Cihan, Distler, Luck, Vagiona,Anyaegbunam

• Sequenzierung, Quantifzierung

• QK

  • Normalisierung

  • Merkmalsauswahl

• Mapping (gegen ein Referenzgenom oder Referenztranskriptom

• Counts (Zählmatrix)

• Explorative Analyse

  • PCA

  • Dimensionsreduktion

  • Filtern der Batch-Effekte

• Differenzielle Explorationsanalytik

z.B. HPV-Forschung, alle Zellen rausschmeißen, die keine viralen Gene haben

Toolkit für die QK, Analyse und Untersuchung der Einzell-Zell-RNA-Sequenzierung

Entfernung von Zellen aus extremen Kategorien z.B. mit hohem Anteil an mitochondrialen Genen (idR Festlegen von Schwellenwerten)

—> können Analyse verfälschen

Daten werden vergleichbar gemacht = Minimieren technischer Verzerrungen

= ID variabler Gene

—> für die Hervorhebung unterschiedlicher zellulärer Expressionen entscheidend

Destillieren komplexer Daten in Hauptkomponenten

—> Varianz in den Daten kann am besten dargestellt werden

• Dimensionsreduktion (z.B. durch Merkmalsbestimmung = Hervorhebung untersch. zellulärer Expressionen)

• Batch-Effekte rausfiltern

Artefakte technischer (z.B. untersch. Bediener) oder biologischer Natur (z.B. Geschlecht)

• PCA (Dimensionsreduktion durch Merkmalsauswahl)

• Elbow-Plot

• Clustering

• UMAP

• Batch-Effekt-Korrektur

• Differenzielle Expressionsanalyse (DE)

Bestimmung der optimalen Anzahl an Komponenten

ID inhärenter Gruppierungen

UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) = 2 D-Visualisierung

= welche Gene unter unterschiedlichen Bedingungen wie viel exprimiert werden

• Differenz zwischen gesunden und kranken Zellen

• ID von Unterschieden in den Signalwegen/Biomarker

• Therapiewege

Differenziell exprimierte Gene

= Gene, die signifikant unterschiedlich exprimiert werden

Proteom = die Gesamtheit aller Proteine eines Organismus/Gewebes/Zelle

Proteomics = Untersuchung der Strukturen und Funktionen des Proteoms

“Bottom Up”: Proteine —> Peptide (proteolytische Spaltung) kurz

< 3 kDa —-> Messung mit LCMS

“Middle Down”: mittellange Peptide (3-10 kDa)

“Top Down”: intakte Proteine inkl. Fragmente (>10 kDa)

• Dynamik über die Zeit (Trennung) <-> Genom statisch

• kein Äquivalent zur PCR

• alternatives Spleißen (400 000 Proteoformen bei 20 000 Genen)

• > 400 PTM´s

• subzelluläre Spezifikationen (Organellen)

• Zelllyse und Proteinextraktion (SDS)

• Denaturierung - Reduktion - Alkylierung

• proteolytische Spaltung durch Trypsin (Verdauung)

• Peptidreinigung

MS/MS = Tandem-Massenspektrometrie

MS1 —> Fragmentierung der Peptid‑Ionen in Kollisionszelle —> MS2 (Tochterionen) —> Interpretation der Fragment‑Ionen‑Muster (Datenbankabgleich oder de‑novo‑Sequenzierung)

= Bestimmung der Primärstruktur

Massendifferenzen zwischen Fragmentionen = Massen der AS-Reste

Proteomik = Untersuchung der Struktur und Funktionen des Proteoms

Proteom = Gesamtheit aller Proteine eines Organismus/Gewebes/Zelle

dynamisch und nicht statisch wie das Genom, z.B. Larve und Schmetterlinge haben das gleiche Genom, aber ganz unterschiedliche Proteine

• PTM´s (circa 400 versch.) z.B. Phosphorylierungen/Glykosylierungen verändern Struktur/Funktion

• 400 000 Proteoformen durch Spleißen (aus 20 000 Genen)

• subzelluläre Lokationen

• kein Äquivalent zur PCR

• Proteininteraktionen

  —> nicht ableitbar aus dem Genom oder Transkriptom

• Zelllyse und Proteinextraktion

• Denaturierung - Reduktion - Alkylierung

• proteolytische Spaltung mit Trypsin

• Peptidreinigung

• z.B. LCMS =Auftrennung der Proteine mittels Flüssigkeitschromatografie und anschließende Massenspektrometrie durch Bestimmung des Masse-zu-Ladungsverhältnisses z.B. mit Hilfe ESI = electrospray ionisation

• oder Maldi-TOF = Matrix-Assistierte-Laser-Desorptions-Ionisierung mit time of flight-Analyse

1. Benchmarking mit bekannten Datensätzen

2. Vergleich mit bereits etablierten Tools

3. Prüfung der Leistungskriterien: Richtigkeit, Präzision, dynamischer Bereich, FDR.

4. Biologische Validierung

Vorbereitungen:

• Zelllyse und Proteinextraktion

• Denaturierung - Reduktion - Alkylierung

• proteolytische Spaltung mit Trypsin

• Peptidreinigung

Messung:

• Auftrennung der Peptide z.B. durch Flüssigkeitschromatografie

• Ionisierung durch MALDI oder ESI

• Messung durch TOF oder Massenspektrometrie (Masse-zu-Ladungsverhältnis)

analytische Herausforderungen:

• PTM´s (>400)

• 400 000 versch. Proteoformen bei 20 000 Genen

• subzelluläre Lokationen

• Proteininteraktionen

• kein Äquivalent zur PCR

• Dynamik über die Zeit

• Deterministisches Modell

• Stochastisches Modell

Veränderung über die Zeit = Produktion-Degradation

Produktion und Degradation sind gleich: Änderungsrate = 0

Produktion und Degradation des Proteins und der mRNA

Produktion und Degradation der mRNA

geringe Menge an Transkriptionsfaktoren

• intrinsisch (Bak)

• extrinsisch (Eukaryoten)

• Studieren biologischer Prozesse und molekularer Funktionen

• Verstehen von Krankheitsmechanismen

• Therapieentwicklung

• Evolutions- und Funktionsannotationen

a. Zusammensetzung

Homo-Oligomer (Bindungspartner gleich z.B. HsP27)

<-> Hetero-Oligomer (Bindungspartner unterschiedlich z.B. Hb)

b. Affinität - Können sie alleine existieren?

obligat (starke Bindung zueinander, z.B. Histon-Octamer)

<-> nicht obligat (können alleine existieren, z.B. RNAase-AK)

c. Lebensdauer - Wie lange ist die Interaktion?

transient (vorübergehend, z.B.Ubiquitin)

<-> permanent (dauerhaft, irreversibel, z.B. ATP-Synthase)

Netzwerke bestehen aus Knoten bzw. Scheitelpunkte, die verbunden werden durch Kanten, Bögen bzw. Linien

• ungerichtet (Protein-Interaktions-Netzwerke)

• gerichtet (metabolische, regulatorische Netzwerke)

• gewichtet (Gen-Koexpressionen, Kanten haben Werte)

High Degree Centrality = Grad-Zentralität = Hub-Knotenpunkt, mit den meisten Kanten, am stärksten direkt vernetzt

High Closeness Centrality = Nähe-Zentralität = liegt im Durchschnitt am nächsten zu allen Knoten im Netzwerk

High Betweenness Centrality = Zwischenheit-Zentralität, = Durchgangsknoten, Brückenfunktion, durch den die meisten durch müssen

Protein-Protein-Interaktionen

Wie die Proteine kommunizieren, zusammenarbeiten und letzlich Funktionen z.B. Zellfunktionen bestimmen

—> Untersuchung z.B. bioinformatisch mit Graphentheorie

Nein es gibt keinen natürlichen Grenzwert

• Interaktionsstärke (nicht kovalente Bindungen wie VdW, Ionen, Wbb) werden durch die Dissoziationskonstante KD bestimmt.

  • KD niedrig (nm) = starke Interaktion

  • KD hoch (µm) = schwache Interaktion

  • kein Cutoff, der bestimmt, ob es eine Interaktion gibt oder nicht, sondern Kontinuum

• Assay-abhängig

• Nachweisgrenze der Methode und biologische Rahmenbedingungen spielen ebenfalls eine Rolle

• direkte Interaktionen (KD, Proteinfragmente)

• binäre Interaktionen (kein KD, volles Protein)

• Co-Komplex-Assoziationen (kein KD, volles Protein)

study bias = Untersuchungsverzerrung (voreingenommen gegenüber gut untersuchten Genen)

—> Daten sind zugunsten der Gene verzerrt, da Gene und Proteine nicht gleichmäßig gut erforscht werden

Degree = Grad = Anzahl an Kanten (“edges”) eines Scheitelpunkts (“vertex”)

bei hohem Grad = Hubknoten, ein Protein, das besonders stark vernetzt ist

= skalenfreie Netzwerke

Besonderheit: auf log-log-Skala linear (eine Linie)

—> Potenzgesetz

Software zur

• Untersuchung einer Reihe von Genen mit Daten zu Proteininteraktionen

• Visualisierung und Analyse von Proteinnetzwerken

Gradverteilung