Schallmey

Metagenomics = genomic/functional analysis of whole microbial DNA directly isolated from environmental samples

Vorteil: keine Notwendigkeit der Kultivierung -> über 90 % der Mibis können nicht in Reinkultur kultiviert werden

• Functional Screening über Selektion und Zellsortierung (Methoden mit hohem Durchsatz benötigt) !ermöglicht Finden völlig neuer Enzymaktivitäten!

Database mining = Homologiesuche in Sequenzdatenbanken

• high-copy number plasmids

• Cosmids und fosmids

• Bacterial artificial chromosomes (BACs)

• distance-based methods: Distanz zwischen jedem Paar an Sequenzen in Alignment wird berechnet und in distance matrix zsm.gefasst

• character-based methods: Simultaner Vergleich von allen Sequenzen in einem Alignment in Bezug auf 1 character (a site in alignment) at a time to calculate a tree score; Vergleich aller möglichen trees

• erleichterte Abtrennung vom Produkt

• Stabilisierung des Enzyms (Lagerfähigkeit, Prozessstabilität)

• einfacherere Handhabung (größere Partikel)

• erleichterte Rückgewinnung & Wiederverwendung (Kostensenkung)

• bei Konti-Kultivierungen zwingend notwenig

• verbesserte Raum-Zeit-Ausbeute (Konzentrierung des Enzyms)

1. Trägerbindung

   a) nicht-kovalente Bindung (reversibel)

   b) kovalente Bindung (irreversibel, teilweise Aktivitätsverlust durch sterische Hinderung -> Spacer)

   c) anorganische Trägermaterialen z.B. Silikate, Glasperlen,Kieselgur

   d) Organische trägermaterialien z.B. Cellulose, Agarose, Polyacrylat, Polypropylen

2. Einschlussverfahren

   a) Netzwerkbildung von monomeren Molekülen (z.B. radikalische Polymerisation von Acrylat und Acrylamid)

   b) Netzwerkbildung durch Quervernetzung polymerer Moleküle (z.B. Agar, Gelantine, Pektinate,Alignate,Silikone)

   c) Einschluss in Membranen über membrankapseln oder Membranreaktor (homogene Katalyse!)

Enzymeinschluss möglich im Suspensionsverfahren oder Eintropfverfahren.

1. Trägerfreie Vernetzung

   a) CLEC = cross-linked enzyme crystals -> Enzymkristallisationm + kovalente Quervernetzung

   b) CLEA = cross-linked enzyme allignate -> Präzipitation unter Erhalt der Enzymstruktur + kovalente Quervernetzung

= Umwandlung eines Enzyms vom löslichen in den unlöslichen Zustand

Homogene Katalyse: gelöstes Enzym

Heterogene Katalyse: immobilisiertes Enzym

1. Verringerung der Enzymaktivität

   • geringere Flexibilität

   • teilweise Entfaltung

   • Behinderung des Substratzugangs durch zu hohe Enzymdichte oder Orientierung des aktiven Zentrums zum Träger

2. Änderung der katalytischen Eigenschaften

   • Veränderung der Ladung bzw. Ladungsverteilung im Enzym durch WW mit katalytisch nciht aktivem Material

   • “Verzerrung” der Enzymstruktur

3. Limitierung des Stofftransports

   • verminderte Reaktionsrate durch eingeschränkte Versorgung der Enzyme mit Subtstrat

   • Diffusion zum Partikel hin abhängig von Funktionalität bzw. Eigenschaften des Trägermaterials

   • Diffusion innerhalb des Partikels abhängig von partikel-u.Porengröße

1. Oxidoreduktasen: Oxidations-Reduktionsreaktionen

2. Transferasen: Übertragung funktioneller Gruppen

3. Hydrolasen: Hydrolyse mithilfe von H2O

4. Lyasen: Addition/Eliminierung kleiner Moleküle an eine DB

5. Isomerasen: Isomerisierungsreaktionen z.b. Racemisierung, Epimerisierung,…

6. Ligasen: Bildung/Spaltung von bindungen unter gleichzeitiger Triphosphatspaltung

1. Esterhydrolyse

2. Veresterung

3. Umesterung

1. kinematische Racematspaltung

   • ein Enantiomer wird deutlich schneller umgesetzt als das andere, man erhält daher maximal 50% enantiomerreines Pro-Ent-1 und maximal 50% enantioreines Sub-Ent-2

2. dynamisch kinetische Racematspaltung

   • wie kinematische Racematspaltung mit gleichzeitige Racemisierung (Sub-Ent-2 wird zu Sub-Ent-1), maximal 100% enantioreines Pro-Ent-1

3. enantiokonvergentes Verfahren

   Einsatz 2er sich ergänzender Enzyme, wobei A Sub-Ent-1 umsetzt (Retention) und B Sub-Ent-2, maximal 100%

• max. Ausbeute jedes Enantiomeres auf 50% begrenzt

• meist nur 1 Enantiomer gewünscht, das andere abfall

• Trennung von gewünschtem und ungewünschtem nötig

• optische Reinheit häufig nicht perfekt

= Organische LSM, Ionische Flüssigkeiten, stark eutektische Lösungen, überkritische Flüssigkeiten und lösungsmittelfrei

• Verbesserung der Löslichkeit unpolarer Substrate/Produkte

• Verschiebung von Reaktionsgleichgewichten

• Erleichterung des Downstream Processing über 2-Phasensystem

• Veränderung der enzymatischen Eigenschaften (medium engineering)

Nachteile:

• häugif deutlcih reduzierte Aktivität der Enzyme

• Massentransferprobleme (heterogene Katalyse auch ohne Enzymimmobilisierung)

• Kosten

• Toxizität/Umweltschädlichkeit

Bestimmung der Polarität (wassermischbar vs. nicht-wassermischbar) über das log P Konzept:

Beispiele: Ethanol, Aceton, DMSO (komplett wassermischbar), propanol (teilweise mischbar), Toluol (gering mischbar), Diphenylether, Octan (nicht wassermischbar)

• Stabilität

• Aktivität

• Enantioselektivität

Kombination zb. 2er bei raumtemperatur Feststoffe, die bei Mischung als Ganzes flüssig sind (meist ein Ammoniumsalz und ein org. Wasserstoffbrückendonor)

Eigenschaften:

• deutlich günstiger herstellbar als ionische Flüssigkeiten

• nicht brennbar

• kaum messbarerer Dampfdruck

• nicht wassermischbar

• meist umweltfreundlich & biol. Abbaubar

• physikalisch-chem. Eigenschaften weniger variierbar

flüssige Salze (bei Temperaturen unter 100 °C), Salze mit niedrigem Schmelzpunkt, Zusammengesetzt aus sperrigen org. kationen und schwach kooridinierenden Anionen

• kaum messbarer Dampfdruck

• nur schwer entzündlich

• über breiten Temperaturbereich thermisch stabil

• meist gesundheitsschädlich & umwelttoxisch

Anwendungen:

• als eine reine ionische Flüssigkeit z.B. für Lipase-katalysierte Estersynthese

• als Cosolvens im Gemisch mit Wasser z.B. für Erhöhung der Löslichkeit von Substraten

• als 2-Phasensystem mit Wasser

thermodynamischer Zustand eines Stoffes oberhalb des kritischen Punktes, gekennzeichnet durch Angleichen der Dichte von flüssiger und gasPhase, die Unterschiede der Aggregatzustände verschwinden

Eigenschaften:

• physikalische EIgenschaften zwischen Gas und Flüssigkeit (variable Dichte, geringe Viskosität)

• verbesserter Massentransfer im Vergleich zur Flüssigkeit

• Eigenschaften lassen sich über Druck und Temperatur einstellen -> höhere Dichte verbessert meistens Löslichkeit

• leichte Abtrennung des überkritischen Fluids durch Druckerniedrigung (Vorteil im Downstream)

oft CO2 z.B. bei entkoffiniertem Kaffe

Kombination mehrerer Reaktionsschritte in einem Reaktionssystem (Ein-Topf-Reaktion) ohne Aufarbeitung von Reaktionsintermediaten

• linear

• zyklisch

• orthogonal

• parallel, verknüpft

simultan: alle Katalysatoren und Regaientien der Kaskadenreaktionen befinden sich bereits von Beginn an im Reaktionsgefäß -> Reaktionsschritte der Kaskaden laufen gleichzeitig ab

sequentiell: Einzelne Katalysatoren und/oder Reagentien der Kaskade werden erst später zugegeben -> zeitliche Trennung einzelner Reaktionsschritte

Vorteile:

• Erhöhung der GEsamtausbeute

• Zeiteinsparung

• Ressourceneinsparung

• weniger Abfall

• Möglichkeit zur Verschiebung der Reaktionsgleichgewichte

• instabile Reaktionsintermediate können direkt weiter umgesetzt werden

Herausforderungen:

• Reaktionsbedingungen aller Schritte müssen kompatibel sein

• Inhibition/Inaktivierung einzelner Katalysatoren durch Substrate/Produkte anderer Reaktionsschritte möglich

• unterwünschte Nebenreaktionen

• Kompatibilitätsprobleme zwischen chem. und enzym. Katalysatoren, Lösungsansatz: sequentielle Kaskaden oder kompartimierung

• High fructose corn syrup

• ß-Lactamantibiotika

• Fettsäureester

Physikalisch: Adsorption, Membraneinschluss, Geleinschluss

Chemisch: kovalent, crosslinking, Interprotein

• elektrochemisch

• elektrisch

• massensensitiv

• optisch

• thermisch

• magnetisch

• Sensitivität: bestimmt untere und obere Nachweisgrenze sowie Messgenauigkeit (Auflösung)

• Selektivität

• Stabilität: Zeitspanne, in der Biosensor unter gleichbleibenden Bedingungen konstantes Signal liefert

• Ansprechzeit: zeitspanne, die benötigt wird, bis das Signal einen stabilen Entwert erreicht

• Einsatz & Aufbau: Kompaktheit, Robustheit, Benutzerfreundlichekt, Produktsicherheit, Betriebskosten

Amperometrie: Stromänderung/Stromfluss

Potentiometrie: Spannungsänderung