Biologie

DNA-Abschnitte, die sich im Genom kopieren oder an eine andere Stelle verschieben können. Meist sind sie durch Methylierung stillgelegt. Wenn sie aktiv werden, können sie Gene stören oder als neue regulatorische Elemente dienen. Für Short-Read-Alignment sind sie schwierig, weil sie repetitiv sind.

Zielgerichteter Vorgang, um aus einem Gen mehrere Proteine erstellen zu koennen.

Ein Gen besteht aus Exons und Introns. Beim Spleißen werden die Introns entfernt. Dabei können Exons unterschiedlich kombiniert werden, zum Beispiel wird ein Exon übersprungen. So entstehen aus einem Gen mehrere mRNA-Varianten und damit verschiedene Proteine. Beim Menschen betrifft das über 90 % der Multi-Exon-Gene.

Transcriptomics misst, welche Gene in einer Probe wie stark exprimiert werden, meist per RNA-seq. Spatial heißt, dass zusätzlich der Ort im Gewebe erfasst wird: Man sieht nicht nur was exprimiert wird, sondern auch wo, etwa auf einem Gewebeschnitt.

Spatial Transcriptomics macht man an einem einzelnen Gewebeschnitt, einer hauchdünnen Scheibe von etwa 10 µm, zum Beispiel aus Gehirn oder einem Tumor. Man erhält Expressionswerte pro Position bzw. pro Zelle innerhalb dieses Schnitts, jeweils mit x/y-Koordinaten.

Die kombinierte Analyse mehrerer „-omics“-Ebenen derselben Probe, etwa Genom, Methylom, Transkriptom und Proteom. Das Ziel ist ein Gesamtbild.

Hier wird bestimmt, welche Spleißvarianten (Isoformen) eines Gens in welcher Menge vorliegen, statt nur die Gesamtexpression pro Gen zu messen.

Man vergleicht genetische Varianten (meist SNPs) über das ganze Genom zwischen vielen Individuen, zum Beispiel Kranken und Gesunden. Gesucht sind Varianten, die statistisch mit einem Merkmal assoziiert sind. Das zeigt eine Korrelation, keine Kausalität. Wegen der vielen Tests braucht man eine strenge Multiple-Testing-Korrektu

Man sequenziert die gesamte DNA einer Umweltprobe, etwa aus Darm, Boden oder Abwasser, ohne einzelne Organismen zu isolieren. Die Fragen sind, welche Mikroorganismen vorhanden sind und was sie funktionell können. Oft kommen dabei alignment-freie Methoden zum Einsatz.

T cells: Weiße Blutzellen des adaptiven Immunsystems.]

• T-Zellen sind Polizisten, die durch den Körper patrouillieren.

• Jeder Polizist hat einen Scanner (Rezeptor), der auf ein bestimmtes „Fahndungsbild“ reagiert, etwa ein Stück eines Virus. Passt das Bild, tötet die T-Zelle die verdächtige Zelle.

• Das Problem bei Krebs: Krebszellen sind körpereigene Zellen. Die Scanner der Polizisten erkennen sie oft nicht als Feind.

Die Therapie:

1. Dem Patienten wird Blut abgenommen und seine T-Zellen werden herausgefiltert.

2. Im Labor bekommen sie per Gentechnik einen neuen, künstlichen Scanner eingebaut. Dieser CAR ist auf ein Merkmal programmiert, das auf der Oberfläche der Krebszellen sitzt.

3. Die umgebauten Zellen werden millionenfach vermehrt und dem Patienten zurückgegeben.

4. Sie jagen jetzt gezielt die Krebszellen.

Microarray ist eigentlich keine Sequenzierung

Ein Microarray liest keine Sequenz. Es prüft nur, wie viel von bereits bekannten Sequenzen vorhanden ist. Das funktioniert über Hybridisierung an die Sonden, ausgelesen mit Fluoreszenz und einem Scanner. Sequenzierung dagegen liest die Basenabfolge Base für Base aus.

Die Sequenziermethoden im Überblick

1. Generation: Sanger

2. Generation: NGS / Short Read Das Prinzip ist Massive Parallelisierung: Millionen bis Milliarden Fragmente werden gleichzeitig gelesen.

• Illumina (Marktführer), Verfahren Sequencing by Synthesis

3. Generation: Long Read / Single Molecule Hier wird ein einzelnes Molekül direkt gelesen, ohne Vervielfältigung.

• PacBio (SMRT): Eine einzelne Polymerase sitzt in einem winzigen Loch und baut fluoreszierende Nukleotide ein. Jeder Einbau erzeugt einen Lichtblitz, der in Echtzeit gemessen wird. Im HiFi-Modus wird dasselbe ringförmige Molekül mehrmals gelesen, das ergibt sehr hohe Genauigkeit.

• Oxford Nanopore: Die DNA wird durch eine winzige Proteinpore in einer Membran gezogen. Jede Basenkombination in der Pore (etwa 5–9 Basen) verändert den elektrischen Strom charakteristisch. Ein neuronales Netz übersetzt das Stromsignal in Basen (Basecalling).

  
  

Gene:

Im engen Sinne (Kern des Gens) gehört dazu der Abschnitt, der transkribiert wird, also vom Transkriptionsstart bis zum Ende:

Exon1:[5'UTR|CDS]──Intron──Exon2:[CDS]──Intron──Exon3:[CDS|3'UTR]

Die coding sequence ist der Teil, der tatsächlich in Protein übersetzt wird. Sie reicht vom Start-Codon (ATG) bis zum Stop-Codon.

• Im Genom ist die CDS über mehrere Exons verteilt, dazwischen liegen Introns.

• Nach dem Spleißen liegt sie am Stück vor, und das Ribosom liest sie Codon für Codon.

Introns haben heutzutage keine Funktion mehr.

Regulatory elements:

Nicht-kodierende DNA-Abschnitte, die steuern, wann, wo und wie stark ein Gen abgelesen wird:

• Promotoren liegen direkt vor dem Gen.

• Enhancer und Silencer können weit entfernt liegen.

• Insulatoren grenzen Bereiche ab.

Proteine sind das resultat der gesamten Proteinbiosynthese. Jedes Protein besteht aus Aminosaeuren , welche wiederum aus jeweil 3 Nukleotiden (Codons) gebaut wird in der Translation.

Wie falten sich Proteine?

Die Faltung entsteht aus vielen schwachen Wechselwirkungen gleichzeitig:

1. Hydrophober Effekt (die Hauptkraft): Wasserabweisende Seitenketten „verstecken“ sich im Inneren des Proteins, weg vom Wasser der Zelle. Wasserfreundliche Seitenketten bleiben außen. Das ist wie Öltropfen in Wasser, die sich zusammenklumpen.

2. Wasserstoffbrücken im Rückgrat: Sie bilden wiederkehrende Grundmotive, die α-Helix (Spirale) und das β-Faltblatt (Zickzack-Stränge nebeneinander).

3. Ionische Bindungen: Positiv und negativ geladene Seitenketten ziehen sich an.

4. Disulfidbrücken: Zwei Cysteine verbinden sich über ihren Schwefel kovalent. Das ist ein fester „Tacker“, vor allem bei Proteinen außerhalb der Zelle.

„De novo“ ist Latein für „von Neuem“, im Sinne von ohne Vorlage / neu entstanden. Im Sequenzierkontext meist:

De novo Assembly: Das Genom wird allein aus den Reads rekonstruiert, ohne Referenzgenom. Man sucht überlappende Reads und setzt sie zusammen wie ein Puzzle ohne Vorlagebild (Graph-Algorithmen: Overlap-Graphen, De-Bruijn-Graphen).

Das Gegenteil ist Reference-based Alignment / Resequencing: Man hat bereits ein Referenzgenom und schaut nur, wo die Reads hinpassen und wo sie abweichen.

Proteinbiosynthese: Transkription + (Prozessierung) + Translation

DNA im Zellkern, Proteinbildung aber aussen an Zellen.

Transkription: RNA-Polymerase macht das meiste: Loest Bindung zwischen DNA Straengen auf. Danach laeuft sie am Antisense Strang lang. Liest Nukleotide ab und paart diese richtig mit anderen Nukleotiden in der Umgebung. Die Paarung ist pre-mRNA. Jedes Gen in der DNA wird hier durch Promotor eingeleitet und durch Terminator aufgehoert. Sobald RNA fertig: Polymerase und RNA trennen sich ab, DNA fuegt sich wieder zusammen.

Prozessierung (nur in Eukaryoten): Macht pre-mRNA zu mRNA

• Capping: mRNA bekommt G_mod, welches mRNA vor Abbau schuetzt und mRNA fertig fuer Translation

• Polyadenylierung: mRNA bekommt Schwanz aus Adeninen. Auch schutz vor Abbau

• Editing: Einzelne Basen an der mRNA werden veraendert -> Unterschiedliche Proteine fuer gleiche mRNA

• Spicen: Herausschneiden von Introns (sind nur Teil von DNA & mRNA aber nicht von Proteinen)

Translation: mRNA wird in ein Protein uebersetzt. Proteine sind lange Ketten von Aminosaeuren. Infos ueber Aminosaeuren: ursprl. in DNA, also auch in mRNA. 3 Basen in mRNA (Codon) -> Aminosaeure. Jedes Codon wird von Ribosomen mit tRNA gepaart, wobei tRNA dem komplemenaeren Codon mit der angehangenen Aminosaeure enspricht. Das Ribosom packt die Aminosaeuren zusammen, die tRNA loest sich von der mRNA

Die DNA ist sehr lang, muss aber in den kleinen Zellkern passen und ist daher zusammengepackt (geschlossenes Chromatin). Aber fuer die Transkription muss die DNA geoeffnet sein.

Jede Zelle hat dieselbe DNA, aber unterschiedliche Bereiche sind offen. Eine Leberzelle öffnet Leber-Gene, eine Nervenzelle Nerven-Gene. Das offene Chromatin ist also eine Art Fingerabdruck des Zelltyps

Transkript heißt jedes RNA-Molekül, das von der DNA abgelesen wurde. mRNA ist nur eine Sorte davon. Dazu kommen rRNA, tRNA, lncRNA und miRNA-Vorläufer (Bestandteile des Ribosoms, Adapter zwischen RNA und Protein sprache, …).

In der Bioinformatik meint „Transkript“ oft konkret eine Isoform, also eine bestimmte Exon-Kombination eines Gens. In Ensembl hat zum Beispiel ein Gen (ENSG…) mehrere Transkripte (ENST…).

Steuerung, ob, wann, wo und wie stark ein Gen in RNA umgeschrieben wird.

Wichtigste Ebene der Genexpressionskontrolle, weil sie ganz am Anfang ansetzt.

Die zentralen Ebenen:

• Cis-regulatorische Elemente: DNA-Sequenzen, die die Transkription steuern. Dazu gehören Promotoren, Enhancer, Silencer und Insulatoren.

• Trans-Faktoren: Transkriptionsfaktoren (TFs) binden sequenzspezifisch an Motive. Sie rekrutieren oder blockieren die RNA-Polymerase und wirken als Aktivatoren oder Repressoren.

  Er beeinflusst die Polymerase:

  • Aktivatoren holen die Polymerase und Helfer heran. Das Gen wird dann abgelesen.

  • Repressoren blockieren das. Das Gen bleibt aus.

• Chromatin / Epigenetik:

  • Zugänglichkeit: Offenes Chromatin (messbar mit ATAC-seq) ist Voraussetzung für die TF-Bindung.

  • Histonmodifikationen: H3K4me3 markiert aktive Promotoren, H3K27ac aktive Enhancer, H3K27me3 (Polycomb) und H3K9me3 wirken reprimierend.

  • DNA-Methylierung: Methylierte CpGs in Promotoren gehen meist mit Silencing einher, weil sie die Bindung mancher TFs blockieren oder MBD-Proteine rekrutieren. Methylierung im Genkörper korreliert dagegen eher positiv mit Expression.

• Polymerase-Dynamik

Für DNA reicht fast jede Zelle, denn das Genom ist überall gleich. Bei RNA ist entscheidend, welches Gewebe man nimmt, weil jedes Gewebe andere Gene exprimiert.

DNA-seq:

DNA-Abschnitte, die sich im Genom kopieren oder an eine andere Stelle verschieben können. Meist sind sie durch Methylierung stillgelegt. Wenn sie aktiv werden, können sie Gene stören oder als neue regulatorische Elemente dienen. Für Short-Read-Alignment sind sie schwierig, weil sie repetitiv sind.