Haag II

Mg stabilisiert Polymerase (ohne schlecht gefaltet), stabilisiert Einzelstränge (nach Denat), stabilisiert Nukleotide, stabilisiert Primer-Annealing (durch Einzelstrangstabilisierung)

Je näher an der Schmelztemperatur desto spezifischere Bindungen aber potentiell weniger Produkt, je weiter weg von der Schmelztemperatur desto mehr Produkt desto weniger spezifisch aber mehr (ganz weit weg dann unspezifisch und wenig)

Programm-/temperaturwahl, Primerdesign, Aufreinigung/Aufreinigungsqualität (was weiß ich, was kann ich überprüfen, etc.) → dann den Punkt ändern

Annealingtemperatur runter (ggf Gradienten), Zusatz dazugeben (DMSO, Magnesiumionen), evtl Zyklen erhöhen (wenn davor sehr niedrig, im Rahmen!)

Annealingtemperatur höher (nicht höher als Schmelztemperatur aber anpassen), Mg/andere Zusätze dazugeben

Elongationszeit länger, DNasen als Kontamination (dann dNTP, Primer, etc. wegwerfen/frisch, Rest überprüfen)

• „Live“-Ansicht ins PCR-Tube → erste Versionen: 2 Zyklen, Aliquot nehmen, 2 Zyklen, Aliquot nehmen usw. → genereller Set-Up: Thermocycler mit UV-Lampe und CCD-Kamera (Farbstoffe werden angeregt, Kamera nimmt auf, Auswertung etc), (Ethidiumbromid oder SYBR-Green als Farbstoff)

• Problem: Hemmung der PCR durch Farbstoffzusätze und keine Unterscheidung von Produkt und Artefakt

• qPCR Vorteile: präzise Konzentrationsbestimmung, eifach

• qPCR Nachteile: Kosten (Thermocycler mit Detektor, Fluoreszenzgelabelte Oligos), Auuswertungsaufwand (Validität, Plausibilität)

• Lösung: qPCR-FRET

• Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer

• Fluoreszenzfarbstoffe haben Anregungs- und Emissionsspektrum → bei 2 Farbstoffen ist ein Überspringen möglich (E1=A2 → E1 ist somit nicht messbar)

• Taqman, molecular beacons, Hybridisierungssonden

• Oligonukleotid mit 2 Farbstoffen, einer am 5´(Reporter), einer am 3´ (Quencher) → Polymerase mit 5´-3´Exonuklease enfernt Oligo → Quencher und Reporter werden getrennt → man bekommt Signal in Abhängigkeit mit Menge an generierter Menge Molekül (Elongation)

• effinzient/genau bei gerninger Menge/Zyklenzahl, sonst “treffen” sich die Moleküle zufällig (Hintergrundraschen)

• Oligo mit 2 Farbstoffen, 5´und 3´Ende komplementär → bilden Haarnadelstruktur → Reporter und Quencher am 5´und 3´Ende → mittlere Sequenz kann an Template binden → Reporter und Quencher sind entfernt voneninander → E1 wird sichtbar, in Abhängigkeit der Annealingmenge →(Achtung kein 5´Ende, Oligo wird also nicht abgebaut, sondern weggeschoben → Hairpin bildet sich wieder → Signal bricht ab weil erneutes Quenching)

• 2 Oligos, einer mit Fluoreszenzfarbstoff am 5´, einer mit Farbstoff am 3´(eigentlich egal aber meist 3´Donor, 5´Akzeptor) → Am Anfang nur konzentrationsabhängiges, statistisches Quenching → Hybridisierung der Oligos mit 3-5 Nukleiótiden Abstand auf dem Template → Quenching durch Nähe von Quencher und Reporter (E2 hoch, E1 runter), (Messung im Bereich des Annealings) → Polymerase/Exonuklease entfernt Oligos mit Farbstoffen → Farbstoffe werden frei, Quenching stoppt (E1 hoch, E2 runter)

• erst PCR zum Splitten

• zweite PCR: Ligations PCR → Primer nicht sofort verwenden → diese erst nach 10-15 Zyklen hinzugeben (damit sichergehen, dass Ligation stattgefunden hat und nicht Einzelfragmente amplifiziert werden)

• Ähnlich wie Golden-gate-Klonierung aber mit 15bp-Überhängen

• Einzelsträngige Überhänge hybridisieren → zwischen den Überhängen wird das Insert eingefügt und durch ein Enzym als Klammer gehalten → die Zelle ligiert die DNA-Stränge anschließend

• Ligation innerhalb der Transformierten Zelle

• Simultane Klonierung von mehreren Inserts möglich → bis zu 4 Fragmente ohne Probleme, nahtlos möglich

• Keine Restriktionsenzyme notwendig (wegen den Übehängen), keine Phosphatase behandlung (um Ringlschluss ohne Insert zu Verhindern → braucht man nicht weil man arbeitet mit Ligation über Organismus), keine Ligation notwendig (macht der Organismus für uns)

• Clone any insert, into any location, within any vector you choose → 15 Basenpaarüberhänge sind frei wählbar, es ist also auf jeder Ebene flexibel

• Vorteile:

  • Sehr flexibel, Restriktionsunabhängig, simultane Mehrfachklonierung, keine lange Etablierung, nahtlose Klonierung

• Nachteile:

  • In-Fusion Enzym ist teuer, viele verschiedene Primer notwendig, fehleranfälliger

  • vorsichtig arbeiten, da die Inserts an den Vektor nur geklammert sind