MULLER
Alpha Fold und Nobelpreisträger
KLAUSURFRAGEN
Wir starten diesen Teil damit, wer alles schon etwas Wichtiges zum Protein-Design beigetragen hat. Eine relevante Prüfungsfrage, die fast jedes Mal gestellt wird. Wer erhielt 2018 den Nobelpreis in Chemie? Die Antwort Francis Arnold, George Smith und Sir George R. W. Winter. Der Nobelpreis in Chemie 2018 wurde geteilt und eine Hälfte ging an Francis Arnold for the directed evolution of enzymes. Und die andere Hälfte ging an George Smith and Sir George R. W. Winter für den Phagendisplay.
Frage 8 (diese Frage habe ich 2019 gestellt)
Wofür erhielten Frances Arnold, Gregory Winter und George Smith 2018 den Nobelpreis für Chemie (einfach nur ‚Proteindesign‘ als Antwort genügt nicht)? (2018 auch)
Zusatzfrage, wer erhielt den Nobelpreis 2024?
Der New Kid on the Block und wie sollte es anders sein? KI spielt auch hier eine Rolle, und zwar als das Programm AlphaFold. Das war zu der Zeit, wo Ritchie gesagt hat, es gäbe ein Programm, das die Faltung von Proteinen genau vorhersagen kann, und ich habe widersprochen.
Und was kriegen wir jetzt bei AlphaFold? AlphaFold bekommt von uns eine Aminosäurensequenz. Und es bastelt uns daraus das gefaltete Protein. Wir sehen hier in blau den Wert des pLDDT, also die Vertrauenswerte. Sind die Vertrauenswerte blau, können wir davon ausgehen, dass diese Faltung sehr wahrscheinlich zutreffen wird. Gelbe oder orange Bereiche haben einen niedrigen Vertrauenswert. AlphaFold kann uns außerdem eine Struktur für die Untereinheiten vorschlagen und gibt uns einen Align Error Plot. AlphaFold kann nur Vorhersagen treffen. Und diese Vorhersagen können durchaus mal falsch sein.
Die Antwort Francis Arnold, George Smith und Sir George R. W. Winter. Der Nobelpreis in Chemie 2018 wurde geteilt und eine Hälfte ging an Francis Arnold for the directed evolution of enzymes. Und die andere Hälfte ging an George Smith and Sir George R. W. Winter für den Phagendisplay.
Muller hatte es bereits vorhergesagt, dass David Baker eines Tages den Nobelpreis bekommt. Im Jahr 2024 war es soweit. Der Nobelpreis in Chemie 2024 wurde geteilt. Eine Hälfte an David Baker "for Computational Protein Design" und die andere Hälfte ging an John Champer und Demis Hassabis für "Protein Structure Prediction".
Proteine sind nur marginal stabil
Kommen wir so zu einer wichtigen Erkenntnis, Proteine sind nur marginal stabil. Von den entsprechenden Prüfungsfragen 1 bis 3.
ΔG (freie Enthalpie / Gibbs-Energie):
Gibt an, ob ein Prozess freiwillig abläuft.
ΔG < 0 → Prozess läuft freiwillig ab (thermodynamisch günstig).
ΔG > 0 → Prozess läuft nicht freiwillig ab (thermodynamisch ungünstig).
ΔH (Enthalpieänderung):
Gibt die Wärmeaufnahme oder -abgabe an.
ΔH < 0 → exotherm (Wärme wird frei).
ΔH > 0 → endotherm (Wärme wird aufgenommen).
In Proteinen: Faltung führt meist zu einer Abnahme der Enthalpie durch Bildung von Bindungen (z. B. Wasserstoffbrücken).
T (Temperatur):
In Kelvin. Je höher die Temperatur, desto mehr Einfluss hat der Entropiebeitrag TΔST\Delta STΔS.
ΔS (Entropieänderung):
Misst die Unordnung.
ΔS > 0 → Unordnung nimmt zu.
ΔS < 0 → Ordnung nimmt zu.
Bei Protein-Faltung: Der gefaltete Zustand ist geordneter, also ist ΔS oft negativ.
Für die Faltung von einem Protein bedeutet das, ist ΔG positiv, muss ich Energie aufbringen, um einen Prozess in Gang zu bringen. Ist ΔG negativ, ist der Energiegehalt des gefalteten Proteins niedriger als der des ungefalteten Proteins.
Schauen wir uns darum mal beide Prozesse im Genauen an.
Zuerst schauen wir uns den Prozess eines ungefalteten Proteins zu einem gefalteten Protein an. Dabei ist Delta G dann definiert als G gefaltet minus G ungefaltet.
dG= Ggefaltet-Gungefaltet = dG<0 -> dG ist negativ und in einer energetisch günstigeren Position
In diesem Fall erwarten wir einen negativen Wert für Delta G, für ein stabil gefaltetes Protein. Das bedeutet, das Protein, das zu einem ungefalteten Zustand kommt und sich in ein gefaltetes Protein zusammenfaltet, geht in eine energetisch günstigere Haltung. Schauen wir uns das mal an.
Schauen wir uns im Anschluss den zweiten Fall an. Ein gefaltetes Protein zu einem ungefalteten Protein. Dann ist Delta G definiert als G ungefaltet minus G gefaltet.
dG= Gungefaltet - Ggefaltet = dG>0 -> dG ist postiv, für diesen Prozess brauchen wir Energie
In diesem Fall erwarten wir einen positiven Wert für das Delta G. Sie müssen Energie aufbringen, um das Protein aufzufalten. Deshalb erwarten wir hier auch einen positiven Wert für Delta G, für den Fall eines stabil gefalteten Proteins.
Frage 1
a) Was sagt ein positiver ∆S-Wert über die Stabilität eines Proteins aus? (Übergang ungefaltetes Protein zu gefaltetem Protein; ∆S = S(folded) - S(unfolded)) (KLAUSUR 2020)
b) Warum sind natürliche Proteine nur marginal stabil? Welche Vorteile bieten marginal stabile Proteine? (KLAUSUR 2020/ 2022 unter Hinweis dG, dH ect einzubeziehen)
c) Wie wirkt sich die Entropie nach Bildung eines Proteins an Ribosomen auf die Faltung aus? (KLAUSUR 2022)
Frage 2
a) Was sagt ein positiver ∆G-Wert (Übergang ungefaltetes Protein zu gefaltetem Protein; ∆G = G(folded) - G(unfolded)) über die Stabilität eines Proteins aus?
b) In welchem Zusammenhang stehen die kleinen negativen ∆G-Werte, welche üblicherweise bei natürlichen Proteinen beobachtet werden, zur Schwierigkeit Proteine zu designen?
Frage 3:
a) Proteine sind nur marginal thermodynamisch stabil: ΔG (DeltaG) ist immer klein. Nennen Sie einen Grund warum diese Eigenschaft für natürliche Proteine vorteilhaft ist/sein kann.
b) Proteine sind nur marginal thermodynamisch stabil: ΔG (DeltaG) ist immer klein. Nennen Sie einen Grund warum diese Eigenschaft ungünstig für das Proteindesign ist.
∆G = ∆H – T ∆S - ∆G = Immer kleiner Unterschied zwischen den großen Werten ∆H und T∆S ∆H und T∆S > 100 kcal/mol ∆G typischerweise 5 bis 15 kcal/mol - Entropie - Enthalpie – Kompensierung bewirkt, dass ∆G immer relativ klein ist
Proteine müssen einem bestimmten Turnover unterliegen Inhärente Flexibilität wichtig für die biologische Funktion Enzyme => Induced Fit Konformationelle Änderungen während der Protein-Protein-Erkennungsprozesse
Ein ungefaltetes Protein geht in den Zustand eines gefalteten Proteins über. Das heißt, ich schaue mir Delta G ist gleich G gefaltet minus G ungefaltet an.
Delta G müsste also negativ sein, damit sich das gefaltete Protein in einer energetisch günstigeren Position befindet als das ungefaltete. Ist Delta G hier positiv, bedeutet das, dass das Protein instabil ist.
einzelne Mutationen können dG verändern und Protein bevorzugt entfaltung
Faltung energetisch nur kanpp beborzugt
zu starke Stabilisierung kann Funktion einschränken
Strukturen sind konservierter als Sequenzen
Kommen wir damit zu dem wichtigen Satz, Strukturen sind mehr konserviert als Sequenzen und der entsprechenden Prüfungsfrage Nummer 4 & 5.
Strukturen sind konservierte Adsequenzen. Wie kann man das messen? Wir können das messen durch eine Root-Mean-Square-Deviation. Also wir legen die Strukturen übereinander und schauen, wie weit sie voneinander abweichen.
So können wir z.B. sehen, dass die Strukturen von Myoglobin und Hämoglobin relativ ähnlich zueinander sind.
Frage 4 & 5: Strukturen sind stärker konserviert als Sequenzen. Bitte erklären Sie welche Möglichkeiten dies für folgende Prozesse eröffnet (2019)
a.) für die natürliche Evolution von Proteinen.
b) für die Entwicklung von Inhibitoren gegen das neue SARS-CoV-2 Virus.
c) für das Proteindesign (1,0 P)
Frage 5: Strukturen sind stärker konserviert als Sequenzen. Bitte erklären Sie welche Möglichkeiten dies für folgende Prozesse eröffnet (2019)
Na gut, die Folien sind inhaltlich dazu ein bisschen rar zu den Fragen, aber wir glauben uns hier ein bisschen was zusammen. Strukturen sind stärker konserviert als Sequenzen.
-> funktionserhalt trotz Mutationen
Für die natürliche Evolution von Proteinen hat das zur Folge, dass vor allem der Funktionserhalt gewährleistet wird, trotz sich anhäufender Mutationen. Die Natur kann Mutationen in der Sequenz zulassen, solange die Struktur und damit auch die Funktion erhalten bleiben.
-> Evolution neuer Funktionen ohne Denaturierung
Beispielsweise haben Actin und HSB70 eine ähnliche Faltung, aber nur 16% Sequenzintensität. Wenn die Struktur stabil bleibt, können sich auch neue aktive Zentren, Bindestellen oder regulatorische Elemente durch Mutationen entwickeln. So können neue Funktionen entstehen, ohne dass das Protein denaturiert.
“weniger teuer Sequenzen zu ändern als Strukturen”
Strukturbasiertes Wirkstoffdesign. Dadurch, dass Strukturen stärker konserviert sind als Sequenzen, können Inhibitoren oder Antikörper, die an konservierte Strukturelemente binden, auch gegen neue Varianten oder verwandte Viren wirksam sein.
Für das Protein-Design gilt, dass man auf bereits bekannten Sequenzen die bekannte Strukturen bilden, aufbauen kann.
Paracelsus und Origami
Beginnen wir mit der Paracelsus-Challenge von 1995 zwischen George Rose und Trevor Creamer und der Einsatz von 1.000 US-Dollar. Die Challenge beruhte darauf, zwei Proteine zu kreieren, die verschiedene Strukturen haben, aber mehr als 50% Sequenzähnlichkeit aufweisen. Wir haben ja schon gelernt, dass Strukturen höher konserviert sind als Sequenzen. Wir haben ja schon gelernt, dass Strukturen höher konserviert sind als Sequenzähnlichkeit.
Frage 6
a) Was beinhaltete der Paracelsius-Challenge? (Klausur 2015/ 2020/2021)
b) Warum war dies eine Wette wert? Diskutieren sie dies unter Berücksichtigung des empirisch beobachteten Zusammenhangs zwischen Sequenzidentität und Strukturähnlichkeit in Proteinen. (Klausur 2015)
c.) Warum ist sie schwierig zu erreichen (KLAUSUR 2021)
d.) Erklären Sie kurz, welche Rolle alpha und beta-propensities beim Design des JanusProteins gespielt haben! (Klausur 2015)
Frage 7
a) Was versteht man unter DNA-Origami? (KLAUSUR 2021( 2022)
Die Paracelsus-Challenge war eine experimentelle Wette Rose & Creamer, die das Prinzip „Strukturen sind konservierter als Sequenzen“ auf die Probe stellte.
Ziel: Zwei Proteine zu entwerfen, die verschiedene Strukturen haben, aber mindestens 50 % identische Sequenz aufweisen, bzw. ein Protein mit einer bestimmten Struktur in ein anderes mit anderer Faltung zu überführen – bei gleichbleibender Sequenzidentität ≥ 50 %.
📌 Herausforderung: Da Faltung stark von der Sequenz abhängt, war das Ziel, die Sequenz so zu gestalten, dass sie zwei unterschiedliche stabile Faltungen ermöglicht.
Beispiel aus dem Skript:
Das „Janus“-Protein als Hybrid aus B1 und Rop, mit ~88 % Sequenzidentität, aber unterschiedlicher Faltung.
Die Paracelsus-Challenge war eine Wette wert, weil sie eine empirisch gut belegte Regel in Frage stellte:
Proteine mit hoher Sequenzidentität (>30 %) haben in der Regel auch sehr ähnliche 3D-Strukturen.
Empirische Beobachtung:
Bei ≥ 30 % Sequenzidentität → hohe Strukturähnlichkeit
Bei < 20 % Sequenzidentität → Strukturähnlichkeit oft nicht mehr zuverlässig vorherzusagen
same question as every year james
d.) Erklären Sie kurz, welche Rolle alpha und beta-propensities beim Design des JanusProteins gespielt haben! (Klausur 2015
Der „Janus“-Name spielt auf den zweigesichtigen römischen Gott an – die Sequenz erinnert an B1, die Faltung aber an Rop. Die Arbeit löste die Paracelsus-Challenge, indem sie eine Aminosäuresequenz konstruierten, die ≥ 50 % Sequenzidentität zu einem β‑Struktur-Protein (Protein G B1‑Domäne) besitzt, aber stattdessen eine α‑helikale Faltung einnimmt. Selektive Mutationen in Bereichen mit β‑Ambitionen: Man wählte Aminosäuren mit hoher α‑Helix‑Propensity und reduzierte β‑Propensities
FRAGE 7
a) Was versteht man unter DNA Origami und auf welcher grundlegenden Eigenschaft von DNA/RNA basiert der Erfolg des DNA Origamis? (KLAUSUR 2020/ 2021/ 2022)
DNA Origami ist eine Nanotechnologie, bei der ein langer Einzelstrang DNA durch viele kurze komplementäre „Staple Strands“ in definierte 2D- oder 3D-Strukturen gefaltet wird.
📌 Grundlage des Erfolgs: Die Technik basiert auf der spezifischen Basenpaarung von DNA (bzw. RNA) → komplementäre Sequenzen hybridisieren gezielt miteinander. Das ermöglicht planbares und kontrolliertes Falten der DNA-Stränge.
b) Wieso bezeichnet man DNA-Origami als knowledge-based design? (KLAUSUR 2021/ 2022)
DNA-Origami beruht auf vorhandenem Wissen über:
die Basenpaarung (A–T, G–C),
die Geometrie der DNA-Helix (z. B. Windungen, Abstand, Länge)
c) Was wäre denn ein nicht-knowledge-based design? (KLAUSUR 2021/ 2022)
Yeast Display beruht auf genetischer Vielfahlt + Selektion = gerichtete Evolution
alphaFolds
Hefe und Phagen-Displays und direct evolution
DAS PHAGENDISPLAY:
Das Phagen-Display ist eine abstrakte, aber sehr raffinierte Methode, um gezielt beispielsweise einen Antikörper gegen ein Antigen zu finden. Häufig verwendet man die M13-Phage. Zur Erinnerung, eine Phage ist ein Virus, der Bakterien infiziert. M13-Phagen infizieren gezielt nur E. coli. Die DNA des M13-Phagen ist einzelstränglich und zirkulär. M13 tötet die Viruszelle nicht. Es führt zu einer chronischen Infektion. Das heißt, E. coli bleibt am Leben und segretiert ständig neue Phagen. M13 besteht aus verschiedenen Kapsidproteinen, unter anderem PVIII, der Hauptkörper, und PIII, welches hauptsächlich beteiligt an der Infektion ist.
Zuerst muss ich eine Phagenbibliothek aufbauen. Um eine Phagenbibliothek aufzubauen, benötige ich mein Genkonstrukt. Und dieses Genkonstrukt wird in ein Phagemidvektor eingebaut, in E. coli eingebracht und mit einer Helferphage kombiniert. E. coli produziert nun Phagen, die innen die DNA enthalten, die das Protein kodiert. Es trägt also außen ein Protein, es präsentiert ein Protein und hat innendrin die DNA dafür. Das nennt man die Verkoppelung zwischen Phänotyp und Genotyp.
Wenn ich eine Phagenbibliothek habe, kann ich mein Target immobilisieren, indem ich zum Beispiel mein Antigen auf einer Platte befestige. Dann füge ich meine Phagen hinzu. Die passenden Phagen binden an mein Target. Ich wasche, das heißt unspezifische Bindungen werden entfernt. Und am Schluss gewinne ich die spezifisch gebundenen Phagen zurück. Ich amplifiziere neu in E. coli. Nach mehreren Runden ist die Population angereichert mit den am besten bindenden Phagen.
DAS HEFEDISPLAY:
🧬 Was ist Hefe-Display?
Hefe-Display ist eine Technik, bei der Proteine (z. B. Antikörperfragmente) auf der Zelloberfläche von Hefezellen (meist Saccharomyces cerevisiae) präsentiert werden.
1. Genkonstruktion:
Du klonierst z. B. ein scFv-Fragment (single-chain antibody) in einen Hefenexpressionsvektor.
Dieses Fragment wird mit dem Zellwandprotein Aga2p fusioniert, das wiederum an Aga1p auf der Zellwand bindet.
2. Expression in Hefe:
Hefe exprimiert das Fusionsprotein → Aga2p + scFv wird an die Zelloberfläche transportiert und dort covalent an Aga1p verankert.
3. Screening via FACS:
Du gibst ein fluoreszenzmarkiertes Target-Protein zu den Hefezellen.
Bindet das präsentierte Fragment → die Zelle wird fluoreszierend.
Du selektierst die besten Binder mit FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting).
Find ich fast noch smarter als der heckmeck mit den Phagen….
FRAGE 8
b.) Nennen Sie zwei Eigenschaften durch die sich Hefedisplay vom Phagendisplay unterscheiden. (KLAUSUR 2018/ 2019)
FRAGE 9
a) Erläutern Sie kurz das Grundprinzip wie man durch Verwendung von Displaytechniken ‚monoklonale‘ Antikörper gegen beliebige Antigene erzeugen kann (KLAUSUR 2022)
b) Was versteht man im Kontext vom Display von Antikörpern unter 1) natürlichen und 2) synthetischen Bibliotheken?
c) Displaytechniken werden auch oft als molecular evolution-Techniken bezeichnet. Welcher Zusammenhang besteht zwischen Displaytechniken und natürlicher Evolution? Wie unterscheiden sich diese?
d) Was versteht man unter molecular evolution (KLAUSUR 2023)?
e. Welches zentrale Problem gilt es zu lösen, bei der Anwendung von molecular evolution Techniken beim Designen von Enzymen (KLAUSUR 2023)?
Frage 10
a) Was versteht man unter directed evolution?
b) Bibliothekengrösse und directed evolution: Diskutieren Sie wie viele Aminosäurenpositionen Sie randomisieren können in Bibliotheken mit einer Variantenvielfalt von 10**8 (zehn hoch acht) (1P) (KLAUSUR 2020)
Frage 11:
a) Erläutern Sie kurz das Grundprinzip wie man durch Verwendung von Displaytechniken ‚monoklonale‘ Antikörper gegen beliebige Antigene erzeugen kann.
b) Wie würden Sie das Display durchführen, um Antikörper zu selektionieren, die das Potenzial besitzen könnten, die Infektion von Wirtszellen durch das SARS-CoV-2 Virus zu verhindern (neutralisierende Antikörper)? (KLAUSUR 2022)
Frage 12
a) Wie funktioniert Phagendisplay? (Klausur 2015)
b.) (KLAUSUR 2015) Nennen Sie 2 Beispiele von Phagendisplay für Proteindesign!
b) Wie funktioniert Hefedisplay? (KLAUSUR 2017 / 2021)
c) Wie können diese Techniken für die Entwicklung monoklonaler Antikörper verwendet werden (KLAUSUR 2021)
Unterschied 1:
Phagendisplay: ich arbeite mit M13 und E.Coli
Hefedisplay: ich arbeite mit eukaryotischen Hefezellen
Unterschied 2:
Phagendisplay: mein Target ist immobilisiert
Hefedisplay: mein Target ist fluoreszierend
Beispiel: Entwicklung eines Antikörpers gegen VEGF-A
1. Ziel / Target
Target (Antigen): Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A)
Biologische Funktion: VEGF-A ist ein Signalprotein, das Gefäßneubildung (Angiogenese) stimuliert.
Medizinische Relevanz: Überproduktion bei Tumoren → fördert Krebswachstum.
2. Fusionspartner auf dem Phagen
Antikörperfragment: Single-chain variable fragment (scFv)
Funktion: Erkennung und Bindung des VEGF-A-Proteins.
Fusion: scFv wird genetisch mit dem Gen für das pIII-Protein des M13 verknüpft.
3. Ablauf der Selektion („Panning“)
Immobilisierung des Targets: VEGF-A wird auf einer Mikrotiterplatte oder Beads gebunden.
Inkubation mit der Phagenbibliothek: Millionen verschiedener scFv-Phagen-Varianten werden zugegeben.
Waschen: Entfernt unspezifisch bindende Phagen.
Elution: Phagen, deren scFv fest an VEGF-A bindet, werden abgelöst (z. B. pH-Shift oder kompetitives Elutionspeptid).
Amplifikation: Eluierte Phagen werden in E. coli vermehrt → nächste Selektionsrunde.
4. Ergebnis
Nach 3–4 Runden ist die Population hoch angereichert an scFv-Varianten, die VEGF-A binden.
DNA wird sequenziert → identifizierte scFv können in ein vollständiges Antikörperformat (IgG) umgebaut werden.
📌 Realitätsbezug
Diese Methode führte zur Entwicklung von Bevacizumab (Avastin®) – einem monoklonalen Antikörper gegen VEGF-A, der heute in der Krebstherapie eingesetzt wird
-> eingeschoben Frage 11:
b) Wie würden Sie das Display durchführen, um Antikörper zu selektionieren, die das Potenzial besitzen könnten, die Infektion von Wirtszellen durch das SARS-CoV-2 Virus zu verhindern (neutralisierende Antikörper)? (KLAUSUR 2022
Ich würde als Ziel bzw. als Antigen Teile des Spike-Proteins des Coronavirus wählen, dann eine Phagenbibliothek erzeugen mit dem Antikörperfragment Single Chain Variable Fragment scFv, die als Funktion die Erkennung und Bindung meines Antigens gegen das Coronavirus hat. Dann wird das scFv-Fragment genetisch mit dem Gen für das PIII-Protein, das M13-Phagen, verknüpft. Mein Antigen wird immobilisiert, zum Beispiel durch Beads oder auf einer MikroTiterplatte. Ich inkubiere das Antigen mit der Phagenbibliothek. Durch Waschen entferne ich unspezifische Bindungen. Im Anschluss bleiben nur Phagen, die spezifisch an mein Antigen binden, übrig. Diese Phagen werden in E. coli vermehrt bzw. amplifiziert. Nach drei bis vier Runden habe ich eine Kompilation hoch angereicherter Varianten, die gegen mein Antigen binden. Das identifizierte Antikörperfragment (bzw zuerst dessen DNA )kann im Anschluss in das vollständige Antikörperformat IgG umgebaut werden.
1) Natürlichen Bibliotheken: – Diese stammen aus B-Zellen von Immunisierten oder naiven Spendern. – Sie spiegeln die natürliche somatische Diversität des Immunsystems wider (z. B. durch V(D)J-Rekombination). → hohe biologische Relevanz, aber evtl. eingeschränkte Diversität gegen bestimmte künstliche Targets.
2) Synthetischen Bibliotheken: – Diese werden vollständig im Labor designt und hergestellt. – Die CDR-Regionen (v. a. CDR3) werden gezielt mit definierter Variation (z. B. Tyr, Ser, Asp) aufgebaut. → kontrollierte Diversität, hohe Flexibilität für ungewöhnliche oder künstliche Antigene.
Gemeinsamkeiten (Verbindung zur natürlichen Evolution):
Beide basieren auf dem Prinzip Variation + Selektion:
In der Natur: Mutation + Selektion durch Überleben.
Im Labor: Mutationsbibliothek + Selektion auf Bindung/Funktion.
Molecular Evolution bezeichnet die gezielte Weiterentwicklung von Biomolekülen (z. B. Proteinen) im Labor durch Anwendung der Prinzipien der natürlichen Selektion:
Genetische Diversität erzeugen → Selektion auf gewünschte Eigenschaften → Anreicherung der besten Varianten
z.B. Phagen-Display
➡️ Zentrales Problem: Die Enzymfunktion (Katalyse) ist schwer zu selektieren.
Anders als bei Bindung (die man z. B. mit fluoreszenzmarkierten Liganden + FACS selektieren kann), ist die katalytische Aktivität eines Enzyms nicht direkt sichtbar oder messbar im Hochdurchsatz.
Directed Evolution (gerichtete Evolution) ist eine Labormethode, die die Prinzipien der natürlichen Selektion nachahmt, um Proteine mit verbesserten oder neuen Eigenschaften zu entwickeln.
➡️ Sie basiert auf zwei Schritten:
Erzeugung genetischer Diversität: – durch Mutagenese (z. B. error-prone PCR, DNA-Shuffling) – z. B. Zufallsmutationen in bestimmten Bereichen eines Gens
Selektion oder Screening: – Identifikation der besten Varianten anhand einer gewünschten Eigenschaft (z. B. Bindung, Enzymaktivität)
1. Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen spezifische Antigene: – Beispiel: Antikörper gegen VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), zur Behandlung von Krebs
2. Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen Corona
applied evolution
Frage 13
a.) Was ist applied evolution?
b.) Welche Bedeutung kommt hierbei dem Übergangszustand zu?
Frage 14 Skizzieren Sie kurz wie man in vier Schritten ein Enzym mittels Computerbasiertem Design entwickeln kann/könnte.
Applied evolution (auch gerichtete Evolution oder in vitro Evolution) bezeichnet die künstliche Nachahmung der natürlichen Evolution im Labor, um Proteine gezielt zu verbessern oder mit neuen Funktionen auszustatten.
📌 Sie basiert auf dem Prinzip:
Variation + Selektion → Verbesserung
Typische Schritte:
Erzeugung genetischer Vielfalt – z. B. durch error-prone PCR, DNA-Shuffling oder synthetische Bibliotheken
Selektion oder Screening – z. B. mittels Phage Display, Yeast Display, Microfluidics – Auswahl der Varianten mit gewünschter Eigenschaft (z. B. bessere Bindung, höhere Enzymaktivität)
Enzyme wirken, indem sie den Übergangszustand energetisch stabilisieren. Die präzise Modellierung und Erkennung des Übergangszustands ist entscheidend, um überhaupt eine katalytisch aktive Stelle entwerfen zu können.
Vier Schritte zum Enzymdesign mittels computerbasiertem Design:
Reaktionsdefinition & Übergangszustand modellieren – Bestimme die Zielreaktion und modelliere den Übergangszustand (Transition State), den das Enzym stabilisieren soll.
Design der aktiven Seite – Wähle Aminosäurereste, die den Übergangszustand optimal binden (z. B. durch Wasserstoffbrücken, Ionenbindung). – Platziere sie räumlich korrekt mit Hilfe von Algorithmen (side chain packing).
Einbau in ein stabiles Faltungsgerüst – Integriere das aktive Zentrum in ein vorhandenes, gut gefaltetes Protein-Grundgerüst (z. B. α/β-Barrel).
Computationale Bewertung & experimentelle Validierung – Berechne die Energieprofile, wähle die besten Designs (z. B. Global Minimum Energy Conformation), – synthetisiere sie im Labor und teste sie auf katalytische Aktivität.
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