What are the two main MS methods for systems medicine? What is the key difference?
Maldi—> single charge to every molecule
ESI—>multiple charges depending on size of the analyte
MALDI: jedes Molekül erhält eine einzelne Ladung
ESI: mehrfache Ladungen, abhängig von der Größe des Analyten
Whats the physical principle of Mass spectometry?
-translating mass to time detection
-sorting and detecting
-quantification
F=m*a
plotting the mass to charge ratio (m/z)
Umwandlung von Masse in Zeitdetektion
Sortierung und Detektion
Quantifizierung
F = m × a
Darstellung des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses (m/z)
What´s the main MS detection methods in proteomics?
-TOF (beam type analyzers), resolution increasing with M/Z
-Orbitrap (trapping analyzers), resolution decreasing with M/Z
TOF (Time-of-Flight, Strahlanalysatoren): Auflösung steigt mit zunehmendem m/z
Orbitrap (Trapping-Analysatoren): Auflösung sinkt mit zunehmendem m/z
What is proteome/proteomics?
The proteome is the entire set of proteins that an organism, tissue, cell type, or biological system expresses at a given time and under specific conditions
Proteomics is the large-scale study of proteins — their identities, abundances, structures, modifications, interactions, and functions
Das Proteom ist die gesamte Menge an Proteinen, die ein Organismus, Gewebe, Zelltyp oder biologisches System zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter spezifischen Bedingungen exprimiert.
Proteomik ist die groß angelegte Untersuchung von Proteinen – ihrer Identität, Menge, Struktur, Modifikationen, Interaktionen und Funktionen.
How can we analyze proteins using mass spectrometry?
Top down proteomics (intact proteins)
Middle down Proteomics (medium length peptides)
Bottom up Proteomics (short peptides)
Top-Down-Proteomik: Analyse von intakten Proteinen
Middle-Down-Proteomik: Analyse von Peptiden mittlerer Länge
Bottom-Up-Proteomik: Analyse von kurzen Peptiden
What are the challenges when analyzing a proteome?
High complexity of the proteome (many isoforms and proteoforms)
Wide dynamic range of protein abundances
Difficulties detecting and analyzing post-translational modifications
Challenging sample preparation and incomplete digestion (losses during clean-up)
Instrumental and data analysis limitations in identifying and quantifying all peptides
Hohe Komplexität des Proteoms (viele Isoformen und Proteoformen)
Großer dynamischer Bereich der Proteinmengen
Schwierigkeiten bei der Detektion und Analyse posttranslationaler Modifikationen
Herausfordernde Probenvorbereitung und unvollständige Verdauung (Verluste während der Reinigung)
Instrumentelle und datenanalytische Einschränkungen bei der Identifizierung und Quantifizierung aller Peptide
What are the steps when preparing a sample for bottom-up proteomics analysis?
1) Sample preperation using in-gel or in-solution digestion
—>generating peptides from proteins
2) nano UPLC or electrophoresis separation
3)IMS/MS analysis
4)data aquisition and statistical evaluation
Probenvorbereitung mittels In-Gel- oder In-Solution-Digestion → Erzeugung von Peptiden aus Proteinen
Trennung durch nano-UPLC oder Elektrophorese
IMS/MS-Analyse
Datenerfassung und statistische Auswertung
How do we derive peptide sequence information from a mass spectrum?
—>using Tandem MS (MS/MS)
—>peptides fragment at predictable locations on the peptide backbone
Calculate mass differences between consecutive fragment peaks
—>each mass difference corresponds to the mass of a specific amino acid
—>Reconstruct the peptide sequence by reading the ordered fragment ions and matching the mass steps to amino acids
→ Verwendung von Tandem-MS (MS/MS)
→ Peptide fragmentieren an vorhersehbaren Stellen des Peptidrückgrats
Berechnung der Massenunterschiede zwischen aufeinanderfolgenden Fragmentpeaks → Jeder Massenunterschied entspricht der Masse einer spezifischen Aminosäure
→ Rekonstruktion der Peptidsequenz, indem die geordneten Fragmentionen gelesen und die Massenschritte den Aminosäuren zugeordnet werden
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