GLV2

Auslöser:

• hohe Sonneneinstrahlung

• hoher O2 Gehalt

• niedriger CO2 Gehalt

Zelluläre Kompartimente:

• Chloroplasten: Vindung von O2 durch Rubisco: 2Phosphoglycolat entsteht

• Peroxisome: Umwandlung in Glycin, dabei entsteht H2O2

• Mitochondrien: Umwandlung in Serin: dabei entsthet Co2, Rücktransport und Bindung von CO2 an Rubisco in Chloroplasten

• Algen/ Cyanobakterien: räumliche Trennung durch Stärkekompartiment/ Carboxysome

• C4 Pflanzen: C4 Photosynthese: räumliche Trennung

  • Mesophyllzellen: CO2 (HCO3-) wird von PEP gebunden, da es eine höhere Affinität zu CO2 hat. Dadurch word PEP zu Oxalacetat carboxyliert dann zu Malat umgewandelt, welches dann in die Bündelscheidezellen wandert: Hier wird es zu PYruvat decarboxyliert, wodurch CO2 entsteht, welches von Rubisco genunde werden kann.

Da sie durch den anaeroben Stoffwechsel mehr anabole Biosynthesewege ansteuern können. Diese benötigen sie um Substrate aufzubauen, die sie für die Proliferation und das Zellwachstum benötigen. Außerdem klauen sie bestimmte Substarte und Energie von anderen Zelllen und die Glykolyse läuft so viel schneller

Der Verlust der PTEN Aktivität bedeutet die dephosphorylierung von PIP3, welches den Pi3k-Akt-Weg aktiviert. Das bedeutet, dass Faktoren wie mTOR durch Akt überaktiviert werden und dadurch HIF-1 exprimiert wird

IDO: Oxidation von L-Trytophan

Schwächung Immunabwehr

Treg werden geschwächt

Glucose-6P-DH wird gehemmt: So wird der Pentosephosphatweg und damit die anabolen Stoffwechselwege gehemmt.

Hexokinase wird gehemmt: weniger Glucose wird weiterverarbeitet und kann positiv auf den Zellstoffwechsel auswirken, Glykolyse wird etwas gedrosselt.

Pyruvat-DH: wird ebenfalls aktiviert, damit der Citronensäurezyklus gefördert wird und dadurch mehr Energie produziert wird

M1: tetramer, also normale Funktion: GP3 wird zu GP2 umgewandelt -> sichere stabile ATP Produktion

M2 Dimer, phophoryliert: alternatices Splicing bewirkt die Expression von Exon 10 statt 9 -> positive Auswirkung auf den anabolen Stoffwechselweg: Wirkung als Transkriptionsfaktor im Zellkern: Metastasenbildung, Lactatbildung, Block des PPP

moonlight Funktion

fungiert als Histidinkinase und fördert dabei anabole Stoffwechselwege

hohe Lactatkonzentration in der Umgebung blockiert bestimmte wichtige Immunabwehr-Stoffwechselwege in Immunzellen

Ein positiver gesamt S Wert bedeutet, dass sich das Protein begünstigt über die Entropie gefaltet hat. Es erhöht also die Stabilität des Proteins.

Sie sind ein wenig instabiler als die günstigste Form, da Bindungspartner und Modifikationen zur Gesamtstabilität beitragen. Die gewonnene Flexibilität und geringere Festigkeit führt dazu, dass das Protein leichter zwischen Konformationen wechseln kann. Außerdem lassen sie sich schneller über die Ubiquitinierung abbauen und somit leichter regulieren.

Ein positiver ∆G-Wert (∆G = G(folded) - G(unfolded)>0) bedeutet, dass der gefaltete Zustand eine höhere Energie besitzt als der ungefaltete. Unter diesen Bedingungen ist der Faltungsprozess nicht spontan, und das Gelcihgewicht liegt auf der Seite des ungefalteten Proteins. Das bedeutet, dass das Protein instabil ist und nur durch weitere Modifikationen aufrechterhalten werden kann.

Proteine können so leichter zwischen Konformationen wechseln. Durch die gewonnene Flexibilität kann es die katalytische Aktivität verbessern und an die Bindungspartner und Umwelt anpassen.

Die kleinen negativen ΔG-Werte zeigen, dass natürliche Proteine nur knapp stabil sind. Schon kleine Änderungen der Aminosäuresequenz können die Stabilität stark beeinflussen. Deshalb ist Proteindesign schwierig, da die richtige Balance der Wechselwirkungen genau getroffen werden muss.

nur leichte Umgebungsveränderungen wie z.B. pH, Temperatur oder Mutationen können das Protein zum denaturieren zwingen oder zu einer Fehlfaltung

Es können neue Proteinfunktionen entstehen, die Gesamtstruktur bleibt dabei intakt, außerdem können neue Bindungspartner entstehen. Es kann auch das Genom durch Mutationen vergrößert werden.

Es können in kürzerer Zeit die Struktur identifiziert werden sequenziert werden kann, somit können Impfstoffe schneller entwickelt werden. Weitere Coronavarianten können schneller erkannt werden durch die Repositionierung der Moleküle.

Faltungen können vorhergesagt werden, die bekannten Strukturen dienen als Template. Neue Bindungseigenschaften lassen sich einführen oder neuartige Proteine aufbauen. Außerdem kann die Robustheit vergrößert werden.

Das gezielte Falten eines langen einzelsträngigen DNA-Moleküls (scaffold-strand) mit Hilfe von einzelnen Oligosmoleküle (staple-strands). Die grundlegende Eigenschaft ist die spezifische Basenpaarung. Sie hybridisieren sequenzabschnitte und treiben die Formgebung an

Blindtest für die DNA-Nanotechnologie: Definition vorgegebener Zielstrukturen, Automatisiertes Design, Mischung aus Scaffold und Staples, Qualittsbewertung über Ausbeute und Form. So können Designsoftware verglichen werden und Standardprotokolle etabliert werden.

Die Strategie beruht auf biophysikalischen Kenntnissen: Die Prinzipien der Basenpaarung werden mit Faltmustern als Template genutzt. Das erlaubt präzise Vorhersagen.

ohne Rückgriff auf Strukturdaten oder Faltungsregeln, bzw Paarungsregeln

1. Frances Arnold: gerichtete Evolution von Enzymen

2. George Smith: Entwicklung des Phagendisplays

3. Gregory Winter: Entwicklung/Anwendung des Phagendisplays zur Selektion und Optimierung von Antikörpern

Hefedisplay verwendet eukaryotische Hefezellen, wodurch eine komplexe Proteinfaltung und Glykosylierung möglich sind. Phagendisplay basiert auf Bakteriophagen in prokaryotischen Wirten. Außerdem ist die Bibliotheksgröße beim Phagendisplay meist größer als beim Hefedisplay, sodass mehr Varianten gescreent werden können.

aus einer Bcell cDNA werden V Regionen zusammengesetzt, die variablen Ketten in Phagen oder Hefevektoren kloniert. Das Plasmid wird in Hefe oder Phagen dann exprimiert und Antikörperfragmente sezerniert. Das Antigen wird immobilisiert und Amplifiziert. Nach selektion der Klone werden die Plasmide sequenziert und in vektoren für die vollwertigen Antikörper subkloniert

1. natürlich: ausgehend von B zellen, nach somantisher Rekombination

2. synthetisch: ausgehend von Strukturanalyse und weiter DNA synthese, synthetische CDR repartoires

Displaytechniken basieren auf den gleichen Grundprinzipien wie die natürliche Evolution: Warlatior, Selektion und Amplifikation. Durch gezielte Mutagenese erzeugt man eine Bibliothek vielfältiger Molekülvarianten. Anschließend werden nur die besten Binder - also die „fittesten” Moleküle - ausgewählt und amplifiziert. Mehrere Runden dieses Kreislaufs führen zu optimierten Antikörpern oder Peptiden, in der natürlichen Evolution sind es die zufälligen Mutaionen, welche in Displaytechniken von gerichteter Mutagenese übernommen werden. Bindungsaffinitäten ersetzen natürliche selektion und die Vermehrung in Phagen oder Hefen simuliert die Reproduktion in Organismen. Displaytechniken benötogen ca Stunden bis Wochen, währen die Evolution bis zu Millionen Jahre braucht. Allerdings biten Displaytechniken nur eine begrenzte Anzahl an Bibliotheksgrößen

Directed Evolution ist ein laborbasiertes Verfahren zur gezielten Optimierung von Biomolekülen. Dabei werden in mehreren Zyklen künstlich erzeugte Varianten eines Gens oder Proteins erzeugt und anhand definierter Selektionskriterien die besten Kandidaten identifiziert und verstärkt, es wird zunächst eine Vielfalt erzeugt und dann selektioniert

jede randomisierte Aminosäureposition kann 20 Varianten erzeugen (es gibt 20 natürliche Aminosäuren)) somit kann man 6 Positionen randomisieren, da 7 schon 10^8 übersteigt

das heraussuchen von funktionalen Varianten, somit müssen screening Test gut eingestellt sein und die richtigen Selektionskriterien haben, damit die funktionalen Varianten selektioniert werden

aus einer Bcell cDNA werden V Regionen zusammengesettzt, die variablen Ketten in Phagen oder Hefevektoren kloniert. Das Plasmid wird in Hefe oder Phagen dann exprimiert und Antikörperfragmente sezermiert. Das Antigen wird immobilisiert und Amplifiziert. Nach selektion der Klone werden die Plasmide sequenziert und in vektoren für die vollwertigen Antikörper subkloniert

Neutralisierende Antikörper werden durch Display‑Panning gegen die RBD des Spike‑Proteins selektiert, kombiniert mit ACE2‑kompetitiver Selektion, sodass nur Antikörper angereichert werden, die die Spike‑ACE2‑Interaktion blockieren.

Die Ziel DNA wird in die Phage gebracht und Unterschiedliche Möglichkeiten der Kopienzahl des proteins an der Oberfläche werden variiert, so werden Peptide oder Proteine auf der Phagenoberfläche präsentiert. Die DNA ist im inneren der Phage. Somit werden Genotyp und Phenotyp miteinander gekoppelt. Phagen die binden werden amplifiziert. Ungebundene Phagen werden weggewaschen. Zum schluss wird die DNA der bindenden Phagen sequenziert

das Fusionsprotein wird mit Aga2p auf der Oberfläche der Hefe präsentiert. Dabei variieren die Varianten stark. Nicht bindende Hefen werden weggewaschen und bindende werden mit Hilfe von FACS sortiert und sequenziert. Ähnlich wie beim Phagendisplay sind Genotyp und Phenotyp gekoppelt

aus einer Bcell cDNA werden V Regionen zusammengesetzt, die variablen Ketten in Phagen oder Hefevektoren kloniert. Das Plasmid wird in Hefe oder Phagen dann exprimiert und Antikörperfragmente sezerniert. Das Antigen wird immobilisiert und Amplifiziert. Nach selektion der Klone werden die Plasmide sequenziert und in vektoren für die vollwertigen Antikörper subkloniert

• Übergangszustand berechnen — Der TS der gewünschten Reaktion wird quantenchemisch modelliert.

• TS‑Analog als „Ligand“ nutzen — Man entwirft ein Molekül/Modell, das den TS repräsentiert.

• Aktives Zentrum designen — Algorithmen platzieren Aminosäuren so, dass sie den TS optimal stabilisieren.

• Protein‑Gerüst auswählen — Das entworfene aktive Zentrum wird in passende Proteingerüste eingebaut.

• In‑silico‑Mutationen testen — Mutationen werden simuliert, um TS‑Bindung und Stabilität zu verbessern.

• Experimentell prüfen — Beste Designs werden exprimiert und getestet.

Bedeutung des Übergangszustands: Der Übergangszustand ist das zentrale Designziel, weil Enzyme Reaktionen beschleunigen, indem sie den TS stabilisieren. Deshalb wird beim Design gezielt ein aktives Zentrum konstruiert, das den TS besonders gut bindet.

1 Reaktion und Übergangszustand definieren

Die Zielreaktion wird verstanden und der Übergangszustand (TS) rechnerisch modelliert.

• TS‑Geometrie und Ladungsverteilung quantenchemisch berechnen

• TS dient als „Ligand“, den das Enzym später stabilisieren soll

2 Aktives Zentrum entwerfen

Aminosäuren werden so angeordnet, dass sie den TS optimal stabilisieren.

• Katalytische Gruppen positionieren

• Elektrostatische und geometrische Komplementarität zum TS erzeugen

3 Passendes Protein‑Gerüst auswählen

Das entworfene aktive Zentrum wird in stabile Proteingerüste eingebaut.

• Verschiedene Scaffolds testen

• Nur strukturell kompatible Gerüste weiterverwenden

4 In‑silico optimieren und experimentell testen

Mutationen werden simuliert und die besten Designs im Labor validiert.

• Mutationen zur TS‑Bindung und Stabilität berechnen

• Varianten exprimieren und Aktivität messen

• mRNA: kurzzeitige Überexpression einer injizierten mRNA, kurze Auswirkung da RNA instabil, keine transgene Linie, kleiner Eingriff, Vorteil ist die kurze Expression, was bedeutet, dass während der Entwicklung nur für kurze Zeit diese mRNA exprimiert wird und damit die Grundlage für Methoden wie CrisprCas9/ ZNF oder TLN bietet. Bei allen drei Methoden werden die Bestandteile als mRNA in den Embryo injiziert, somit können die Bestandteile exprimiert werden und ihrer Funktion nachgehen und so genetische Veränderungen bewirken, sie können so auch in die Keimbahn eingeführt werden und transgene Linien hergestellt werden. Allerdings sind nur 25% homozygot transgen.

• DNA: Einbringen eines DNA Stückes (Gens), Expression dieses Gens in einer transgenen Linie gewünscht, etwas aufwändiger, da erst in der F1 tansgen, dauerhafte Auswirkung auf den gesamten Organismus während der gesamten Entwicklung durch das Gen, dauert sehr lang. Als Beispiel für das injizieren einer DNA dient das GFP Gen mit bestimmten Modifikationen kann dies eine analytische Funktion über bestimmte Expression oder das Verhalten eines Zielgens in einem Modellorganismus haben. Im Falle eines knockins mit crisprcas9 liegt die Injektion einer DNA mit anderen Faktoren für eine knockin Mutante in ein Embryo zu Grunde.

• Morpholino: kurzzeitiger knockdown eines Gens, Oligo legt sich auf RNA, Veränderung der Translation über Block der Translation, Inhibition der miRNA maturation oder alternatives splicing, instabil daher nur kurze Auswirkung, keine transgene Linie, kleiner Eingriff, wenig aufwendig. Morpholino werden im Kontext des knockdowns verwendet. So benötigt man zunächst keinen aufwendig hergestellten knockout um einen gewissen ``Trend`` der Auswirkung des ``Verlusts`` eines Gens zu erkennen

• Zincfinger: zwei Moleküle die über Tripletts an beide Stränge der DNA binden, somit kann die Endonuklease Folk1 Dimerisieren und es wird ein Doppelstrangbruch durchgeführt, spezifität hoch, unzugängliche Gene können targetiert werden, sehr aufwendig, transgene Linie in F1, langfristiger Effekt des Verlusts eines Zielgens auf den gesamten Organismus während er gesamten Entwicklung, geringe flexibilität

• Talen: zwei Moleküle binden über Einzelnukleotide an beide Stränge der DNA, somit kann die Endonuklease Folk1 dimerisieren und ein Doppelstrangbruch kann durchgeführt werden, spezifität höher als bei Zincfinger durch Einzelnukleotide, unzugängliche Gene können targetiert werden, sehr aufwendig, transgene Linie in F1, langfristiger Effekt des Verlusts eines Zielgens auf den gesamten Organismus während er gesamten Entwicklung, geringe flexibilität aber etwas spezifischer für ein Zielgen als Zincfinger

• CrisprCAs9: Cas9 Protein bindet an guide RNA welche aus Einzelnukleotiden besteht, Im Zellkern bindet dann die guide RNA an der DNA, Cas9 führt einen Doppelstrangbruch durch, im Gegensatz zu Zincfinger/Talen unspezifisch, da Erkennungssequenz sehr kurz und nur auf einem Strang der DNA, sehr einfach von der Handhabung her, transgene Linie in F1, unkompliziert und es können auch Gene eingebracht werden, flexibel, schnell und unkompliziert aber unspezifisch

  
  

  Aufbauend auf diesen Methoden gibt es noch das creloxP System, welche die gerade genannten Methoden vorraussetzt. So kann creloxP durch vorhergehende transgene Linie eine weitere erstellen, indem es durch sein rekombinasebasiertes system das Zielgen mit lox Sites kennzeichnet (floxed), die Zellspezifische Crerekombinase dieses Gen raus schneidet, Transgene Linie in F1, kann Zellspezifisch angewendet werden, aufwendig, gut geeeignet für ortspezifische Untersuchungen, benötigt zwei Transgene Linie im Voraus, sehr aufwendig sber effektiv um Zellspezifisch zu arbeiten

• Morpholino: kurzzeitiger knockdown eines Gens, Oligo legt sich auf RNA, Veränderung der Translation über Blockder Translation, Inhibition der miRNA maturation oder alternatives splicing, instabil daher nur kurze Auswirkung, keine transgene Linie, kleiner Eingriff, wenig aufwendig. Morpholino werden im Kontext des knockdowns verwendet. So benötigt man zunächst keinen aufwendig hergestellten knockout um einen gewissen ``Trend`` der Auswirkung des ``Verlusts`` eines Gens zu erkennen CrisprCAs9: Cas9 Protein bindet an guide RNA welche aus Einzelnukleotiden besteht, Im Zellkern bindet dann die guide RNA an der DNA, Cas9 führt einen Doppelstrangbruch durch, im Gegensatz zu Zincfinger/Talen unspezifisch, da Erkennungssequenz sehr kurz und nur auf einem Strang der DNA, sehr einfach von der Handhabung her, transgene Linie in F1, unkompliziert und es können auch Gene eingebracht werden, flexibel, schnell und unkompliziert aber unspezifisch

  -> Morpholino verändert nur kurzzeitig die Expressionslevel des Zielgens, indem es die Translation verändert, somit muss nicht in das Genom eingegriffen werden. Die Methode ist unkompliziert, schnell und zeigt, wie sich der knockdown auf den Organismus auswirkt. Crisprcas9 stellt eine Transgene Linie her, indem es in das Genom des Individuums eindringt, somit kann eine transgene Linie hergestellt werden und die Auswirkung des Genverlusts oder auch den Gengewinns kann evaluiert werden. Die Methode ist zwar nicht so schnell und es dauert seine Zeit bis in F1 die transgenen Tiere hergestellt worden sind, es bringt aber einen größeren Einblick in die Auswirkung

• Morpholino/ CreloxP: Morpholino kann ein knockdown eines Zielgens erreichen, creloxP durch vorhergehende transgene Linie eine weitere erstellen, indem es durch sein rekombinasebasiertes system das Zielgen mit lox Sites kennzeichnet (floxed), die Zellspezifische Crerekombinase dieses Gen raus schneidet, Transgene Linie in F1, kann Zellspezifisch angewendet werden, aufwendig, gut geeeignet für ortspezifische Untersuchungen, benötigt zwei Transgene Linie im Voraus, sehr aufwendig aber effektiv um Zellspezifisch zu arbeiten. Morpholino ist einfacher, schneller und unkomplizierter als creloxP kann aber in der Analyse nicht so vielseitig eingesetzt werden. Durch den knockdown kann man nur gewisse Trends der Auswirkung des Verlusts eines Gens erkennen, CreloxP kann zusätzlich zu der Auswirkung auf den gesamten Organismus auch noch örtlich kontrolliert werden und somit die Auswirkung auch örtlich beschränken.

In situ Hybridisierung, FISH

knockdown: Morpholino: kuzfristige Repression der Tanslation einer RNA, kleiner Eingriff, wenig aufwendig und man braucht keine transgene Linie, kurzfristige Auswirkung auf den Organismus durch die verminderte Translation bzw Block der Translation und damit der Verlust der Funktion, spezifisch für ein Gen. Morpholino verändert nur kurzzeitig die Expressionslevel des Zielgens, indem es die Translation verändert, somit muss nicht in das Genom eingegriffen werden. Die Methode ist unkompliziert, schnell und zeigt, wie sich der knockdown auf den Organismus auswirkt.

knockout: viele verschiedene Möglichkeiten, oben beschrieben, transgene Linie nötig, aber Auswirkung auf das Gesamte Individuum, transgene Linie ermöglicht eine ganze Linie ohne dieses Gens, auch Auswirkung im späteren Zeitpunkt möglich, ortspezififtät möglich. Die Methoden sind zwar nicht so schnell und es dauert seine Zeit bis in F1 die transgenen Tiere hergestellt worden sind, es bringt aber einen größeren Einblick in die Auswirkung auf den gesamten Organismus. Zusätzlich kann man in einer Mutante weitere Methoden anwenden, die das Zielgen betreffen.

Transplantationsexperimente:

WT> Mutante: rescue? JA: Zellautonom/ NEIN: nicht Zellautonom

auch für verschiedene Regionen: bsp rescue in Endoderm aber nicht im Mesoderm: Zellautonom dort

Mutante> WT: rescue: JA: nicht zellautonom/ NEIN: Zellautonom

zunächst nimmt man eine notochordmutante, welche von natur aus eigentlich kein ela produziert. Anschließend kann man ela in Kombination mit dem im notochord exprimierten shh Gen einbringen. SHH ist ein SIgnalfaktor welcher beim Fisch die Expression von ela induziert. Somit wird ela in den Notochordmutanten trotzdem exprimiert. Wenn die Zellen nun zu der Mittellinie wandern, ist ela ausreichend für die Wanderung.

forward genetics: Fische mit mutagenen behandeln, bis ein gewünschter Phänotyp auftaucht, diesen dann sequenzieren, somit kennt man das Gen welches mit dem phänotypen in Verbindung gebracht werden kann.

In diesem Fall wnt2bb In situ hybridisierung, GFP oder Transplantationsexperimente

Morpholino: Eine wnt2bb Mutatnte, welche durch ein knockout hergestellt worden ist, wird mit einem wnt2 Morpholino behandelt. Morpholino ist ein Oligo, welches sich auf die mRNA setzt und somit enweder die Translation blockiert, ein alternatives splicing bewirkt oder die miRNA inhibiert. Dadurch, dass so das Genprodukt in niedrigerer Konzentration vorliegt und somit die Funktion eingeschränkt ist, kann evaluiert werden ob es durch wnt2 einen rescue der Leber gibt.

Heatshock: heatshockpromotor bewirkt die Aufrechterhaltung der Stabilität eines Proteins bei höheren Temperaturen. Wenn ein Gen daran gekoppelt ist, kann durch einen Hitzeschock die Expression dieses Gens gewährleistet werden. Wenn also ein hs promotor vor wnt2bb im WT geschalten ist, wird durch einen Hitzeschock wnt2 exprimiert aber wnt2bb bleibt unexprimiert. So kann evaluiert werden ob sich dadurch eine Leber bildet.

Bac: Axingen mit Venus-Pest ersetzen: Das Axingen ist zum einen ein Targetgen von TCF, welcher der Promotor bei der wnt SIgnalransduktion ist. ßCatenin bindet an TCF wenn wnt an frizzled bindet und ßcatenin nicht mehr durch den destructioncomplex stabilisiert und ubiquitiniert wird. Axin ist aber auch bestandteil des destructioncomplexes und hat eine negative feedbackfunktion bei übermäßger wnt Signaltransduktion. Wenn man nun das Axingen mit Venus-PEST ersetzt, kann in Echtzeit die Signaltransduktion nachgewiesen werden. Dabei ist Venus ist ein Reportegen und fluoresziert somit bei ßcatenin Bindung an TCF und hat somit eine Reporterfunktion bei wnt Signaltransduktion. PEST hat die Aufgabe die Halbwertszeit des Signals zu verkürzen, da es ein destabalizing Effekt hat. Das Ganze kann so in ein Zielorganismus gebracht werden, um während der Embryogenese die wnt SIgnaltransuktion nachzuweisen. Wenn man Venus-PEST nun mit einer gefloxten Stop-Kasette kombiniert, kann man Zellspezifisch die wnt Signaltransuktion mit dem creloxP System in Endothelzellen bsp nachweisen.

weiterer Nachweis: TCF binding sites vervielfachen ermöglicht die Überexpression der targetgene die unter dem TCF Promotor exprimiert werden. Eines davon ist GFP, welches über DNA eingefügt wird. Bei wnt Bindung an frizzled wird ßcatenin vom destructioncomplex gelöst und bindet an TCF, da hier mehr TCF vorhanden ist, kann auch mehr ßcatenin binden und somit die überexpression von GFP starten.Somit kann man bei der aktiven wnt Signaltransduktion ein fluoreszierendes Signal erhalten und somit die Aktivität der Signaltransuktion nachweisen. Wenn man davor eine Stopp-Kasette mit lox sites flankiert und einbaut, kann eine Zellspezifische cre die Stop kasette in Endothelzellen ausschneiden und so kann ortsspezifisch/ Zellspezifisch die wnt Signaltransduktion nachgewiesen werden.

Inhibition: Pharmakologisch: IWR stabilisiert den destruction-komplex, ßcatenin wird weiterhin ubiquitiniert auch bei der Bindung von wnt Signaltransduktion die targetgene werden nicht exprimiert. Wenn man so an verschiedenen Zeitpunkten der Embryogenese IWR zugibt, kann man sehen, wann die wnt Signaltransuktion wichtig für die Entwicklung ist oder wann nicht, so kann man erkennen, wan die Signaltransuktion aktiv ist.

genetisch: Der heatshockpromotor ermöglicht die zeitliche Kontrolle der Expression von targetgenen, in dem Fall das TCF Gen. Danach wird eine mit lox sites flankierte stop kasette und anschließend ein dominant negativer TCF mit GFP nachgeschalten. Durch den dnTCF wird der WT verdrängt und so bindet nur dieser Typ TCF an der DNA ohne ßcatenin zu binden, so wird die Signaltransduktion blockiert. Die zellspezifische crerekombinase ermöglicht das Ausschneiden der stopkasette in bestimmten Zellen und kann so örtlich kontrollieren wo dieser dnTCF exprimiert wird, dabei wird GFP an den dnTCF gekoppelt und so erhält man ein fluoreszenzsignal. Über den Hitzeschock kann man zeitlich kontrollieren wann die wnt Signaltransduktion so blockiert werden soll.

verdrängt WT Allele, weshalb keine homozygote gebraucht wird, Signaltransduktion wird blockiert ohne die vorherigen Funktionen einzuschränken

• heatshockpromotor: eigentlich zum Schutz vor Fieber, somit wird die stabilität der Proteine die nachgeschalten sind aufrechterhalten, somit kann man bei hs Promotor vor wnt zeitlich kontrollieren, wann dieses Gen angeschalten ist. Der heatshockpromotor ermöglicht somit die zeitliche Kontrolle der Expression von Targetgenen. Fehlbildungen zeigen den Effekt von wnt zu bestimmten Zeitpunkten

• Morpholino: Ein Oligo, das die Translation kurzzeitig blockiert und somit die Auswirkung des Verlust des Zielgens evaluiert werden kann. Fehlbildungen zeigen den Effekt von wnt zu besitmmten Zeitpunkten. Aber nur kurzzeitiger Block möglich.

• Transiente Überexpression: Plasmid, welches ein bestimmtes Gen trägt oder mRNA die ein bestimmtes Protein wird, somit kann eine Überexpression eine Aussage darüber treffen, wie das Gen den Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt beeinflusst

• Gal4/UAS: Gal4: Transkriptionsfaktor der an UAS Promotor bindet, örtliche Kontrolle über die Platzierung des Gal4/UAS. So wird der Gal4-Treiber an Zellspezifische Promotoren gekoppelt, welche die Expression in nur diesen Zellen ermöglichen und damit örtlich spezifsch wirken. Zeitliche Kontrolle funktioniert nur mit bestimmten weiteren Faktoren, wie zum Beispiel Hormone oder mit dem temperatursensitiven Gal4 Treiber.

• creloxP und stopkasette: Zielgen mit lox Sites gekennzeichnet (floxed), Zellspezifische Cre schneidet dieses Gen raus, Transgene Linie in F1, kann Zellspezifisch angewendet werden, aufwendig, gut geeeignet für ortspezifische Untersuchungen, benötigt zwei Transgene Linie im Voraus, sehr aufwendig aber effektiv um Zellspezifisch zu arbeiten mit einer Zellspezifischen cre kann eingebundene Stopkasette ausgebaut werden und das nachgehende Gen kann zellspezifisch exprimiert werden In Kombination mit einem

• heatshockpromotor: eigentlich zum Schutz vor Fieber, somit wird die stabilität der Proteine die nachgeschalten sind aufrechterhalten, somit kann man zeitlich kontrollieren, wann dieses Gen angeschalten ist. Der heatshockpromotor ermöglicht somit die zeitliche Kontrolle der Expression von Targetgenen. Die örtliche Kontrolle kann hier nur durch bestimmte Faktoren

Gal4/UAS: kontrollierte Gewebsspezifische Expression über längere Zeit, örtlich sehr spezifisch, wenn Gal4 Treiber unter Kontrolle von Zellspezifischen Promotoren ist, auch eine zeitliche Kontrolle ist möglich. Somit können zeitliche und örtliche spezifität kombiniert werden. heatshockpromotor: zeitlich kontrollierte Expression im Organismus, kurzfristige Expression, nur zeitliche Kontrolle möglich, örtliche Kontrolle nur in Kombination mit andern Faktoren

Axin-2 ist ein bestandteil des destructioncomplexes für ßcatenin, welches dies ubiquitiniert und abbaut, wenn wnt bindet, wird der destruction.complex instabil und ßcatenin bindet an TCF wodurch bestimmte proliferative und Wachstumsfördernde Gene exprimiert werden. Axin-2 ist aber auch eines davon, wenn zu viel Axin-2 exprimiert wird, stoppt die wnt Signaltransduktion, damit keine Wachstumsfaktoren aus dem Ruder laufen

Rezeptor, Liganden, Proteasen, Co Aktivatoren, Target Gene Rezeptoren und Liganden sind in der Membran verankert und binden aneinander. Dadurch wird der Ligand durch Exozytose nach oben gezogen, was bewirkt, dass ein Modul des Rezeptors abgespalten wird und bestimmte Transkriptionsfaktoren aktiviert. Rezeptor und Ligand sind beide in derselben Memran so hat jede Zelle Ligand und Rezeptor und kann entsprechend reagieren.

Sendende um Empfangende Zelle bilden ein Rezeptor aus, welcher Dimerisiert, somit ist eine bidirektionale Kommunikation ermöglicht

• wegen der Tol2 Elemente kann das Gen gesilenced werden, da Tol2 Elemente virale Elemente sind und daher schnell gesilenced werden als Schutzfunktion des Organismus

• Das Gen landet im heterochromatin und wird daher nicht exprimiert

• Das Gen landet an einer falschen Stelle und wird somit nicht oder woanders exprimiert

• transkriptionell: Veränderung über RNA-Sequencing nachweisbar

• translationell: Wenn keine Veränderung furch RNA-Sequencing dann Veränderung auf Proteinebene?

  
  

  ->In situ Hybridisierung

• Morpholino: knockdown bewirkt ein vermindertes Genprodukt oder blockiert die Translation gänzlich: so kann man Eph und Ephrin3b mit Morpholino blockieren und den phänotypen analysieren

• Gal4/UAS: dominant negativer Approach: somit wird der Eph/Ephrin-Signalweg blockiert, da über dominant negativ die Struktur geändert wird und somit die Dimerisierung nicht mehr funktioniert. Auch hier kann man den phänotypen dann auswerten. Gal4/UAS weil man das zellspezifisch in Hepatoblasten machen kann

• Wenn man die Konzentration von Eph umdreht, wandert es dann in die andere Richtung?

• in den linken LPM eine mRNA rein, die Eph3b überexprimiert und in den rechten LPM ein Morpholino der die Expression runterreguliert

Die Apelin-Rezeptoren Aplnra/b sind für die Migration von Angioblasten zur Mittellinie erforderlich.

Ja. Nur die Zellen mit ausgeschalteten Apelin-Rezeptoren zeigen einen Migrationsdefekt, während WT-Zellen in derselben Umgebung normal migrieren. Dies spricht für eine zellautonome Funktion der Apelin-Rezeptoren.

Der Cre-vermittelte Knockout liefert stärkere Evidenz, da er spezifischer ist und weniger anfällig für Off-Target-Effekte als ein Morpholino-Knockdown.

benigner Tumor: bleibt in senen Grenzen, hohe Zellteilungsrate, bleiben differenziert nicht invasiv, keine metastasenbildung, Zellproliferativ stark aktiv durch Dysregulation der Apoptosemechanismen

maligner Tumor: invasiv, metastasenbildung, besonders Apoptoseresistent, Immortalisiert, dringen in umliegendes Gewebe ein und verdrängen dieses, besonders unabhängig von normalen Wachstumsfaktoren, werden über Blut und Lymphkreislauf fortgeschwämmt

1. Invasion ins lokale Gewebe, Blutkreilauf (Adhäsionsmechanismen gehen verloren)

2. Wanderung durch Blut und Lymphkreilauf

3. Anlagerung an Blutgefäßwände

4. Immigration ins Zielgewebe, Durchdringen der Wände

5. Suchen einer Stammzellnische (Dedifferenzierung nötig, Tumor muss sich anpassen)

6. Kolonialisierung im neues Zielgewebe

target: CD44 Gen, Exon 6 wird exprimiert, Metastasen tragen auf bestimmten Zellen das CD44 Protein

target: Sialyl-Transferasen: Durch sie gelangen Tumorzellen durch die BBB deshalb unterstützt diese targetierung beim Kampf gegen Gehirnmetastasen, wird sonst auf Zellen im Gehirn exprimiert

1. X- Inaktivierung: In jeder Tumorzelle eines Verbandes ist das gleiche X Chromosom inaktiviert (normalerweise wird durch zufall eins der X Chromosomen der Frau inaktiviert weil die Menge eines X Chromosoms ausreichend ist)

2. Chromosomale Translokation: in jeder Tumorzelle eines Verbandes findet man die gleichen mutationen die das gesamte Chromosom betreffen (Translokation)

wenn eine einzige Mutation einen Tumor auslösen würde, würden wir nicht lange überleben, denn täglich mutieren viele Gene, zusätzliche Faktoren sind Karzinogene, ROS oder UV-Strahlung... in unseren Zellen gibt es Reparaturmechanismen, welche allerdings oftmals ungenau sind wenn diese Reparaturmechanismen aber nicht mehr ausreichen und sich sukkzessiv mehrere Mutationen in einer Linie von Vorläuferzellen angesammelt haben, kann ein Tumor entstehen

Normalerweise wird mit jeder Zellteilung die Enden der Telomere kürzer, in der Embryonalentwicklung bzw. Stammzellen, sowie Tumorzellen ist daher die Telomerase aktiv, weche dazu führt, dass es ein Template gibt, womit die Zellen das gesamte Genom kopieren. In malignen Tumorzellen ist die Telomerase noch aktiv, das geschieht indem die Zelle dedifferenziert vorliegt. Das bedeutet das bei jeder Teilung die Telomerase aktiv ist und somit die Zelle über as Hayflick-limit hinauswächst, sie ist also immortalisiert. Zellen inaktivieren checkpointkontrollen (Telomerase aktiv) replikative Seneszenz ist das Umgehen und Überspringen des Hayflick-limits in Tumorzellen. So sind sie immortalisiert.

Dass in einem Tumorverband es nur bestimmte Zellen gibt, die besonders tumorigen sind und die Fähigkeit haben sich unendlich zu teilen (TPC) und daraus weitere Tumorzellen entstehen. Wenn man diese Zellen targetiert müsste der Tumor absterben. Sie haben oft eine verminderte Stoffwechselaktivität und haben eine gewisse Möglichkeit schäden in der DNA zu reparieren (self renewal) Häufig sind das Zellen die aus dem Stammzelstadium nie hinausgewachsen sind, damit Immortalisiert sind und daher ihre Mutationen mitnehmen. Sie sind für die Bildung der Metastasen verantwortlich.

Tumorinitiator: initiative Mutationen die häuftig Onkogene oder Tumorsurpressorgene betreffen, die Abhängig von ihrem Abstand zueinander das Tumorrisiko erhöhen. Aus ihnen alleine kann ein Tumor entstehen. Sie schädigen die DNA

Tumorpromotor: Umwelteinflüsse wie zum Beispeil der Arbeitsplatz, chronische Entzündungen im Körper oder die Anhäufung von ROS an einer bestimmten Stelle, welche alle die Aktivität von pro-Proliferativen Faktoren unterstützen. Tumorpromotoren können alleine keinen Tumor auslösen. In Kombination bei zeitlich passendem Abstand erhöhen sie die Chance auf einen Tumor enorm. Keine DNA-Schädigung

Onkogene haben eine natürliche pro-proliferative Aktivität, welche bei Teilung oder Reparatur angeschaltet ist. Gerät durch ein mutiertes Allel jedoch die Balance ins kippen, haben Onkogene eine positive Wirkung auf Tumorzellen. (gain of function)

Tumorsupressorgene: Wirken hemmend auf das Zellwachstum nach Reparatur oder Teilung. Hier müssen beide Allele von einer Mutation betroffen sein, um sich positiv auf das Wachstum einer Tumorzelle auszuwirken (loss of function)

Als Transkriptionsaktivator wirkt es zusammen mit max. Hier werden CDK4 exprimiert, welche pro-proliferatorische Eigenschaften besitzt, was Zellwachstum und Zellproliferation fördert.

Als Transkriptionsrepressor wirkt cmyc in Kombination mit miz-1. Hierbei wird die Transkription von Cyclinkinaseinhibitoren CKI reprimiert, welche die natürliche anti-Proliferatorische Eigenschaft unterbricht, was Zellwachstum und Zellproliferation fördert. So werden durch die Transkriptionsaktivierende und Transkriptionsrepressive duale Wirkung des Onkogens cmyc die Zellproliferation gesteuert.

-> auf mehreren Wegen zur Progression durch den Zellzyklus/ Eintritt in die S-Phase

Rb: Durch dephosphorylierung wird Rb aktiviert. Hier setzt es sich auf ein Transkriptionsfaktor, wodurch

p16 nicht transkribiert wird und damit wird CDK gehemmt. So wirkt es hemmend auf den Zellzyklus indem die Zelle nicht in das S stadium eintritt.

p53: ist selbst ein Transkriptionsfaktor und ist im phosphorylierten Status aktiv: dadurch wird p21 transkribiert und CDK gehemmt. der outcome ist der gleiche: es kommt zum arrest des Zellzyklus

ruhende Zellen: Durch dephosphorylierung wird Rb aktiviert. Hier setzt es sich auf ein Transkriptionsfaktor, wodurch p16 nicht transkribiert wird und damit wird CDK gehemmt. So wirkt es hemmend auf den Zellzyklus indem die Zelle nicht in das S stadium eintritt.

proliferierende Zellen: Durch die phosphorylierung verliert Rb die Bindung an dem Transkriptionsfaktor und CDK wird nicht mehr gehemmt: So ist die Zelle proliferativ

Bei zu viel ROS, Hypoxie, DNA-Schäden,... führt p53 die Zelle in die Senescence oder Apoptose ->Apoptose: extrinsisch, intrinsisch. Extrinsisch über Rezeptoren auf der Oberfläche, intrinsisch über Faktoren im inneren der Zelle

Großhirn: zwei Hälften, Sinneswahrnehmung, Bewegungsansteuerung

Kleinhirn: Bewegungskontrollzentrum Hirnstamm: Vitalfunktionen

Rückenmark: Weitereleitung

Bulbus olfactorius: Riechkolben

Frontallappen: Ort des logischen Denkens, Persönlichkeit, planerischen Handelns

Parietallappen: räumliche Orientierung, Bewegungssteuerung

Temporallappen: akustische Informationsverarbeitung

Okzipitallappen: visuelle Informationsverarbeitung

Molekularschicht: ohne Somata, äußerste Schicht

Säuger: Neocortex: mindestens eine Schicht mit Pyramidenzellen die bis zur Molekularschicht reichen, er ist der jüngste Teil des Cortex. Im Menschen gibt es zusätzlicch noch Assoziationscortices, welche für Wünsche, Überzeugungen und Absichten stehen

Der Mensch hat durch das kochen der Nahrung einen viel größeren Nahrungsaufschluss erreichen können und somit auch eine größere Verfügung zu Energie um den Energiebedarf des Gehirns zu decken

Anfangs: Marginalzone und ventrikuläre Zone -> Fortsätze liegen in Richtung pialer Zone

-> Kern der Zelle wandert aus und landet in der Marginalzone um dort seine DNA zu verdoppeln

-> anschließend wandert sie wieder nach unten um sich zu teilen Vertikale Teilung: nach Teilung wieder Wanderung nach Marginalzone Horizontale Teilung: nach Teilung abwanderung der am weitest entfernten Zelle

-> Neuroblasten haften an Gliazellen und wandern dort entlang

-> nach horizontaler Teilung: Neuroblasten wandern entlang der Gliazellen

-> Schichten werden zeitlich verschoben aufgebaut.

-> Zunächst Subplatte, danach corticale Platte ( keine entscheidenden Neuronen )

-> Bildung der 6. Schicht, danach immer übereinander bis Schicht 1 die Marginalzone erreicht und diese dann verschwindet

-> Zwischenzone ist dann umhüllt von Lipiden: weiße Substanz

Zellen in der ventralen Mittellinie des Rückenmarks: Netrin -> Chemoattraktives Signal

Zellen der Mittellinie: Slit exprimiert Robo ->Chemorepulsives Signal

elektrische: bidirektional, schneller, elektrisches Signal über Ionen, lange Strecken (Reflexe)

chemisch: unidirektional, langsamer, Neurotransmitter, Umwandlung von elektrisch in chemisch in elektrisches Signal

aktive Zone -> bevorzugte synaptische Transmission, präsynaptische Membran und dichtes Netzwerk aus Proteinen (CAZ)

Präsynapse -> Verbindung der Ca 2+ Abhängigen Exo/ Endozytose mit synaptischen Vesikeln der aktiven Zone

Postsynapse -> postsynaptische Dichte: Rezeptoren an die Neurotransmitter binden Umwandlung in ein elektrisches Signal

Präsynapse -> Verbindung der Ca 2+ Abhängigen Exo/ Endozytose mit synaptischen Vesikeln der aktiven Zone -> Vesikel und Proteine

Postsynapse -> Präsynapse -> Verbindung der Ca 2+ Abhängigen Exo/ Endozytose mit synaptischen Vesikeln der aktiven Zone -> Neurotransmitterezeptoren

Hippocampus Synapse: Vesikelfreisetzung bei AP gekoppelt an die Frequenz des Signals, phasische freisetzung

Sinneszellen Synapse: dauerhafte Freisetzung, Information gekoppelt an die Intensität und damit wird die Menge der Freisetzung kontrolliert, tonische Freisetzung

symmetrische: wirkt inhibitorisch

asymmetrische: wirkt exzitatorisch, PSD stärker ausgeprägt

1. wachsendes Axon kommt in Kontakt mit Dendrit

-> Kontaktaufnahme über Zelladhäsionsproteine in Filopodien

2. Ausbildung des präsynaptischen Teils

-> Vesikel, Proteine die benötigt werden, aktive Zone synCAMPs triggern maturation

3. Ausbildung des postsynaptischen Teils

-> Ausbildung des PSD

Mitochondrien

Synaptische Vesikel

aktive Zone -> bevorzugte synaptische Transmission, präsynaptische Membran und dichtes Netzwerk aus Proteinen (CAZ)

Präsynapse -> Verbindung der Ca 2+ Abhängigen Exo/ Endozytose mit synaptischen Vesikeln der aktiven Zone

Postsynapse -> postsynaptische Dichte: Rezeptoren an die Neurotransmitter binden Umwandlung in ein elektrisches Signal

Glycin: inhibitorisch (Rückenmark)

Glutamat: exzitatorisch (Gehirn)

ACh: modulatorisch (Gehirn), excitatorisch (Muskel)

GABA: inhibitorisch (Gehirn)

Nor/Adrenalin: excitatorisch (Gehirn)

Glycin: Cl

Glutamat: Na, Ca

ACh: Na

GABA: Cl

Nor/Adrenalin: sc messenger

Ionotrop: (Ach, GABA, Glycin) binden an eine Pentamerstruktur, (Glutamat) bindet an eine Heterodimerstruktur welche sich dann öffnet, Natriumkanäle oder Chloridkanäle öffnen sich -> Zelle wird positiver bzw negativer -> excitatorisch (depolarisation) bzw inhibitorisch (hyperpolarisation)

Metabotrop: benötigen einen second messenger, Wirkung über Kaliumkanäle, G Protein gekoppelte Rezeptoren öffnen Kalium-Ionenkanäle -> G Protein löst sich und induziert zelluläre Botenstoffe

AMPA: Inonotrope Rezeptoren: schnelle Depolarisation durch öffnen der Na und K Kanäle, excitatorische Wirkung

NMDA: Metabotrope Rezeptoren: Erst bei mehrmaliger Bindung löst sich der Mg Block und Ca strömt ein, welches als sekundärer Botenstoff wirkt, welches wichtig für die synaptische Plastizität ist

Ein Prozess der die synaptischen Potentiale an der Postsynapse kombiniert

-> Neuronen im Muskel: eine große synaptische Endplatte: ein EPSP reicht aus, großes EPSP

-> Neuronen im ZNS: EPSP werden zunächst aufsummiert, Reaktion der Zelle abhängig von der Entfernung des EPSP vom Axonhügel, Signal muss zunächst wandern bis dort hin um weitergeleitet zu werden, ein inhibierendes Signal reicht aus, um das EPSP zu stoppen Es kann verschieden aufsummiert werden: über mehrmaliger kurz hinterienander wirkende Signale oder mehrere Signale an einem Dendrit gleichzeitig, somit ist die zeitliche Konstante ebenso wichtig wie die räumliche

LTP: langanhaltende wiederkehrende Stimulation führt zu einer Veränderung der synaptischen Aktivität und damit eine Verstärkung der Synapse

->langfristige Veränderung der synaptischen Aktivität bei anhaltender Reizung

-> Entstehung nur bei präsynaptischen Eingang und gleichzeitiger Depolarisation

-> In der CA1 Region des Hippocampus: Mg Block der Postsynapse wird aufgehoben, Ca strömt mit ein und verstärkt das nachfolgende Signal, somit wird die AMPA Rezeptordichte erhöht, welche die synaptische Effizienz erhöht, ausserdem werden Calmodulinkinase abhängige Transkriptionsfaktoren (CREB) aktiviert

LTD: langanhaltende Abschwächung der synaptischen Aktivität

-> niedrigfrequente Reizung, schwache depolarisation und präsynaptische Aktivität führend zu einem schwachen Anstieg von Ca in der Postsynapse und damit eine verringerung der AMPA Dichte

Abhängig von der Stärke der Rezeptoraktivierung und der postsynaptischen Ca Konzentration bzw der zeitlichen Abfolge der Aktivierung

Präsynaptisch: erhöhte Transmitterfreisetzung, Präsynaptische Proteine werden verstärkt exprimiert

Postsynaptisch: höhere Dichte der AMPA Rezeptoren, CREB Abhängige Gene werden exprimiert

Calmodulinkinase: daran bindet Ca, phosphorylierung der AMPA Rezeptoren (erhöhung der Permeabilität),

Calmodulinkinase II: Einbau von zusätzlichen AMPA Rezeptoren, Autophosphorylierung bietet eine verlängerte starke Aktivität der Synapse