Fragebogen F

Ribosom = Ribonukleoproein

(Ribosome bestehen aus rRNA und Proteinen —> Umsetzung genetischer Information von mRNA in Proteine)

Aufbau:

i) kleine Untereinheit: Ablesen der mRNA

ii) große Untereinheit: verknüpft die Aminosäuren zu einem Protein

rRNA: ist für die eigentliche Proteinherstellung (Verknüpfung der Aminosäuren) verantwortlich

Proteine: stabilisieren die Struktur des Ribosoms + unterstützen die Funktion der rRNA

Prokaryoten: 70S-Ribosomen (30S + 50S)

Eukaryoten: 80S-Ribosomen (40S + 60S)

S-Werte nicht additiv, da:

Die Überlappung/Zusammenlagerung der Untereinheiten führt zu Formänderung und daher auch zur Änderung des S-Werts (Änderung des Sedimentationsverhaltens)

—> Ribosom wird komplakter

—> Reibungswiederstand im Medium sinkt

Proteinbildung —> Peptidbindung zwischen Aminosäuren

Kondensationsreaktion (Abspaltung von Wasser):

Die Aminogruppe (NH₂) einer Aminosäure reagiert mit der Carboxylgruppe (COOH) einer anderen Aminosäure

—> Peptidbindung

(Bildung der Peptidbindung in großer Untereinheit des Ribosoms)

(—> Verknüpfung von Aminosäuren zu einer Polypeptidkette)

—> beschreibt Sedimentationsverhalten (physikalisches Verhalten): Maß für die Größe und Form gemessen mittels Ultrazentrifugation

S-Wert gibt an, wie schnell ein Teilchen bei Ultrazentrifugation absinkt

—> je schneller ein Teilchen sedimentiert, desto größer sein S-Wert

S-Wert beeinflusst durch: Molekülmasse, Dichte, Form, Reibung im Medium

(zwei Moleküle ähnlicher Masse können unterschiedliche S-Werte haben, wenn sie sich z.B. in ihrer Form unterscheiden)

Ribosomen sind keine Organellen, da sie keine Membran besitzen

(Ribosom = Zellbestandteil, aber nicht membranumhülltes Organell)

eukaryotische Ribosome

große UE: 60S (3 rRNA / 49 Proteine)

kleine UE: 40S (1 rRNA / 33 Proteine)

—> 80S

größer als prokaryotische Ribosomen, da:

• mehr Proteine (insbesonderes in der kleinen Untereinheit)

• mehr rRNA (mehr strukturgebende Proteine nötig)

—> Eukaryoten: mehr Regulationsmöglichkeiten im Ribosom (komplexer)

prokaryotische Ribosome (Bakterien)

große UE: 50S (2 rRNA / 31 Proteine)

kleine UE: 30S (1 rRNA / 21 Proteine)

—> 70S

kleiner als eukaryotische Ribosomen (weniger rRNA / weniger Proteine)

Polysomen (Polyribosomen) sind Verbände aus mehreren Ribosomen, die gleichzeitig dieselbe mRNA ablesen

—> parallele Translation auf einer mRNA

funktioneller Vorteil:

• Effizienzsteigerung der Proteinbildung (identisch) —> Zeitersparnis

• Ressourcenschonend, da Zelle weniger neue mRNA transkribieren muss

• hohe Proteinausbeute bei “kurzer” mRNA-Lebensdauer

—> Polysomen ermöglichen eine schnelle und effiziente Produktion vieler Proteine aus einer mRNA

mRNA wird in 5´—>3´Richtung abgelesen / von N- zu C-Terminus synthetisiert

5´Ende: Startpunkt (andocken des Ribosoms)

5´UTR: Signale für den Start der Translation

Startcodon: für Methionin (legt Leseraster fest)

CDS: bestimmte Aminosäuresequenz des Proteins

Stopcodon: beendet Transaltion (codiert keine Aminosäre) z.B. UAA, UAG, UGA

3´UTR: wichtig für Stabilität und Regualtion

prokaryotisch:

5` — SD-Sequenz — Startcodon (AUG) — CDS — Stopcodon — 3´

eukaryotisch:

5´Cap — 5´UTR — Startcodon — CDS — Stopcodon — 3´UTR — Poly-A-Schwanz

(Exon: codierender Abschnitt, Intron: nicht codierender Abschnitt —> splicing)

Aminoacylierung (ATP liefert Energie)

1) Aminosäure + ATP → Aminoacyl-AMP + PPi

• Aminosäure wird aktiviert durch Bindung an AMP (Adenosinmonophosphat)

[PPi: Pyrophosphat wird in 2 Phosphate gespalten —> Reaktion wird irreversibel]

• (Energie wird durch ATP geliefert / ATP wird hydolisiert)

2) Aminoacyl-AMP + tRNA → Aminoacyl-tRNA + AMP

• aktivierte Aminosäure wird auf passende tRNA (3´OH) übertragen

—> Aminoacyl-tRNA, bereit für die Translation (energiereich gebunden)

Ziel der Aktivierung:

Eine Aminosäure muss an ihr passendes tRNA-Molekül gebunden werden, damit sie ins Ribosom eingebaut werden kann. Ohne Aktivierung kann die Aminosäure keine Peptidbindung bilden.

—> Aminosäure benötigt energiereiche Bindung, um später die Peptidkette zwischen Aminosäuren auszubilden

Aufbau tRNA:

• 2D: Kleeblattstruktur

• 3D:L-förmige Struktur (sorgt für identische Bindung am Ribosom)

• —> vier “Arme” + 3 Schleifen

Struktur entsteht durch Falten der Kette, sowie Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen

tRNA: 73-93 Nukleotide —> bilden Ribonukleotidketten

• am 3´ Ende: Bindung der aktivierten Aminosäure als Ester

Modifikationen:

—> tRNAs sind stark modifiziert (sorgt für schnelle Anpassung)

1) Struktur und Stabilität:

Modifikationen sichern die korrkete 3D-Faltung + schützen tRNAs vor Abbau

2) Genauigkeit und Decodierung:

Modifikationen verbessern Codon-Erkennung bzw. verhindern Fehler, indem sie die Codon-Erkennung einschränken + Modifiaktionen steuern Wobble-Paarung

3) Anpassung an zelluläre Bedingungen (Translationstegulation):

Modifikationen passen sich z.B. Stress / Nährstoffmangel an —> Translation bestimmter Proteine bevorzugt bzw. gedrosselt

Ribosom besitzt 3 Bindestellen für tRNA während der Translation (Bindestellen verbinden Untereinheiten des Ribosoms miteinander)

tRNA —> A-Stelle —> P-Stelle —> E-Stelle

1) A-Stelle (Codon-Erkennung)

neue Aminoacyl-tRNA bindet an Codon (tRNA mit aktivierter Aminosäure beladen)

Bindung nur, wenn Codon (mRNA) und Anti-Codon (tRNA) komplementär sind

—> tRNA rutscht weiter auf P-Stelle

—> A-Stelle wird von neuer tRNA besetzt

2) P-Stelle (Peptidbindung)

Riobsom katalysiert Peptidbindung zwischen neuer Aminosäure und Carboxylende der wachsenden Polypeptidkette

Verknüpfung der Aminosäuren zu Peptidbindung

—> tRNA (unbeladen) rutscht nun weiter auf E-Stelle

3) E-Stelle (Translokation)

—> entladene tRNA (ohne Aminosäure) verlässt das Ribosom

Ribosom zerfällt in seine Untereinheiten

Ja, eine mRNA kann mehrmals translatiert werden (solange mRNA stabil ist), da

i) nach Abschluss eine Translation wird die mRNA nicht verbraucht oder zertstört (nicht nachweisbar, ob bzw. wie oft eine mRMA translatiert wurde)

aber: mRNA wird durch Enzyme (RNasen/Ribonukleasen) abgebaut

ii) mehrer Ribosome können gleichzeitig die selbe mRNA translatieren —> Polysom

mRNA hat “begrenzte Lebensdauer”

—> kurzlebige mRNA: schnelle Anpassung möglich

—> langlebige mRNA: viel Proteinproduktion

Proteinbiosynthese: DNA —> mRNA —> Protein

1) Transkription

DNA wird in mRNA umgeschrieben

2) RNA-Prozessierung bei Eukaryoten

• 5´Cap

• Poly-A-Schwanz

• Splicing —> Introns entfernen “Lasso”

prä-mRNA wird zu reifen-mRNA

3) Translation (Ribosome)

mRNA wird in Aminosäurekette übersetzt

4) Posttranslationale Modifikationen

Protein wird gefaltet, chemisch Verändert (Glykosylierung), transportiert

a) Transkription

—> DNA wird in mRNA umgeschrieben

b) Translation

i) Initiation: Ribosom bindet mRNA, Binden der Initiator-tRNA am Startcodon

Prokaryoten:

• 30S-Untereinheit erkennt Shine-Dalgarno-Sequenz auf mRNA

• Korrekte Positionierung des AUG-Start-Codons / Beladung der P-Stelle mit fMet-tRNA (spezielle Initiator-tRNA)

• 50S-Untereinheit lagert sich an —> vollständiges 70S Ribosom

• Drei Initiationsfaktoren (IF1, IF2, IF3)

• Startaminosäure = formyliertes Methionin fMet

—> Aufbau des funktionsfähigen Ribosoms am Startcodon

ii) Elongation: Verlänerung der Polypeptidkette (belandene tRNA)

• Anlagerung der Aminoacyl-tRNA —>Passende tRNA bindet an die A-Stelle

• Peptidbindung —> Polypeptidkette wird von der tRNA in der P-Stelle auf die Aminosäure in der A-Stelle übertragen.

• Translokation

  Ribosom rückt um ein Codon (5' → 3') weiter (RNAs rutschen weiter: A → P → E, entladene tRNA verlässt das Ribosom)

—> Wobble-Hyothese (Position 3 des Codons): Erlaubt nicht-kanonische Basenpaarung (z.B.: G-U)

iii) Termination: Abbruch der Proteinbiosynthese bei Erreichen eines Stop-Codons (UAA, UAG, UGA)

—> mRNA wird in Aminosäurekette übersetzt

—> Ribosom zerfällt in seine Untereinheiten (kann erneut genutzt werden)

c) Modifikation

—> Protein wird gefaltet, transportiert, chem. verändert

mRNA Erkennung: Die 30s-Untereinheit erkennt die Shine-Dalgarno-Sequenz auf der mRNA

Initiationsfaktoren: 3 Faktoren

• IF 1: Stabilisiert die BIndung der Untereinheit und blockiert die A-Stelle während der Initiation

• IF 2: Liefert die Initiator-tRNA zur P-Stelle und fördert die Subunit-Assemblierung

• IF 3: Verhindert vorzeitige Untereinheitsassoziation und sichert die korrekte Startcodon-Erkennung

Energieverbrauch:

• IF 2 hydrolisiert GTP zu GDP für die nötige Energie der Initiation

mRNA-Form:

• inear

Start-Aminosäure:

• fMet (N-Formylmethionin)

Ribosom nach Subunitjointing:

• 70s (30s+50s)

mRNA Erkenung:

• die 40s-Ribosomenuntereinheit erkennt die 5’-Cap-Struktur und bindet mit dieser

Initiationsfaktoren: mehr als 13 Initiationsfaktoren

• eIF 1, eIF 2, eIF 3, …

Energieverbrauch:

• GTP wird durch eIF 2 hydrolisiert

• ATP Verbrauch durch wandern des Präinitationskomplexes entlang der mRNA

mRNA-Form:

• Zirkulär: 5’-Cap- und 3’-Poly(A)-Schwanz verbinden sich zu geschlossenem Loop

Start-Aminosäure:

• Met (Methionin)

Ribosom nach Subunitjointing:

• 80s (40s+60s)

Nach Subunitjointing (der Zusammensetzung des Ribosoms) beginnt die Elongationsphase:

1. Codonerkennung

   • Neue Aminoacyl “beladene” tRNA bindet an Codon in A-Stelle

2. Knüpfung der Peptidbindung

   • Ribosom katalysiert Peptidbindung zwischen neuer Aminosäure und Carboxylende der wachsenden Polypeptidkette

3. Translokation

   • tRNA (mRNA gebunden) rückt von A-Stelle zur P-Stelle

   • Die jetzt unbeladene tRNA rückt von der P-Stelle zur E-Stelle (Exit)

     —> Freisetzung des Ribosoms für nächsten Zyklus

GTP-abhängige Elongationsfaktoren:

1. Bindung der zum Codon passenden Aminosäure-tRNA in die A-Stelle (EF-Tu+GTP)

2. Verlängerung der Polypeptidkette um die neue Aminosäure (Peptidyl-Transferase)

3. Weiterrücken der mRNA um 3 Basen (Translokation —> EF-G+GTP)

“Degeneriert" beim genetischen Code bedeutet Redundanz: Mehrere verschiedene Basentripletts (Codons) können für dieselbe Aminosäure kodieren.

• 1. und 2. Base des Codons sind relevant, die 3. Stelle kann variieren (Wobble-Hypothese)

• z.B.: Codons von Valin:

  • GUU

  • GUC

  • GUA

  • GUG

• -> 3. Stelle ist degeneriert

Die Wobble-Hypothese besagt, dass für die Positionen 1 und 2 des Codons strikt eine kanonische Watson-Crick-Basenpaarung mit dem Anticodon erforderlich ist.

-> 3. Position kann variieren (Wobble-Position): Das erlaubt nicht-kanonische Basenparrungen

Die Position 1 und 2 sind strikt da:

1. Geometrische Überprüfung: perfekte Helix-Form, tritt nur bei kanonischen Watson-Crick-Paarungen auf.

2. Spezifität: 1. und 2. Base legen meist die chemische Eigenschaft der Aminosäure fest

3. Energetik: Die Bindungen an 1 und 2 liefern die notwendige Stabilität, um die tRNA für die Peptidbindung festzuhalten.

-> Position 1 und 2 unterliegen der aktiven Qualitätskontrolle durch das Ribosom, während Position 3 passiv toleriert wird

-> Translation wird genauer, da Fehlertoleranz steigt

1. Stoppcodon (keine Existenz passender tRNA) bindet an A-Stelle des Ribosoms

2. Statt tRNA binden RFs (Releasefaktoren) an das Codon und bewirken, dass die Peptidyl-Kette auf ein Wassermolekül anstelle einer Aminosäure-tRNA übertragen wird

3. Durch diese Hydrolyse löst sich die Verbindung zum Ribosom und das fertige (ungefaltete) Protein kann vom Ribosom abdissoziieren

4. Die Ribosom-Dissoziation ist GTP/ATP-abhängig und die Ablösung der RF1/RF2 ist GTP-abhängig

5. Das Ribosom wird recycelt

Unter Ribosomen-Stalling versteht man das ungeplante oder Stocken eines Ribosoms während der Elongationsphase der Translation. Das Ribosom kommt an einer bestimmten Stelle der mRNA nicht mehr weiter.

Ursachen dafür:

• Polyprolinsequenzen

• Ungeladene tRNAs

• Niedrige tRNA-Verfügbarkeit (“langsame Codons”)

• Gekürzte mRNAs (Transkriptionsfehler)

Die Folge: Ribosome collisions

Ribosomen-Rettungssysteme sind notwendig um:

• Kollisionen zwischen Ribosomen zu verhindern (Stau)

• Fehlerhafte mRNA abzubauen

• Blockierte Ribosomen wieder freizugeben (recycling)

  -> Ribosomenaufbau extrem energieaufwendig

Ja (z.B. Insulin)

Grund: schnelle Vermehrungsrate + Proteinsynthese in Bakterien

Wie? Modifizierung von bakteriellen Plasmiden, Einbau des entsprechenden Gens

Probleme + Lösungen:

- Während Transkription: bakterieller Promotor benötigt (Pribnow-Box etc.), Introns müssen vorher herausgeschnitten werden (reine Exon-DNA)

- Translation: Shine-Dalgarno-Sequenz benötigt, Codons müssen auf Bakterien optimiert werden (zum Beispiel auf tRNAs)

- Faltung: Chaperone nötig, Anpassung äußerer Bedingungen (zum Beispiel Temperatur) für optimale Faltung

• Ribosomen sind essenzielle Bestandteile von Organismen; ohne Translation von mRNA in Proteine kann eine Bakterienzelle keine Stoffwechsel aufrecherhalten

• Antibiotika greifen gezielt porkaryotische Ribosomen an

Wirkungsmechanismus von Puromycin:

1. Puromycin kann aufgrund seiner Strukturähnlichkeit zu einer mit Tyrosin beladenen Aminoacyl-tRNA in die A-Stelle eines Ribosoms

2. Die Peptidyl-Transferase überträgt die Polypeptidkette auf Puromycin, wodurch es zu einer frühzeitigen Termination der Translation kommt

3. Das unfertige Protein löst sich vom Ribosom ab -> das Ribosom zerfällt -> die Proteinsynthese wird gestoppt