MarcusSS19
Lysozym:
Funktion in Wörtern erklären, Reaktion von Lysozym beschreiben und die Enzymhauptklasse nennen
wie wurden im Praktikum Reinheit, Ausbeute, Funktionalität und Gehalt bestimmt? Alternative dazu
= Muramidase
Lysozym kann die Zellwand von Bakterien auflösen.
hydrolysiert glykosidische Bindungen (Glykosidasen) und zerstört die bakterielle Zellwand -> die Mucopolysaccharide
-> dabei werden die beta-1,4-glykosidischen Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure (MurNAc) und N-Acetylglucosamin (GlcNAc) gespalten.
gehört zu den Hydrolasen = beschleunigt die hydrolytische Spaltung
Praktikum:
Reinheit:
Reinheitsuntersuchung während des Verlaufs aufgenommenen Fraktionen werden durch die Verwendung eine Na-Dodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) erreicht.
Ausbeute und Konzentration/Gehalt:
Proteinkonz. der einzhelnen Konzentrationen durch die Bradford-Methode mit Coomassie Brilliant Blue G-250
durch die bestimmten Proteinkonz. kann der Anteil an Lysozym im Gesamteiweiß errechnet und die Ausbeute angegeben werden.
Aktivitätstest:
wird spektroskopisch durchgeführt
Alternative?
Quelle: V01 Protokoll
SS19
De novo Glykogensynthese
Glykogensynthese läuft über 4 enzymatische Stationen:
-> Synthese von Glykogen im Cytosol
Ausgangspunkt: durch Hexokinase (Muskel und Leber) oder Glucokinase (nur Leber) aus freier Glucose Glucose-6-phosphat gebildet
ATP -> ADP
Tautomerie: durch Glucosephosphat-Mutase zu (isomeren) Glucose-1-phosphat
zunächst die Phosphatgruppe von einem phosphorylierten Serylrest im aktiven Zentrum des Enzyms aus das Substrat übertragen. Entstandene Intermediat Glucose-1,6-bisphosphat gibt die C6-Phosphatgruppe wieder an den Serylrest ab.
mit UDP-Glucose-Pyrophosphorylase zu UDP-Glucose
UTP -> PPi (= 2Pi)
es muss eine aktivierte Form der Glucose entstehen, dafür verknüpft das Enzym den Phosphatrest mit dem alpha-Phosphatrest von UTP. Die beta- und gamma- Phosphatgruppen werden als Pyrophosphat abgespalten.
Produkt: UDP-Glucose besitzt eine glykosidische Phosphoesterbindung mit hohem Gruppenübertragungspot. => aktive Bindung
-> bis hier reversibel
durch Glykogen-Synthase wird Glykogen (n Glucose) mit UDP-Verbrauch zur verlängerten Glykogenkette (n+1 Glucose)
Irreversibel erst durch diese Hydrolyse von Pyrophosphat durch Pyrophosphatase
Komplex 5 aus der Atmungskette:
ATP-Synthase Lokalisation der Bestandteile nennen und Aufbau
Funktion des Komplexes erklären und die ATP-Synthese komplett beschreiben
Komplex 5:
Zahl der Untereinheiten: 16
davon mitochondrial codiert: 2
Funktion: Rückfluss von Protonen; ATP-Synthese
d= 10 nm
der kleinste und effizienteste Motor mit Wirkungsgrad von nahezu 100%
Nano-Rotationsmotor synthetisiert ATP:
Komplex V = ATP-Synthase
-> ist das Schlüsselenzym der mitochondrialen Energiegewinnung
ist ein großer Membranständiger Proteinkomplex (>500 kd)
besteht aus 2 Segmenten: F1-Teil und F0-Teil
-> F1-Teil:
an dem läuft die ATP-Synthese ab
ragt kugelförmig in den Matrixraum hinein
besteht aus 5 Untereinheiten
alpha-3, beta-3, gamma, delta und epsilon
-> F0-Teil:
O = Hemmstoff Oligomycin
ist in die innere Mitochondirenmembran integriert
besteht aus 11 Untereinheiten
davon bilden alpha-1 und c-10 einen zentralen Protonenkanal
beta-2 OSCP1 (oligomycin sensitivity conferring protein) verbindet F1 mit F0
-> Ablauf:
Fließen H+ an einem kritischen Aspartatrest der c-UE vorbei, so lösen sie eine Drehbewegung des c10-Rings (F0) in der mitochondrialen Membran aus
-> zusammen mit Matrixseitiger gamma-delta-epsilon-UE von F1 bildet dieser Ring den Rotor
-> Stator = assymetrisch befestigten UE alpha, beta und OSCP
verhindern das Mitdrehen des alpha3-beta-3-Hexamers
Energie zur ATP-Synthese kommt durch: Rotation der konisch zulaufenden gamma-UE im Zentrum des alpha3-beta-3-Hexamers, die periodisch Konformationsänderungen in den kat.-Zentren an den Grenzflächen der 3 alpha-beta-Dimere bewirken.
-> ATP-Synthese:
ATP-Synthaseaktivität von F1 kat. die stark endergone Synthese von ATP aus Pi + ADP
wird angetrieben durch H+-motorische Kraft des H+-Gradienten über die innere mitochondriale Membran
-> chemische Reaktion zur mechanischen:
durch die mit der Drehbewegung des gamma-Motors eingehende Konformationsänderungen der beta-UE werden fest gebundenes neu synthetisiertes ATP aus seiner Bindungstasche herausgedrückt
->0-Zustand
zweite Konformation schließt H2O aus der Bindungstasche des aktiven Zentrums aus und begünstigt Bildung von Phosphorsäureanhydridbindung zwischen ADP + Pi
-> L-Zustand (die zweite Konformation)
dritte Konformation hat viel höhere Affinität für ATP als für ADP + Pi, daher senkt die Gleichgewichtskonstante der Reaktion auf nahezu 1 -> Substrate + Produkte liegen unter Standardbedingungen nahezu äquimolar vor
-> T-Zustand (dritte Konformation)
=> Proteinumgebung des aktiven Zentrums zahlt energetischen Preis für die Synthese, der dann durch mechanisches Aufbrechen der WW zu Produkt der Reaktion “rückerstattet” wird
=> durch strikte Kooperativität zwischen aktiven Zentren von F1 verhindert einen Leerlauf des Systems bei niedriger ADP-Konzentration
Replikationsgabel zeichnen und mit Enzymen beschriften
Warum gibt es bei der PCR keinen Folgestrang/ Okazaki-Fragmente?
Es waren zwei Sequenzen gegeben, wobei die zweite was mit antiviralen WS zu tun hatte. man sollte erklären wie dieser genau anhand der Oligonukleotidsequenz wirkt.
Klonierung von DNA mit PCR:
PCR = Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
ist die einfachste Art, spezifische DNA- Segmente zu vervielfältigen
Voraussetzung:
Teile der interessierten DNA-Sequenz muss bekannt sein
-> Verlauf:
durch Sequenzinformationen werden 2 DNA-Oligonucleotide von je 15-20 Resten synthetisiert, die jeweils an einen der beiden komplementären Stränge hybridisiert und dabei exakt die DNA-Region begrenzen, die amplifiziert werden soll.
1. Denaturierung:
Reaktionsgemisch auf 95°C erhitzt
2. Annealing:
Abkühlen auf 55°C
Primer binden an die komplementären Einzelstränge und dienen als Starter für die DNA-Polymerasereaktion
3. Polymerasekettenreaktion
Synthese in 5`->3`Richtung, entlang der einzelnen Matrizenstränge
Also:
durch kurzzeitiges Erhitzen (95°C) wird Initialreaktion unterbrochen, die neu gebildetetn Doppelstränge denaturieren
bei T-reduktion (55°C) können große molare überschüssige Primer mit jeweils 2 Strängen (Eltern- und Tochterstrang) hybridisieren
in der zweiten Runde synthetisiert DNA- Polymerase 4 Einzelstränge
-> Denaturierung, Annealing und Polymerase wiederholen sich so lange, bis 20-30 Reaktionszyklen zuende sind => DNA-Segment, das durch Lage der 2 Primer definiert wird, millionen- milliardenfach ampliziert wurde
Problem:
PCR sehr anfällig für kontaminierende DNA
Posttranslationale Modifikationen:
richtig oder falsch zu serinaktiven Proteasen und die Wirkungsweise bzw. welche Enzyme dazu gehören
es war eine Aminosequenz gegeben und anhand dessen sollte man sich AS raussuchen und mögliche Modifikationen erklären
Proteasen:
Unterteilt in: Endopeptidasen und Exopeptidasen
Endopeptidasen spalten innerhalb einer Polypeptidkette
Exopeptidasen an ihren Flanken
4 Hauptfamilien von Proteasen:
-> Unterscheidung durch Katalysemechanismus
Serinproteasen (Trypsin)
Aspartatproteasen (HIV-Protease)
Cysteinprotease (Caspasen)
Metalloproteasen (ACE =Angiotensin- konvertierendes Enzym)
Enzymklasse “Serinprotease”:
-> kat- Reste: Ser, His, Asp
-> typische Vertreter:
Verdauung:Trypsin, Chymotrypsin, Elastase
Blutgerinnung: Thrombin, Plasmin, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor VII
Enzyme der Komplementsysteme: C1r, C1s, C2b, Bb, D
nicht alle Proteasen arbeiten nach dem molekularen Muster der Serinproteasen
Trypsin = Serinprotease/ Hydrolyase:
proteolytische Aktivität von Trypsin (Serinendopeptidase) => Pankreasenzym
katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen innerhalb eines Polypeptids
dabei entstehen Oligopeptide unterschiedlicher Länge
Spezifitätstaschen von Serinprotease:
basischer Rest von Trypsin (Seitenkette) bestimmt die spezifität des Enzyms
Trypsin spaltet hinter basischen AS-Resten
Katalysemechanismus von Trypsin:
aktives Zentrum von Trypsin ist Ser195
Ser195 startet nucleophilen Angriff auf Peptidbindung und transferiert sein Proton auf das benachbarte His57. Positiver Überschuss im Imidazolring von His57 wird dadurch mit negativ geladener Seitenkette von Asp102 kompensiert.
tetraedrischer Übergangszustand:
-> das C-Atom der Peptidbindung nimmt eine tetraedrische Geometrie ein. Im Übergangszustand besitzt der negativ geladene Carbonylsauerstoff das Oxyanion-Loch und bildet 2 H-Brücken mit dem Peptidrückgrad des Enzyms
Acylierungsphase der Proteolyse:
-> der aminoterminale Teil ist kovalent als Ester mit dem Enzym verbunden. Freigesetztes Fragment = dem carboxyterminalen Teil des Substrats, der über einen neu entstandenen freien Aminoterminus verfügt => Aminokomponente
Decylierungsphase der Proteolyse:
-> nucleophile Angriff von Wasser aus das Acyl-Enzym-Intermediat erzeugt einen weiteren tetraedrischen Übergangszustand. His57 unterstützt erst basenkat. diesen Angriff, dann säurekat. die Freisetzung der Acylkomponente. Freigesetztes Fragment = aminoterminalen ABschnitt des Substrats mit neu entstandenen Carboxyterminus => Acylkomponente
-> bei der Trypsinkat. ist die terminale AS typischerweise ein Arginyl- oder Lysylrest
Enzymkinetik:
ein Graph war mit 2 Punkten gegeben, die man so verbinden sollte, damit ein Michaelis-Menthen-Graph entsteht. Vmax und Km ablesen.
Enzymkonzentration bei 0, Schichtdicke der Küvette, Absorptionskoeffizient und Volumen in der Küvette waren gegeben und man sollte Kcat und die Enzymaktivität [U/mg] bestimmen.
-> Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt eine einfache Enzymkinetik
praktisch kann ein Enzym kinetisch bestimmt werden, durch messungen verschiedener Substratkonz. mit resultierender Reaktionsgeschwindigkeit => Substratverbrauch/ Produktzunahme pro Zeiteinheit
dabei wird die Anfangsgeschwindigkeit V0 bestimmt
dazu misst man die Reaktionsgeschwindigkeit in der Anfangsphase der Enzymreaktion
mit Annahme: in dieser kurzen Zeit ändert sich die Substratkonz. nur geringfügig, daher konstant bleibt.
=> die bei verschiedenen Substratkonz. gemessenen Anfangsgeschwindigkeiten werden graphisch zur Sättigungskurve ausgewertet.
Graph = hyperbolishcer Kurvenverlauf. (bsp. O2- Bindungskurve des Myoglobins
Anfangs:
geringe Substratkonz., es findet sich stets ein “freies” Enzym, dabei wird also jedes im aktiven Zentrum eintreffende Substratmolekül umgesetzt
Umsatzgeschwindigkeit steigt fast linear mit Substratkonz.
dann Substratsättigung
Substratmoleküle treffen immer mehr auf Enzymmoleküle, die schon belegt sind.
Reaktionsgeschwindigkeit nähert sich Maximalgeschwindigkeit Vmax an => ist vom Enzym-Durchsatz vorgegeben
=> Michaelis-Menten-Komplex = Enzym mit Substrat bildet einen (allg.) reversiblen Komplex
Aus KOmplex entsteht das Produkt, wobei jeder Teilschritt durch Geschwindigkeitskonstante charakterisiert ist.
k1 = Bildung bzw. k-1 = Zerfall von E + S
k2 = Bildung von Produkt und freiem Enzym E
-> Michaelis-Konstante Km
LDH
es waren 4 Graphen gegeben. Einmal Serum mit und ohne Harnstoff (Probe 1) und (Probe 2) mit und ohne Harnstoff. Man soll erklären was detektiert wird
welche Probe ist normal und welche Probe gehört dem erkrankten Patienten? Man sollte sagen ob Nephro/ Hepato beschädigt ist.
Tripeptid zeichnen Ile-Leu-Trp : Maldi-TOF: Molekülionenpeak 430,26 (monoiso) 431,25 , 432,25 , 433,25 , 453,25 und 454,25 wie kommen diese Zusatnde?
Aussage über erfolgreiche Synthese? Alternative nennen
MS:
Tripeptid zeichnen: Ala- Phe- Ser Molekülionenpeak berechnen
Alle möglichen y- und b- Ionen zeichnen und den Zusammenhang zwischen b- und y- Ion
Datenbank: wie kann man Sequenzen vergleichen?
Funkion und Aufbau von tRNA
DNA- und Proteinsequenzen werden in internationalen Datenbanken (z.B. Genabank) gesammelt
in der “Protein Data Bank” sind die Informationen zur 3D- STruktur von Proteinen abgelegt. In anderen datenbanken werden Proteine nach strukturellen Kriterien klassifiziert
tRNA: 214, 219, 316
= transfer-RNA
etwa die Hälfte der Nucleotide einer tRNA bildet über intramolekulare Basenpaarung eine kleeblattförmige Struktur.
modifizierte Basen sind rot
über weitere H-Brücken entsteht die hakenförmige Struktur der tRNA
-> transfer-Ribonucleinsäuren (tRNAs) besitzen kleeblattförmige Architektur und eine hakenförmige Raumstruktur.
Die Anticodonschleife trägt ein Nucleotidtriplett, das komplementär zum Codon der mRNA ist.
Die invariante, ungepaarte CCA-Sequenz am 3’-En
de eines tRNA-Moleküls wird von einer spezifischen Aminoacyl-tRNA-Synthase in einem zweistufigen Prozess mit der passenden AS beladen.
SS19 2
Enzymhauptklasse benennen und Reaktion aufzeichnen:
Urease
Peroxidase
Phosphoglyceratmutase
Sandwich-ELISA von Insulin
Schema ergänzen
Detektion beschreiben
Alternative mit nur einem Antikörper erklären
man sollte sagen, ob es direkt oder indirekt ELISA ist
Homologe, parologe und orthologe Sequenzen von Proteinen erklären
Diabetes:
Typ 1 und 2 erklären
Insulinrezeptor beschreiben und Funktionen erklären
Wie fördert Insulin die Aufnahme von Glucose in die Zellen?
EInfluss Insulin auf Glykogenolyse
Tandem- MS:
Tripeptid aus Arginin, Glutaminsäure und Phenylalanin:
Sequenz aufschreiben, y- und b-Ionen zeichnen und mit welchem Enzym erfolgt die Spaltung
Km Konstanten von 2 Enzymen vergleichen.
Ist Km ein absolutes Maß für die maximale Reaktionsgeschwindigkeit? Beurteile die Aussage
Wie kann man bei maximaler Substratkonzentration die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen?
Enzyme:
Unterschied zwischen Phosphorylierung und phosphorlytischer Spaltung anhand von Glykogenolyse erklären
Stoffwechel:
2 Stoffwechselwege nennen, in denen alpha-Ketoglutarat vorkommt und Ausgangsstoffe der Stoffwechelwege nennen.
3 Reaktionen mit alpha- Ketoglutarat und Produkte nennen
Transkription:
Transkriptionsblase und Promotor definieren
in welche Richtung erfolgt die Transkription
DNA- Protein- WW erklären mit 2 Bsp.
Definiere
3 Bsp. erwähnen
WIe ist CDK-4 modifiziert?
Fettsäuresynthese- Schlüsselreaktion:
Warum Malonyl-CoA?
Wofür Cofaktor (Biotin) und in welchen Reaktionen kommt diese vor? Erkläre den Mechanismus.
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