an.
Glycerol ermöglicht das Einpipettieren in die Probentaschen.
Ethidiumbromid interkaliert in den DNA- Strang
Auf einem nativen Agarosegel läuft ein Plasmid immer weiter als Fragmente einer genomischen DNA.
Auf einem nativen Agarosegel wandert DNA vom positiven zum negativen Pol.
nach Laufen der Elektrophorese werden die Banden auf einem Agarosegel mit Comassie-Brilliantblau angefärbt.
RNA kann auf einem Agarosegel mit Ethidiumbromid angefärbt werden.
ein linearisiertes Plasmid, mit EcoRI und HindIII geshcnitten, ist als gamma- Standard verwendbar
auf einem nativen Agarosegel können Cosmide analysiert werden.
-> Falsch: Bromphenolblau ist ein Lauffarbstoff, der zur Sichtbarmachung der Probenmigration während der Elektrophorese dient, färbt aber nicht die DNA Banden.
-> Falsch (Proteinen nicht für DNA)
ein linearisiertes Plasmid, mit EcoRI und HindIII geschnitten, ist als gamma- Standard verwendbar
-> Falsch, gamma- Standard besteht aus DNA des gamma- Phagen
Im Praktikum wurde eine diskontinuierliche Agarose- Gelelektrophorese verwendet.
a) welche 2 Parameter machen die Diskontinuität aus?
b) welche Stoffe dienen zur Denatuierung?
Welche Reagenzien für den jeweiligen Schritt bei der DNA- Isolierung?
Zellwand-Lyse
Auflösung der Cytoplasmamembran
Ausfällung von Proteinen und Proteinbestandteilen
Präzipitation der DNA
a) Porengröße
Sammelgel hat größere Poren und Trenngel ist feinporig
pH- Wert:
Sammelgel geringerer pH (ca. 2 Einheiten geringer)
Trenngel ist alkalisch
SDS = Na-dodecylsulfat
beta-Mercaptoethanol
-> Lysozym
-> SDS- Extraktionspuffer
-> Na-Acetat/Phenol/Chloroform
-> Ethanol, T= -20°C oder Isopropanol bei Raumtemperatur
Wie wird DNA in der Gelelektrophorese denaturiert?
Benenne die Abbildung des Southern Blots (V12 und 13). Die blauen Pfeile zeigen auf blaue Färbung des Gels.
SDS (Na-Dodecylsulfat)
beta- Mercaptoethanol
Hitze (100°C)
Harnstoff
DTT (Dithiothreitol)
Abb der einzelnen Detektions-Komponenten bei der Hybridisierung. Bennene
Wahr/ Falsch
BCIP ist das Substrat der alkalischen Phosphatase.
Bei der SDS- Page kann zur Denaturierung der DNA auf der Membran SDS und Hitze genutzt werden
die endgültige Hybridiseirung wird bei mind. 80°C durchgeführt
das behandeln mit Vorhybridisierungslösung dient der Absättigung von ungesättigten Bindungstellen.
das Backen dient der Denaturierung der DNA.
Die SDS-PAGE ist das gewählte Verfahren zur ANalyse von Plasmiden
-> Falsch, SDS ist zur Trennung von Proteinen
die endgültige Hybridisierung wird bei mind. 80°C durchgeführt
-> Falsch, meistens bei 37- 68°C
-> Falsch, Backen dient der Fixierung auf einer Membran
Die SDS-PAGE ist das gewählte Verfahren zur Analyse von Plasmiden
-> Falsch, SDS- Page dient der Trennung von Proteinen
Im Praktikum wurde 2 Mal das Verfahren Southern Blot angewendet. Erläutere den letzten Schritt (Nur das Prinzip!)
Welche 4 Schritte passieren bei V12 im Hybridisierungsplot
Southern Blot = Nachweismethode, die das Vorkommen eines Gens in Genomen untersucht.
dabei wird das Gen aus Organismus 1 als DNA- Sonde mit der DNA von Org. 2 hybridisiert.
die ausgelöste Reaktion der Sonde ist detektierbar und weist eine Ähnlichkeit/ Homologie auf.
Markierung der DNA- Fragmente mit Digoxygenin => DNA-Sonde
AK (Antikörper) binden an das Digoxygenin
die AK tragen alkalische Phosphatase als Enzym zur Detektionsreaktion
stattgefundene Hybridisierung deutet darauf hin, dass Gensequenzen beider Org. 1 und 2 komplementär zu ihren heterologen Sonden sind.
Membran bei 120°C zwischen 2 Filtern im TK (Trockenschrank) trocknen.
-> Fixierung der DNA auf die Membran
Membran wird mit Hybridisierungslösung angefeuchtet
Membran wird auf Hybridisierungsstab aufgewickelt und in Hybridisierungsröhre gegeben.
Röhre wird mit Hybridisierungslösung befüllt und 1h in einem 37°C temperierten Wasserbad inkubiert.
An welche Substanz in der AK, mit alkalischer Phosphatase, in V12 gekoppelt?
Über welcher Struktur ist diese Substanz an die nachzuweisende DNA gekoppelt
und zu welcher chemischen Gruppe gehört diese?
welche 3 Reaktionen werden bei Southern Blot (V12/14) durch die alkalische Phosphatase angestoßen?
Digoxygenin
über den Linker an DNA gekoppelt
Aglykon
b) alle ???
Zugabe Anti-Digoxygenin-AK gekoppelt mit alkalischen Phosphat
Dephosphorylierung der ersten Substratkomponente BCIP
Redoxreaktion unter Beteiligung der 2. Substratkomponente NBT -> Entstehung von Farbstoffen
Benenne die Struktur, welche Naturstoffklasse gehört es an und wo kommt es vor?
Benenne die beiden Verbindungen und sage zu welchem Zweck sie im Praktikum eingestezt wurden
Naturstoffklasse: Phytosterole
Name: Digitoxigenin, Vorkommen in Digitalis purpurae
SDS =Nadodecylsulfat
zur Denaturierung von Proteinen
Biuret- Komplex = Kupfer- Tartrat-Lösung zur Proteinkonzentrationsbestimmung
nenne 3 Methoden, mit denen der Gehalt an Proteinen bestimmt wurde und beschreibe kurz die Unterschiede.
die SDS-Page ist ein natives Analytik- Verfahren.
Für den Erfolg der SDS- Page darf nicht gekocht werden.
DNA wandert vom Plus- zum Minuspol
Bei der Bradford- Methode erfolgt die Auswertung anhand einer Geradengleichung.
Bei Warburg und Christian wird die Absorption bei 2 Wellenlängen im sichtbaren Bereich gemessen.
Christian-Warburg: bei 2 Wellenlängen, 260 nm und 280 nm. Ist eine ungenaue Methode.
Bradford: Kolorimetrisch, bei 595 nm. Verdünnungsreihe mit BSA- Standard.
Mit Kalibirergerade wird die Konzentration berechnet.
Biuret: Bildung eines Farbstoffkomplexes (blauviolett) zwischen Peptidbindungen und Kupfer-II-Ionen.
-> Falsch: SDS- Page ist ein denaturierendes Verfahren
-> Falsch: das Kochen (ca. 95°C) dient der vollständigen denaturierung der Proteine.
-> Falsch: UV- Bereich!
zeichne schematisch den Graphen des Bakterienwachtums mit Beschriftung der einzelnen Kurvenabschnitte + Achsen.
in welche 2 Klassen werden Lipide nach ihrer Funktion eingeteilt?
Membran-/ Strukturlipide
-> Phospholipide und Glykoside
Speicherlipide
-> Triacylglycerin
a) Was ist Transformation?
b) Beschreibe die 4 Faktoren, die die Transformationsrate beeinflussen
3 Möglichkeiten der Nukleinsäureübertragung bei Bakterien
a) Transformation = kontaktlose Aufnahme von freier DNA in Bakterien
Temperatur
Kompetenzgrad:
optimale Inkubationszeit nach CaCl2- Behandlung
eingesetzte DNA- Menge
Plasmidgröße:
Transformationsrate nimmt mit zunehmender Plasmidgröße stark ab
DNA- Struktur:
supercoloid DNA zeigt höhere Anzahl an Transformationen als open- circular DNA und lineare- DNA
Transformation = Aufnahme von freier DNA (PLasmide) in ein Bakterium/ eukaryotische Zelle
Transduktion = Gentransfer durch Viren/Phagen in eine eukaryotische/ prokaryotische Zelle
Konjugation = Übertragung von Teilen des Genoms von einer Spenderzelle auf Empfängerzelle
Was ist das Blau-Weiß-Screening, um Klone zu unterscheiden? Erkläre
Blau/Weiß Screening zur Identifizierung rekombinanter Klone
a) welches Gen ist hierfür Voraussetzung und welches Enzym wird dadurch exprimiert?
b) wie unterscheiden man rekombinante Klone von nicht rekombinanten?
Prinzip:
1. Vektor mit LacZ-Gen: der verwendete Plasmidvektor enthält das lacZ-Gen, das für die beta-Galactosidase kodiert. Dieses Enzym spaltet Substrate wie X-Gal und führt zur Bildung eines blauen Farbstoffs.
2. Multiple Cloning Site (MCS): Innerhalb des lacZ-Gens befindet sich eine Multiple Cloning Site (MCS), wo Fremd-DNA eingefügt werden kann. Wird ein DNA- Fragment in diese Region eingefügt, unterbricht dies das lacZ-Gen und inaktiviert die Produktion der beta-Galactosidase.
3. Transformation: Bakterien werden mit dem rekombinanten Vektor transformiert und auf einem Agar- Nährmedium ausgestrichen. Das enthält:
-> X-Gal (Substrat der beta-Galactosidase)
4. Farbbildung:
-> nicht- Rekombinante Klone (Plasmid ohne eingefügte Fremd- DNA) produzieren funktionale beta-Galactosidase, die X-Gal spaltet. Diese Kolonien erscheinen blau.
-> Rekombinante Klone (Plasmid mit eingefügter Fremd-DNA): das lacZ-Gen ist inaktiviert, keine beta-Galactosidase wird produziert. Diese Kolonien erscheinen weiß.
a) Gen: LacZ; Enzym: beta- Galactosidase
keine klonierte DNA => blaue Kolonien
-> lacZ Gen ist aktiv, enthalten Galactosidase. Wachsende Bakterien stellen blauen Farbstoff her.
klonierte DNA im Vektor vorhanden => farblose Kolonien
-> lacZ Gen ist INaktiv, da der Leserahmen des alpha- Fragments unterbrochen ist.
-> Bakterien und Plasmide können keinen blauen Farbstoff herstellen.
Bei erfolgreicher Transformation von pUC19 in E.coli-XL1-Blue kommt es bei anschließender Inkubation bei 37°C auf LB-Medium ohne Ampicillin nicht zum Wachstum von Kulturen.
kommt es bei der Transformation von E.coli-XL1-blue mit pUC19 und anschließender Inkubation auf LB- Medium ohne Ampicillin zu Wachstum von Kulturen, ist dies immer ein Zeichen eines Transformationserfolges.
Wurde pUC19 nicht erfolgreich in E.coli-XL1-blue transformation, kommt es auf LB- Medium ohne Ampicillin in der Regel zur Bildung eines Bakterienrasens.
Wurde pUC19 erfolgreich in E. coli-XL1-blue transformatiert, kommt es auf LB-Medium in der Regel zur Bildung eines Bakterienrasens.
Wurde pUC19 nicht erfolgreich in E.coli-XL1-blue transformiert, kommt es auf LB- Medium mit Ampicillin (50 Mikrogramm/ml) i.d.R. zur Bildung eines Bakterienrasens.
Wurde pUC19 nicht erfolgreich in E.coli- XL-1 blue transformiert, werden auf LB-Medium mit Amipicillin (50 mikrogramm/ml) i.d.R. mehr als 100 Kolonien gebildet.
Lückentext zu pUC19
zur Kompetentmachung von E.coli-XL1-blue für die Transformation von pUC19 wird im Praktikum … verwendet. Die angezüchteten Bakterien werden in der … entnommen und ausplattiert. Zu beachten ist auch die Generationszeit von … . Für den Erfolg der Transformation entscheident ist außerdem, dass die gepickten Klone nach dem Bebrüten der Platte mit … behandelt werden. Alternativ kann als physikalische Transformationsmethode die … verwendet werden.
zur Kompetentmachung von E.coli-XL1-blue für die Transformation von pUC19 wird im Praktikum Hitzeschock verwendet. Die angezüchteten Bakterien werden in der log-Phase entnommen und ausplattiert. Zu beachten ist auch die Generationszeit von 20 min. Für den Erfolg der Transformation entscheident ist außerdem, dass die gepickten Klone nach dem Bebrüten der Platte mit Calciumchlorid behandelt werden. Alternativ kann als physikalische Transformationsmethode die Elektroporation verwendet werden.
Fragen zu FR900359
a) Wo entsteht FR900359 und welche Strukturmerkmale hat es?
b) welche Funktion auf molekularer Ebene hat es?
c) Welchen ökologischen Nutzen hat es und welchen pharmazeutischen Nutzen erhofft man sich?
Lückentext FR900359
Candidatus Burkholderia crenata ist ein … … . Es befindet sich in den … von … … . Diese gehört zur Familie der … … . Burkholderia crenata produziert FR900359, war chemsich gesehen ein … … ist. Das besondere ist die … Biosynthese.
es handelt sich um ein zyklisches Depsipeptid
es wird durch Bakterien gebildet und aus Ardisia crenata isoliert
hemmt Gq Protien relativ spezifisch und zelltypenunabhängig durch Konformationsänderung , indem es an die alpha- Domäne bindet und ihre Konformation ändert.
Dissoziation der Untereinheiten alpha-, beta-, und gamma wird verhindert
Signaltransduktion der Gq Proteine wird dadurch verhindert (keine Signalweiterleitung)
c)
vasolaxierende Wirkung -> Durchblutung wird erhöht
bei Atemwegserkrankungen (Asthma, Angina pectoris): Relaxion der glatten Muskulatur
Hemmung der Zellwachstums in Melanomzellen, Hemmung von Melanomzellmigration -> Zytostatikum
dient als Fraßschutz für die Pflanze Ardisia Crenata
Candidatus Burkholderia crenata ist ein symbiotisches Bakterium. Es befindet sich in den Blattknoten von Ardisia crenata. Diese gehört zur Familie der Primulaceae C. Burkholderia crenata produziert FR900359, was chemisch gesehen ein zyklisches Depsipeptid ist. Das besondere ist die FR900359 Biosynthese.
Zu welcher Stoffklasse gehört FR900359?
Aus welchem Organismus wird es gewonnen?
Welcher trägt die Biosyn.-Informationen? Nenne die Organismusgruppe.
3 Wirtszellen nennen, die in der Gentechnik oft verwendet werden und wofür man sie jeweils benutzt.
cyclisches Depsipeptid
Ardisia Crenata (Pflanze)
Bakterien tragen zur Biosynthese bei
E. coli und Candidatus Burkholderia crenata
Bakterien z.B. E.coli
-> Produktion großer Mengen an Insulin
Hefe z.B. Saccharomyces cerevisiae
B-Lymphozyten aus Milz immunisierter Mäuse
-> Produktion großer Mengen spezifischer AK
Last changed13 days ago
