Fleißner

• heterotrophe Ernährung

• unbeweglich

• Zellwand

• ein-oder mehrkernig, homo-oder heterokaryotisch, haploid, diploid oder dikaryotisch

• einfacher oder komplexer Lebenszyklus

• sexuelle, asexuelle oder parasexuelle Reproduktion

• vegetative Verbreitung durch Sporen

• ubiquitäres Vorkommen

• kosmopolitisch

• wichtig als Saprophyten, Symbionten oder Parasiten

Vorteile:

• Waachstum auf vielen verschiedenen, einfachen Substraten

• schnelles Wachstum

• natürliche “Enzym” Fabriken

• hohe Sekretionskapazität

• hohe Diversität an Sekundärmetaboliten

• eukaryotische Zellen: Glykosylierungen

Anwendungungen:

homologe Produktion = Expression Art-eigener Produkte, z.b. Zitronensäure, Penicillin, Lovastatin

heterologe Produktion = Expression Art-fremder Produkte, z.b. Wachstumsfaktoren, Antikörper, Insulin

Biotransformation

a) Saccaromyces cerevisiae

• wächst als Hefe

• Expression von Plasmiden & aus dem Genom

• klasischer Modellorganismus

• Insulin, Cannabinoide, Indigo, Ethanol,…

b) Pichia pastoris

• wächst als Hefe

• Expression aus Genom

• bedeutendes heterologes Expressionsystem

• Vakzine, Enzyme, Interferon, Cytokine, Antikörper,…

c) Trichoderma reesei

• filamentöser Pilz

• Expression aus dem Genom

• klaissicher Enzymproduzent

• zellwandabbauende Enzyme, Enzyme für Lebensmittelindustrie, AK

d) Aspergillus niger

• filamentöser Pilz

• Expression aus dem genom

• Arbeitspferd der Biotech

• Enzyme, org. Säuren, biotransformation, antimikrobielle Sekundärmetabolite

Expression über Plasmide nur in Hefen möglich, bei filamentösen Pilzen ist Integration ins Genom notwendig

• möglichst lineare Expressionkassettte va. bei filamentösen Pilzen

• Wahl eines Promotors/Terminators

• Wahl eines Sekretionssignals (pilzliches Signalpeptid, Carrier-Protein)

• Beachtung der Codon Usage

• Introns -> entweder Expression der cDNA (ohne Introns) oder Einbau pilzeigener Introns

  -> Introns beeinflussen Expressio3n durch Transkriptionsrate, Transkriptionsstabilität und Kernexport

a) Reduktion der Protease-Aktivität

• Pilze sekretieren Proteasen -> gezielte Inaktivierung oder Reduktion durch Zufallsmutagenese und Screens/Selektion

b) Erhöhung der Sekretion

-> über Zufallsmutagenese, gezielte Genveränderung, Entlastung des Sekretionsweges, (Über)Aktivierung der ER-Stressantwort

Beispiel: exo-1 von Neurospora crassa als Hyper-Sekretierer

c) Optimierung der Morphologie

• durch Genetik, Kultivierung, Prozess

  -> Innerhalb eines Pellets befindet sich das Myzel in unterschiedlichen Wachstumsphasen, sodass produktion u.U. nur in einem kleinen Teil der Biomasse erfolgt

d) Protein-Glykosylierung

• Sekretierte Proteine werden häufig glykosyliert -> Glykosylierungsmuster können humanisiert werden